[논문]일반 프라이머를 이용한 PCR의 식품원료 진위 판별에 적용

박용춘; 진상욱; 임지영; 김규헌; 이재황; 조태용; 이화정; 한상배; 이상재; 이광호; 윤혜성

doi:10.13103/jfhs.2012.27.3.317

일반 프라이머를 이용한 PCR의 식품원료 진위 판별에 적용
Application for Identification of Food Raw Materials by PCR using Universal Primer 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.27 no.3, 2012년, pp.317 - 324

초록
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본 연구는 식품원료의 진위여부를 판별하기 위한 시험법으로 일반 프라이머를 이용한 DNA barcode 기법을 도입하였다. 동물성식품원료의 경우 미토콘드리아 DNA 중 cytochrome oxidase subunit I(COI) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2)와 cytochrome b(cyt b) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(L14724/H15915)를 사용하였다. 상기 3 종류의 프라이머를 사용하여 가축류 6종(소, 돼지, 염소, 양, 말 및 사슴), 가금류 4종(닭, 오리, 칠면조 및 타조), 어류 7종(명태, 대구, 청대구, 청어, 송어, 다랑어 및 우럭)을 대상으로 PCR 후 전기영동하여 예상되는 PCR 산물의 생성 유무를 확인하였다. 가축류 6종에 대하여는 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/H15915 프라이머를 사용한 경우 COI 및 cyt b가 모두 검출되었으며, 가금류 4종은 LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우만 COI이 검출되었다. 또한 어류 7종은 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우에만 COI 부위가 검출됨을 확인하였다. 식물의 경우 엽록체 DNA 부위를 이용하여 디자인된 3 종류의 프라이머(trnH/psbA, rpoB 1F/4R 및 rbcL 1F/724R)를 사용하였다. 각각의 프라이머를 이용하여 식물 5종(마늘, 양파, 무, 녹차 및 시금치)에 대하여 실험한 결과 3종류의 프라이머에서 PCR의 산물을 모두 확인하였으며 trnH/psbA 프라이머의 경우 식물 종마다 PCR 산물의 크기는 다르게 검출되었다. 본 연구에서는 17종의 식품원료별 일반 프라이머 및 PCR 조건을 확립하였으며, 생산된 PCR 산물을 대상으로 염기서열을 결정하고 유전자은행에 있는 염기서열과 DB 비교 분석을 통하여 식품에 사용된 원료의 진위여부 판별에 적용이 가능할 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In order to determine an authenticity of food ingredient, we used DNA barcode method by universal primers. For identification of animal food ingredients, LCO1490/HCO2198 and VF2/FISH R2 designed for amplifying cytochrome c oxidase subunit1 (CO1) region and L14724/H15915 for cytochrome b (cyt b) region on mitochondrial DNA were used. Livestock (cow, pig, goat, sheep, a horse and deer) was amplified by LCO1490/HCO 2198, VF2/FISH R2 and L14724/H15915 primers. Poultry (chicken, duck, turkey and ostrich) was amplified by LCO1490/HCO 2198 and VF2/FISH R2 primers. But, Fishes (walleye pollack, herring, codfish, blue codfish, trout, tuna and rockfish) were only amplified by VF2/FISH R2 primers. For plant food ingredients, 3 types of primers (trnH/psbA, rpoB 1F/4R and rbcL 1F/724R) have been used an intergenic spacer, a RNA polymerase beta subunit and a ribulose bisphosphate carboxylase region on plastid, respectively. Garlic, onion, radish, green tea and spinach were amplified by trnH/psbA, rpoB 1F/4R and rbcL 1F/724R. The PCR product sizes were same by rpoB 1F/4R and rbcL 1F/724R but, the PCR product size using trnH/psbA primer was different with others for plants each. We established PCR condition and universal primer selection for 17 item's raw materials for foods and determine base sequences aim to PCR products in this study. This study can apply to determine an authenticity of foods through making an comparison between databases and base sequences in gene bank. Therefore, DNA barcode method using universal primers can be a useful for species identification techniques not only raw materials but also processed foods that are difficult to analyze by chemical analysis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 일반 프라이머를 이용한 유전자 분석법을 통해 가공식품에 사용된 식품원료의 진위여부를 판별할 수 있는 가능성을 제시하였으며 식품원료별 사용가능한 최적의 프라이머와 PCR 조건을 확립하였다. 또한 본 연구에서 확립된 시험법은 식품 중 발견되는 생물체의 이물동정법에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
일반 프라이머를 이용한 동물성 식품원료의 확인 본 연구에서는 일반 프라이머를 이용하여 식품원료의 진위여부를 확인하고자 하였다. 동물성 식품원료의 경우 사용된 DNA barcode 부위는 cytochrome C oxidase subunit 1(CO1)부위를 대상으로 한 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 프라이머 및 cytochrome b 부위를 대상으로 한 L14724/ H15915를 이용하였다.

