[논문]Vibrio tapetis의 검출을 위한 PCR specific primer의 제작

김영진; 이선이; 조효진; 유선녕; 김철민; 최용락; 박병근; 안순철

doi:10.5352/jls.2007.17.1.162

Vibrio tapetis의 검출을 위한 PCR specific primer의 제작
PCR Specific Primer for the Detection of Vibrio tapetis 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.17 no.1 = no.81, 2007년, pp.162 - 165

김영진 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실) , 이선이 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실) , 조효진 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실) , 유선녕 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실) , 김철민 (부산대학교 의과대학 생화학 교실) , 최용락 (동아대학교 생명자원과학대학 응용생명 공학부) , 박병근 ((재)바이오21센터) , 안순철 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학 교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Brown Ring Disease (BRD) is a bacterial disease caused by Vibrio tapetis which affects cultured clam Ruditapes philippinarum and causes heavy economic losses on Atlantic coasts of france, Spain and England. In this study, to evaluate the effective detection of the pathogen, specific primer set based on 16S ribosomal RNA (rRNA) sequences designed for rapid detection of V. tapetis. Polymerase chain reaction (PCR) with this primer set produced the specific band for each V. tapetis. The length of PCR product using designed primer set of Vbts-F and Vbts-R was about 400 bp. Therefore, these primers will be provided with a basic tool for rapid detection of V. tapetis in the various cases such as examination of imported aquatic products, diagnosis of aquatic organisms, and etc.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 최근 양식 바지락에 대해 병원성을 가진 것으로 보고되어 잠재적인 위험성을 내포하고 있는 V. tgpetis에 대해 먼저 관련 유사종들과의 염기서열 분석을 통한 특이 서열의 확인과 함께 이를 토대로 제작된 PCR spe cific primer의 효용성을 확인하고 이를 신속진단법 개발을 위한 기초자료로 이용하고자 한다.

제안 방법

1). 따라서 상기의 multiple alignment 자료를 토대로 Table 2와 같이 specific primer set를 디자인하여 (주)바이오니 아에 의 뢰하여 제작하였고, PCR을 수행할 경우, 약 400 bp 크기의 PCR 산물이 나올 것으로 예상하였다(Fig. 2).
또한 본 PCR primer의 재현성을 검 정 하기 위 해 V. tapetis 가 배양된 plate로부터 단일 colony를 따서 5 ㎕의 멸균 증류수에 넣어 현탁하고 95℃에서 5분간 열처리한 다음, 상기의 PCR 증폭과 동일한 조건으로 colony PCR을 실시하였다. 증폭된 PCR product들에 대해 1.
제작된 primer set를 이용하여 PCR을 수행하기 위해 우선 Marine broth 2216 (Difco, USA)에 접종하여 20℃에서 하룻밤 배양한 균체를 모은 다음, Genomic DNA extraction kit (K-3032, Bioneer, Korea)를 이용하여 PCR에 사용될 tem- plate를 준비하였는데, 그 과정은 다음과 같다. 먼저 200㎕의 PBS로 균체를 현탁한 후, 단백질 제거를 위해 20 ㎕ 의 protei nase K (25 mg/ml)와 200 ㎕의 binding buffer를 첨가하여 혼합한 반응액을 filter tube에 옮긴 다음, 원심분리 (12, 000 rpm, 1 min.
)하여 DNA만을 회수하였다. 준비된 DNA의 PCR 증폭반응을 위해 100 pM 의 각 primer, 0.2 mM dNTPs, 1 U Taq DNA polymerase, 2.5 mM Mg Ck가 포함된 혼합물에 template DNA 1 ㎕를 첨가한 총 20 ㎕의 PCR reaction mixture를 GeneAmp 2400 (Perkin Elmer co., USA)에 넣어 95℃에서 1 분, 54℃ 에서 1분, 그리고 72℃ 에서 1분간 30 cycle을 반복하는 조건으로 증폭시켰고, 증폭된 PCR product들은 모두 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 확인하였다. 증폭된 PCR product들을 확인한 결과, V.

