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문제 정의
- 해산어류의 양식이 활발하게 전개되고 있는 국내외 정황으로 볼 때, 기존의 어류정자 냉동보존 연구결과들을 바탕으로 양식 대상 유용어류를 포함한 다양한 어종에 대한 비교 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 해산어류의 인공 종묘생산시 활용할 수 있는 정자의 냉동보존 기술을 확보하고자, 산업적으로 유용한 어류인 강도다리(Platichthys stellatus)를 대상으로 정자의 냉동보존을 위한 적정 희석액과 동해방지제를 구명하였다.
제안 방법
- 냉동보존 전과 후에 강도다리 정자의 내부 미세구조를 관찰하기 위하여 투과전자현미경용 표본을 제작하였다. 시료는 전 고정(pre-fixation)한 후 PBS로 10분간 세척한 다음, 1% osmium tetroxide (OsO4)로 4℃에서 2시간동안 후 고정(post-fixation)하였다.
- 냉동보존한 정액의 활성을 확인하기 위하여 20℃ 증류수에서 빠르게 융해시킨 후 정자의 활성을 측정하였다.
- Video-timer는 정자의 희석과 동시에 가동하여, 정자 운동이 종료할 때까지 video tape에 녹화하였다. 녹화된 tape를 모니터상에서 재생하면서 정자의 움직이는 속도와 비율을 측정하였다.
- , 1998). 저자 등은 이미 강도다리 정자의 냉장보존 연구에서 강도다리 정장 조성과 유사한 인공정장(ASP)을 만들어 냉장보존 효과를 검토한 바 있으며(Lim et al., 2006), 그 결과를 바탕으로 강도다리용 ASP를 본 냉동보존 연구에 사용하였다. 강도 다리 정자의 냉장보존 연구(Lim et al.
- 5 g)를 사용하였다. 정액을 얻기 위하여 실험어를 200 ppm 농도의 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS-222, Sigma, USA)에 마취시킨 다음 해수와 배설물에 오염되지 않도록 주의하며 복부를 여러번 가볍게 문질러 정액을 채취하였다. 채취된 정액은 1.
- 정자의 운동성을 평가하기 위하여 보존된 정액을 인공해수에 300배 희석하여 정자운동성 관찰용 slide glass (Teflon Printed Glass Slide; 21 wells; diameter of each well, 4 mm; Funakoshi Co., Japan) 위에 4 µL씩을 분주하여 cover slide 없이 운동성을 관찰하였다.
- 관찰부위가 정해진 시료는 70 nm 두께로 초박절하였다. 초박절된 절편은 uranylacetate와 lead citrate 용액으로 이중염색하여 투과형전자현미경(JEM 1200 E-XII, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 투과전자현미경으로 관찰된 정자에 대해서는 정자의 머리 크기와 미세구조, 편모의 구조 등과 냉동과 해동과정 중 입은 구조적 손상을 조사하였다.
- 초박절된 절편은 uranylacetate와 lead citrate 용액으로 이중염색하여 투과형전자현미경(JEM 1200 E-XII, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 투과전자현미경으로 관찰된 정자에 대해서는 정자의 머리 크기와 미세구조, 편모의 구조 등과 냉동과 해동과정 중 입은 구조적 손상을 조사하였다.
- 포매된 정자의 시료는 ultramicrotome에 의해 두께 0.5 µm로 semithin section한 다음, toluidine blue로 염색하여 관찰할 부위를 결정하였다.
대상 데이터
- 강도다리 정자의 냉동보존용 희석액으로는 강도다리의 정장조성을 바탕으로 제조한 인공정장(artificial seminal plasma, ASP)과 Stein’s solution (SS)을 이용하였으며(Lim et al., 2006), 동해방지제로는 dimethyl sulfoxide (DMSO), methanol, glycerol을 사용하였다.
- , Japan) 위에 4 µL씩을 분주하여 cover slide 없이 운동성을 관찰하였다. 운동성은 현미경(Axioskop 2 plus ZEISS, Germany)에 부착되어 있는 video camera와 video-timer가 있는 VHS video-recorder로 기록하였다. Video-timer는 정자의 희석과 동시에 가동하여, 정자 운동이 종료할 때까지 video tape에 녹화하였다.
- 정액채취를 위한 실험어는 국립수산과학원 양식연구본부와 동해특성화연구센터의 사육시스템에서 사육한 강도다리 24마리(체장 29.1±0.6 cm, 체중 623.6±26.5 g)를 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험 결과로부터 얻어진 모든 측정값들은 평균권±표준오차로 표시하였으며, 측정값들 사이의 유의차 유무는 SPSS-통계 패키지(version 11.5)를 사용하여 95%의 신뢰수준에서 ANOVA와 Tukey’s multiple range test로 검정하였다.
- 모든 실험은 3반복으로 실시하였으며, 한 시료 당 3회 측정하여 평균을 이용하였다. 각 실험 결과로부터 얻어진 모든 측정값들은 평균권±표준오차로 표시하였으며, 측정값들 사이의 유의차 유무는 SPSS-통계 패키지(version 11.
이론/모형
- 정액을 얻기 위하여 실험어를 200 ppm 농도의 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS-222, Sigma, USA)에 마취시킨 다음 해수와 배설물에 오염되지 않도록 주의하며 복부를 여러번 가볍게 문질러 정액을 채취하였다. 채취된 정액은 1.5 mL 튜브에 넣어 밀봉한 후 실험에 사용될 때까지 얼음을 채운 ice box에 보관하였고, Lim et al. (2006)의방법에 따라 실험 전 정자의 활성을 조사하여 활성이 높은 정자만 냉동보존 실험에 이용하였다.