제안 방법

PCR을 위한 반응액의 조성은 주형 DNA 50 ng, dNTPs 200 µM, MgCl2 2.5 mM, 프라이머 각 0.5 µM이 되게 혼합하였으며 최종 용량은 20 µL로 하였다.
국내·외 언론보도 등으로부터 가짜식품의 유통사례 및 다소비 식품에 대한 정보를 취합하고 유전자분석법으로 진위판별이 필요한 목록을 작성하였다.
동물성식품원료의 경우 미토콘드리아 DNA 중 cytochrome oxidase subunit I(COI) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2)와 cytochrome b(cyt b) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(L14724/H15915)를 사용하였다. 상기 3 종류의 프라이머를 사용하여 가축류 6종(소, 돼지, 염소, 양, 말 및 사슴), 가금류 4종(닭, 오리, 칠면조 및 타조), 어류 7종(명태, 대구, 청대구, 청어, 송어, 다랑어 및 우럭)을 대상으로 PCR 후 전기영동하여 예상되는 PCR 산물의 생성 유무를 확인하였다. 가축류 6종에 대하여는 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/H15915 프라이머를 사용한 경우 COI 및 cyt b가 모두 검출되었으며, 가금류 4종은 LCO1490/ HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우만 COI이 검출되었다.
유전자추출은 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 및 DNeasy Plant mini kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다.
대상유전자 별로 사용된 프라이머별 반응조건은 재결합 온도만 달리하였다. 재결합온도 결정은 40℃~60℃사이에서 5℃씩 변화를 주어(40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃) 1차적으로 PCR 산물의 결과를 확인하고 증폭이 확인된 온도에서 다시 1℃씩 변화시키면서 최적의 재결합 온도를 결정하였다. 사용된 5종의 시료는 3종류의 프라이머에서 모두 증폭됨을 확인하였으며 최적의 재결합 온도는 trnH/psbA 프라이머는 53℃, rpoB 1F/4R 프라이머는 55℃, rbcL 1F724R 프라이머는 48℃로 확인되었다(Fig.
최종산물의 확인은 반응액 5 µl를 취하여 아가로즈 젤로 100V, 30분간 전기영동하고 EtBr로 염색(1 µg/ml)한 후 UV 투영기를 이용하여 확인하였다.
가축류, 가금류 및 어류는 DNeasy Blood & Tissue kit를 사용하여 유전자를 추출하였으며, 식물류는 DNeasy Plant mini kit를 사용하였다. 추출방법은 제조사에서 제공하는 추출법에 의거하여 추출하였으며, 최종 용출단계에서는 AE 완충용액 대신 멸균증류수를 사용하여 용출하였다.