대상 데이터

우선 본 연구에 사용된 V. alginolyticus, V. anguillarum, V. harueyi, V. hollisae, V. parahaemolyticus, V. splendidus, V. tape tis 등은 표준균주은행 (American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하여 사용하였으며(Table 1), specific pri mer set의 제작을 위한 기초자료로 사용될 Vibrio 속 세균들의 16S rRNA에 대한 염기서열은 GenBank (NCBI, US 시에 등재된 자료를 이용하였고, 이를 Clustal W (EMBL-EBI, UK) 를 이용한 multiple alignment를 통해 가장 변이가 많은 특이서열을 검색하였다. 그 결과, 본 연구에 사용된 Vibrio 속 세균들 상호간의 16S rRNA의 유전적 유사도는 모두 90~ 95% 정도였지만, 특이적으로 앞부분에 해당되는 1〜90 bp와 450-470 bp 영역에서는 비교적 낮은 상동성을 나타내었다 (Fig.

성능/효과

tape tis 등은 표준균주은행 (American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하여 사용하였으며(Table 1), specific pri mer set의 제작을 위한 기초자료로 사용될 Vibrio 속 세균들의 16S rRNA에 대한 염기서열은 GenBank (NCBI, US 시에 등재된 자료를 이용하였고, 이를 Clustal W (EMBL-EBI, UK) 를 이용한 multiple alignment를 통해 가장 변이가 많은 특이서열을 검색하였다. 그 결과, 본 연구에 사용된 Vibrio 속 세균들 상호간의 16S rRNA의 유전적 유사도는 모두 90~ 95% 정도였지만, 특이적으로 앞부분에 해당되는 1〜90 bp와 450-470 bp 영역에서는 비교적 낮은 상동성을 나타내었다 (Fig. 1). 따라서 상기의 multiple alignment 자료를 토대로 Table 2와 같이 specific primer set를 디자인하여 (주)바이오니 아에 의 뢰하여 제작하였고, PCR을 수행할 경우, 약 400 bp 크기의 PCR 산물이 나올 것으로 예상하였다(Fig.
tapetis 가 배양된 plate로부터 단일 colony를 따서 5 ㎕의 멸균 증류수에 넣어 현탁하고 95℃에서 5분간 열처리한 다음, 상기의 PCR 증폭과 동일한 조건으로 colony PCR을 실시하였다. 증폭된 PCR product들에 대해 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 실시한 결과, 모두 400 bp 크기의 특이 밴드를 확인할 수 있었다(Fig. 4).
5% agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 확인하였다. 증폭된 PCR product들을 확인한 결과, V. tapetis에 대해서만 예상되었던 400 bp 크기의 특이 밴드가 검출되었을 뿐 다른 종들에 대해서는 전혀 다른 크기의 non-specific band가 생기거나 또는 product가 전혀 생성되지 않는 것으로 보아 본 연구를 통해 제작된 PCR primer의 특이성을 확인할 수 있었으며(Fig. 3), 증폭된 PCR product 에 대해 염기서열분석을 실시한 결과, primer 제작 시 기초자료로 이용한 V. tapetis 16S rRNA sequence (accession no. AY129278)와 100% 동일함을 확인하였다(data not shown).

후속연구

tapetis의 신속 진단에 활용할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 16S rRNA는 계통발생학적으로 근연한 종간에는 그 유전적 다양성이 부족하다고 알려져 있으몌9], 계속적인 신종 비브리오균의 추가로 인해 본 연구에서 개발된 primer의 특이성도 한계가 있을 것으로 판단되어 추후 연구를 통해 16S-23S rRNA ISR이나 다양한 tRNA[6], 그리 고 tet[11]와 aroA[1이 같은 특이유전자 영 역을 이용한 종 특이 marker의 개발이 계속되어야 할 것이다.
따라서 본 연구에서는 최근 세균 동정에 가장 많이 활용되고 있는 기법 중 하나인 16S rRNA를 이용한 종 동정을 통해 그 특이성을 확인하였으므로 V. tapetis의 신속 진단에 활용할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 16S rRNA는 계통발생학적으로 근연한 종간에는 그 유전적 다양성이 부족하다고 알려져 있으몌9], 계속적인 신종 비브리오균의 추가로 인해 본 연구에서 개발된 primer의 특이성도 한계가 있을 것으로 판단되어 추후 연구를 통해 16S-23S rRNA ISR이나 다양한 tRNA[6], 그리 고 tet[11]와 aroA[1이 같은 특이유전자 영 역을 이용한 종 특이 marker의 개발이 계속되어야 할 것이다.
현실적인 어려움이 많다. 특히, 본 연구의 재료로 사용된 V. tapetis의 경우에는 까다로운 배양조건과 함께 생화학적 특성에 있어서도 일반 해수세균인 V. splendidus와 유사한 점이 많아[기 추후 수입 수산물의 검사나 양식 수산물의 질병 발생 시, 많은 어려움이 예상된다.

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