성능/효과
- Methanol의 경우 10~20% 범위에서 유의한 차이를 보이지 않았지만 15%에서 가장 높은 값을 보였다. Glycerol을 동해방지제로 사용하였을 때는 첨가농도가 높아질수록 정자의 운동성과 운동속도가 낮아졌다. 희석액으로 SS를 사용한 경우도 ASP와 비슷한 결과를 보였다.
- Methanol의 경우 움직이는 정자의 비율은 15% 농도에서 가장 높았으며 운동속도는 10~20% 범위에서 유의한 차이를 보이지 않았지만 15%가 가장 높은 값을 보였다. Glycerol을 동해방지제로 사용하였을 때는 첨가농도가 높아질수록 정자의 운동성과 운동속도가 낮아지는 경향을 보여 15%와 20%에서는 동해방지제를 사용하지 않은 대조구와 같이 운동성을 관찰할 수 없었다.
- 동해방지제로 DMSO를 사용한 경우 움직이는 정자의 비율은 모든 농도에서 유의한 차이를 보이지 않았으나 10% 농도에서 최고값을 보였으며 운동속도 역시 10%에서 가장 빨랐다. Methanol의 경우 움직이는 정자의 비율은 15% 농도에서 가장 높았으며 운동속도는 10~20% 범위에서 유의한 차이를 보이지 않았지만 15%가 가장 높은 값을 보였다. Glycerol을 동해방지제로 사용하였을 때는 첨가농도가 높아질수록 정자의 운동성과 운동속도가 낮아지는 경향을 보여 15%와 20%에서는 동해방지제를 사용하지 않은 대조구와 같이 운동성을 관찰할 수 없었다.
- 1과 같다. 동해방지제로 DMSO를 사용한 경우 움직이는 정자의 비율은 모든 농도에서 유의한 차이를 보이지 않았으나 10% 농도에서 최고값을 보였으며 운동속도 역시 10%에서 가장 빨랐다. Methanol의 경우 움직이는 정자의 비율은 15% 농도에서 가장 높았으며 운동속도는 10~20% 범위에서 유의한 차이를 보이지 않았지만 15%가 가장 높은 값을 보였다.
- 냉동보존한 정자가 신선한 정자에 비하여 낮은 운동성과 수정률을 나타내는 원인을 밝히기 위하여, 냉동보존 과정 중에 일어날 수 있는 정자의 손상기구를 파악해야 한다. 본 연구에서 일부 냉동보존 정자는 냉동과 해동 과정에서 형태적 손상을 입었으며, 머리의 크기도 팽창되어 있었다. Gwo et al.
- 지금까지 동해방지제로서 DMSO, glycerol 및 methanol 등이 주로 사용되어 왔으나, 이것들은 어종별로 종 특이성을 나타내기 때문에, 모든 어류에 적용될 수 있는 단일한 동해방지제는 아직 없는 것으로 보인다. 본 연구에서는 강도다리 정자 보존을 위하여 동해방지제로 DMSO와 methanol을 사용하였을 때 glycerol을 이용한 경우보다 효과가 우수한 것으로 나타났다. Chang and Chang (2002)도 강도다리에서 10% DMSO를 사용하였을 때 정자의 구조적 손상이 감소하였다고 보고하였고, Saitoh (1996)는 문치가자미, 찰가자미, 참가자미, P.
- 희석액과 동해방지제로 각각 ASP와 DMSO를 사용하여 1년 동안 냉동보존한 후 해동한 강도다리(Platichthys stellatus) 정자의 운동속도는 10% 농도에서 가장 빨랐다. Methanol의 경우 10~20% 범위에서 유의한 차이를 보이지 않았지만 15%에서 가장 높은 값을 보였다.
후속연구
- 한편, Atlantic croaker (Micropogonias undulatus)(Gwo and Arnold, 1992)에서는 정자를 냉동 보존할 때 동해방지제로 DMSO를 사용함으로서 정자의 물리적 손상을 줄일 수 있는 것으로 밝혀지고 있다. 그러나 냉동에 의한 정자의 물리적 손상은 동해방지제의 첨가 유무뿐만 아니라 희석액의 조성, 냉동속도, 해동속도 등과 같은 요인들로부터도 영향을 받을 수 있으므로, 앞으로 이러한 요인들의 상호작용에 관하여 깊이있는 연구가 필요하겠다.
- 이와 같이 어류정자의 냉동보존기술이 많은 장점을 가지고 있고, 세계적으로 많은 나라에서 어류 정자의 냉동보존기술의 개발에 주력하고 있음에도 불구하고 한국에서는 아직 이 분야에 대한 관심과 연구가 미진한 상태이다. 그러므로 정자 냉동보존기술이 이미 의학이나 축산학 분야에서 활용되고 있는 것처럼 어류 정자의 냉동보존을 위한 정자의 기초 생리활성에 관한 연구와 함께 실제 종묘생산시 활용할 수 있는 기반기술의 확보가 우선되어야 할 것이다.
- 해산어류의 양식이 활발하게 전개되고 있는 국내외 정황으로 볼 때, 기존의 어류정자 냉동보존 연구결과들을 바탕으로 양식 대상 유용어류를 포함한 다양한 어종에 대한 비교 연구가 필요하다.
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