대상 데이터

가축류, 가금류 및 어류는 DNeasy Blood & Tissue kit를 사용하여 유전자를 추출하였으며, 식물류는 DNeasy Plant mini kit를 사용하였다.
5 µM이 되게 혼합하였으며 최종 용량은 20 µL로 하였다. 가축류, 가금류 및 어류는 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/ H15915 프라이머, 식물류는 trnH/psbA, rpoB 1F/4R 및 rbcL 1F/724R 프라이머를 사용하였으며 반응조건은 Table 2에 명시하였다.
국내·외 언론보도 등으로부터 가짜식품의 유통사례 및 다소비 식품에 대한 정보를 취합하고 유전자분석법으로 진위판별이 필요한 목록을 작성하였다. 가축의 경우 소, 돼지, 양, 염소, 말, 사슴 등 6종, 가금류의 경우 오리, 닭, 타조, 칠면조 등 4종, 어류의 경우 청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어, 우럭 등 7종, 식물의 경우 마늘, 양파, 무, 녹차, 시금치 등 5종을 선정하였다.
유전자추출은 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 및 DNeasy Plant mini kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다. 검체로 사용된 청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어, 우럭은 대형마트와 수산시장에서 소, 돼지, 양, 염소, 말, 오리, 닭, 타조, 칠면조는 대형마트 또는 사육농장에서, 마늘, 양파, 무, 녹차, 시금치는 재래시장에서 구입하여 사용하였다.
일반 프라이머를 이용한 동물성 식품원료의 확인 본 연구에서는 일반 프라이머를 이용하여 식품원료의 진위여부를 확인하고자 하였다. 동물성 식품원료의 경우 사용된 DNA barcode 부위는 cytochrome C oxidase subunit 1(CO1)부위를 대상으로 한 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 프라이머 및 cytochrome b 부위를 대상으로 한 L14724/ H15915를 이용하였다. 식품원료는 가축류 6종(소, 돼지, 양, 염소, 말 및 사슴), 가금류 4종(오리, 닭, 타조 및 칠면조) 및 어류 7종(청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어 및 우럭)을 대상으로 상기3 종류의 프라이머를 이용하여 DNA 증폭을 유무를 확인하였다.
본 연구는 식품원료의 진위여부를 판별하기 위한 시험법으로 일반 프라이머를 이용한 DNA barcode 기법을 도입하였다. 동물성식품원료의 경우 미토콘드리아 DNA 중 cytochrome oxidase subunit I(COI) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2)와 cytochrome b(cyt b) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(L14724/H15915)를 사용하였다. 상기 3 종류의 프라이머를 사용하여 가축류 6종(소, 돼지, 염소, 양, 말 및 사슴), 가금류 4종(닭, 오리, 칠면조 및 타조), 어류 7종(명태, 대구, 청대구, 청어, 송어, 다랑어 및 우럭)을 대상으로 PCR 후 전기영동하여 예상되는 PCR 산물의 생성 유무를 확인하였다.
선발된 식물성 식품원료는 마늘, 양파, 녹차, 시금치 및 무 등 총 5종이다. 사용된 유전자 부위는 3종류(trnH-psbA, rpo B, rbc L)이며 모두 엽록체 유전자를 대상으로 하였다. 대상유전자 별로 사용된 프라이머별 반응조건은 재결합 온도만 달리하였다.
선발된 식물성 식품원료는 마늘, 양파, 녹차, 시금치 및 무 등 총 5종이다. 사용된 유전자 부위는 3종류(trnH-psbA, rpo B, rbc L)이며 모두 엽록체 유전자를 대상으로 하였다.
동물성 식품원료의 경우 사용된 DNA barcode 부위는 cytochrome C oxidase subunit 1(CO1)부위를 대상으로 한 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 프라이머 및 cytochrome b 부위를 대상으로 한 L14724/ H15915를 이용하였다. 식품원료는 가축류 6종(소, 돼지, 양, 염소, 말 및 사슴), 가금류 4종(오리, 닭, 타조 및 칠면조) 및 어류 7종(청어, 명태, 대구, 청대구, 송어, 다랑어 및 우럭)을 대상으로 상기3 종류의 프라이머를 이용하여 DNA 증폭을 유무를 확인하였다. 가축류의 경우 3 종류의 프라이머(LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/H15915)에서 모두 증폭이 확인되었다.
유전자증폭(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 프라이머 및 Taq DNA polymerase는 바이오니아(Bioneer, 대한민국)에 의뢰하여 합성 또는 구매하였으며, PCR 장비는 GeneAmpTM PCR System 9700(Applied Biosystems, USA) 을 사용하였다. 유전자추출은 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 및 DNeasy Plant mini kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다.

이론/모형

본 연구는 식품원료의 진위여부를 판별하기 위한 시험법으로 일반 프라이머를 이용한 DNA barcode 기법을 도입하였다. 동물성식품원료의 경우 미토콘드리아 DNA 중 cytochrome oxidase subunit I(COI) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(LCO1490/HCO2198 및 VF2/FISH R2)와 cytochrome b(cyt b) 부위 검출을 위하여 디자인된 프라이머(L14724/H15915)를 사용하였다.

성능/효과

상기 3 종류의 프라이머를 사용하여 가축류 6종(소, 돼지, 염소, 양, 말 및 사슴), 가금류 4종(닭, 오리, 칠면조 및 타조), 어류 7종(명태, 대구, 청대구, 청어, 송어, 다랑어 및 우럭)을 대상으로 PCR 후 전기영동하여 예상되는 PCR 산물의 생성 유무를 확인하였다. 가축류 6종에 대하여는 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/H15915 프라이머를 사용한 경우 COI 및 cyt b가 모두 검출되었으며, 가금류 4종은 LCO1490/ HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우만 COI이 검출되었다. 또한 어류 7종은 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우에만 COI 부위가 검출됨을 확인하였다.
식물의 경우 엽록체 DNA 부위를 이용하여 디자인된 3 종류의 프라이머(trnH/psbA, rpoB 1F/4R 및 rbcL 1F/724R)를 사용하였다. 각각의 프라이머를 이용하여 식물 5종(마늘, 양파, 무, 녹차 및 시금치)에 대하여 실험한 결과 3종류의 프라이머에서 PCR의 산물을 모두 확인하였으며 trnH/psbA 프라이머의 경우 식물 종마다 PCR 산물의 크기는 다르게 검출되었다. 본 연구에서는 17종의 식품원료별 일반 프라이머 및 PCR 조건을 확립하였으며, 생산된 PCR 산물을 대상으로 염기서열을 결정하고 유전자은행에 있는 염기서열과 DB 비교·분석을 통하여 식품에 사용된 원료의 진위여부 판별에 적용이 가능할 것으로 기대된다.
가축류 6종에 대하여는 LCO1490/HCO2198, VF2/FISH R2 및 L14724/H15915 프라이머를 사용한 경우 COI 및 cyt b가 모두 검출되었으며, 가금류 4종은 LCO1490/ HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우만 COI이 검출되었다. 또한 어류 7종은 VF2/FISH R2 프라이머를 사용한 경우에만 COI 부위가 검출됨을 확인하였다. 식물의 경우 엽록체 DNA 부위를 이용하여 디자인된 3 종류의 프라이머(trnH/psbA, rpoB 1F/4R 및 rbcL 1F/724R)를 사용하였다.
동물의 종 감별에는 핵 DNA보다 mtDNA가 종 특이성, 신뢰성 및 재현성이 높은 것으로 알려져 있다¹⁸⁾. 또한 일반적으로 특정 염기서열의 복제수가 매우 낮은 핵 DNA와는 달리 세포 당 미토콘드리아 수가 많고 각 미토콘드리아는 다수의 mtDNA를 갖고 있어 종 특이적 미토콘드리아 DNA 염기서열을 이용한 PCR 분석은 종 판별에 매우 효과적인 방법으로 알려졌다. 식물의 경우 유전학적으로 잘 보존되어 있다고 알려진 엽록체상 부위인 matK, rbcL, rpoC1, psbA-trnH, rpoB, ndh J, acc D(Fig.
4). 또한, rpoB 1F/4R 및 rbcL 1F/724R 프라이머를 이용한 경우 시료별로 증폭산물의 크기가 일정하게 확인되었지만 trnH-psbA 프라이머에서는 증폭산물의 크기가 시료별로 차이가 있었다.
재결합온도 결정은 40℃~60℃사이에서 5℃씩 변화를 주어(40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃) 1차적으로 PCR 산물의 결과를 확인하고 증폭이 확인된 온도에서 다시 1℃씩 변화시키면서 최적의 재결합 온도를 결정하였다. 사용된 5종의 시료는 3종류의 프라이머에서 모두 증폭됨을 확인하였으며 최적의 재결합 온도는 trnH/psbA 프라이머는 53℃, rpoB 1F/4R 프라이머는 55℃, rbcL 1F724R 프라이머는 48℃로 확인되었다(Fig. 4). 또한, rpoB 1F/4R 및 rbcL 1F/724R 프라이머를 이용한 경우 시료별로 증폭산물의 크기가 일정하게 확인되었지만 trnH-psbA 프라이머에서는 증폭산물의 크기가 시료별로 차이가 있었다.
최적의 재결합 온도는 가축류와 동일하게 LCO1490/HCO2198 프라이머에서 40℃, VF2/FISH R2 프라이머에서 50℃로 확인되었다. 어류의 경우 VF2/FISH R2프라이머를 이용한 경우에 한하여 CO1 부위의 증폭을 확인하였으며, 청어, 명태, 청대구 및 송어는 40℃에서, 대구, 다랑어 및 우럭은 55℃의 재결합 온도에서 가장 적합한 것으로 확인되었다(Fig. 3).
가금류의 경우 LCO1490/ HCO2198 및 VF2/FISH R2 프라이머에서는 증폭이 확인되었지만 L14724/H15915 프라이머를 사용한 경우에는 증폭 되지 않았다. 최적의 재결합 온도는 가축류와 동일하게 LCO1490/HCO2198 프라이머에서 40℃, VF2/FISH R2 프라이머에서 50℃로 확인되었다. 어류의 경우 VF2/FISH R2프라이머를 이용한 경우에 한하여 CO1 부위의 증폭을 확인하였으며, 청어, 명태, 청대구 및 송어는 40℃에서, 대구, 다랑어 및 우럭은 55℃의 재결합 온도에서 가장 적합한 것으로 확인되었다(Fig.

후속연구

일반 프라이머를 이용하는 방법은 PCR 후에 염기서열을 결정하는 단계가 추가되어 비교적 분석시간이 길고, 데이터베이스에 등록되어 있는 염기서열이 없으면 분석이 어려우며, PCR 산물의 크기가(약 650 bp 이상) 커서 가공식품 적용엔 한계가 있다. 그러나 추정되는 원료물질을 모를 경우엔 가장 우선적으로 사용될 수 있는 방법이며 프라이머 개발을 위한 시간적, 경제적인 투자가 필요 없다는 점에서 일반 프라이머의 활용가치가 높다고 할 수 있다.
따라서 본 연구에서는 동물성 및 식물성 식품원료별 적용 가능한 최적의 프라이머 및 PCR 조건을 제시하였으며, 본 방법은 가짜식품으로 의심되는 식품 분석 시 적용 가능하며, 식품 중 생물체가 이물로 발견 시 정확한 종 동정에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
본 연구는 일반 프라이머를 이용한 유전자 분석법을 통해 가공식품에 사용된 식품원료의 진위여부를 판별할 수 있는 가능성을 제시하였으며 식품원료별 사용가능한 최적의 프라이머와 PCR 조건을 확립하였다. 또한 본 연구에서 확립된 시험법은 식품 중 발견되는 생물체의 이물동정법에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
각각의 프라이머를 이용하여 식물 5종(마늘, 양파, 무, 녹차 및 시금치)에 대하여 실험한 결과 3종류의 프라이머에서 PCR의 산물을 모두 확인하였으며 trnH/psbA 프라이머의 경우 식물 종마다 PCR 산물의 크기는 다르게 검출되었다. 본 연구에서는 17종의 식품원료별 일반 프라이머 및 PCR 조건을 확립하였으며, 생산된 PCR 산물을 대상으로 염기서열을 결정하고 유전자은행에 있는 염기서열과 DB 비교·분석을 통하여 식품에 사용된 원료의 진위여부 판별에 적용이 가능할 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	이화학적분석법의 종류로는 무엇이 있습니까?	육안으로 원재료를 확인할 수 없거나 의도적으로 소량의 원료를 혼입하여 제조된 EMA 식품에 대하여 사용원료를 확인하는 방법에는 이화학적분석법, 단백질분석법, 유전자분석법 등이 있다. 이화학적인 분석법으로는 광합성의 대사경로에 따른 탄소동위원소비율을 활용한 분석법1,2), 분자량이 적은 ion-fragment의 패턴차이를 이용하여 비교분석하는 MS-전자코 분석법3,4,5), 함유하고 있는 특정 성분 물질의 유무와 함유량을 확인할 수 있는 GC, LC, HPLC 등이 주로 이용되고 있다6,7).
	EMA 식품의 경우 무엇에 의하여 사용원료를 확인할 수 있는가?	uk) 등에서는 EMA 방지를 위한 노력을 하고 있다. EMA 식품의 경우 서류검토, 관능 및 육안 분석방법 등에 의하여 사용원료를 확인할 수 있으나 과학적 시험법의 개발이 요구된다. 육안으로 원재료를 확인할 수 없거나 의도적으로 소량의 원료를 혼입하여 제조된 EMA 식품에 대하여 사용원료를 확인하는 방법에는 이화학적분석법, 단백질분석법, 유전자분석법 등이 있다.
	의도적으로 소량의 원료를 혼입하여 제조된 EMA 식품에 대하여 사용원료를 확인하는 방법에는 무엇이 있습니까?	EMA 식품의 경우 서류검토, 관능 및 육안 분석방법 등에 의하여 사용원료를 확인할 수 있으나 과학적 시험법의 개발이 요구된다. 육안으로 원재료를 확인할 수 없거나 의도적으로 소량의 원료를 혼입하여 제조된 EMA 식품에 대하여 사용원료를 확인하는 방법에는 이화학적분석법, 단백질분석법, 유전자분석법 등이 있다. 이화학적인 분석법으로는 광합성의 대사경로에 따른 탄소동위원소비율을 활용한 분석법1,2), 분자량이 적은 ion-fragment의 패턴차이를 이용하여 비교분석하는 MS-전자코 분석법3,4,5), 함유하고 있는 특정 성분 물질의 유무와 함유량을 확인할 수 있는 GC, LC, HPLC 등이 주로 이용되고 있다6,7).

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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