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문제 정의
- 본 연구에서는 녹차(Camellia sinensis) 잎 추출물, 구아바 (Psidium guajava)잎 추출물 그리고 장미 CRosa hybridal 잎 추출물로 이루어진 식물추출 복합물 (PEM381) 에 대하 여제 I 형 알레르기 반응 억제 효능 및 생화학적 기전을 밝히기 위하여 COX 억제 활성, LO 억제 활성, compound 48/80에 의한 랫드 복강 비만세포의 탈과립과 히스타민 유리에 미치는 영향 그리고 수동피부아나필락시스 반응 억제효능을 측정하였다. 그 결과 PEM381은 5-LO IC50 값이 14.
- 본 연구에서는 녹차(Camellia sinensis)잎 추출물, 구아바 (Psidium guajava)잎 추출물 그리고 장미CRosa hybridal 잎 추출물로 이루어진 식물추출 복합물 (PEM381) 에 대하 여제 I 형 알레르기 반응 억제 효능 및 생화학적 기 전을 밝히 기위하여 COX와 LO 억제 활성, compound 48/80에 의한 비만세포의 탈과립과 히스타민 유리에 미치는 영향 그리고 수동 피부아나필락시스 (passive cutaneous anaphylaxis, PCA) 억 제 효능을 측정하여 건강기 능성 식 품으로서 의 유용성 을 살펴보고자 한다.
제안 방법
- 25 mL를 꼬리정맥에 주사하여 반응을 일으켰다. 30분 후 경추 탈골하여 치사시킨 다음 양쪽 귀 혈관으로부터 누출된 Evans blue 색소량을 측정하였다. 양성대조군으로 프로메타진 하이드로클로라이 드 (promethazine hydrochloride, Phenergan®: H1 histamine receptor antagonist)를 사용하였다.
- 샘플 10 L에 5-LO(220 units/mL) 90 L와 1 mM 아라키돈산 10 L를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체 (chromogen) 100」L를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA autoreader 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 5-LO 억제율(%) 다음과 같은 식을 이용하여 IC50값으로 나타내 었으며 양성 대 조군으로 첨 차와 노르디 히 드로구아야레틱산(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)을 사용하였다. 5-LO 억제율(%) = [(대조군의 흡광도 -실험군의 흡광도)/ 대조군의 흡광도] x 100
- 각각의 성분에 대한 분석조건은 다음과 같다(Table 1). EGCG는 이동상을 20 mM KHzPQ-HaPQSH 2.4)와 메탄올을 75:25(v/v), 이동상 유속을 1.0 mL/min으로 하여 시료를 5 L 주입한 뒤 UV 280 nm에서 분석하였다. Ellagic acid는 이동상을 20 mM KHzPQj-HsPOepH 2.
- 복강 비만세포 부유액으로부터 비만세포의 순수분리는 Hachisuka 등의 방법을 이용하여 다음과 같이 분리하였다(23). Isotonic Percoll 용액(10xHank's 용액 1 mL + Percoll 9 mL) 3.5 mL에 세포 부유액 0.75 mL와 HEPES-Tyrode buffer 0.5 mL를 첨가하여 4oC에서 125xg로 15분간 원심분리 시켜 상층액을 버리고 HEPES-Tyrode buffer로 2 번 세척하여 순수한 비만세포 부유액을 만들었다.
- PEM381 대량제조시 품질관리를 위하여 3가지 (EGCG, ellagic acid 그리고 gallic acid)를 지표성분으로 설정하고 HPLC를 이용하여 그들의 함량을 측정하였다(Fig. 2). 또한 각각의 추출분말을 대량공정시 나타날 수 있는 수율 변동성을 감안하여 10여종의 PEM381 을 제조하여 각각 분석하였다.
- PEM381 이 compound 48/80에 의한 비만세포 활성화 억제 유무를 알아보기 위하여, 분리한 복강 비만세포 0.2 mL(1 x 106 cells)에 샘플 25 L를 넣어 37oC 항온조에서 10 분 동안 반응시키고 다시 compound 48/80 용액 (10 .ig/mL) 25 L를 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 이렇게 반응시킨 후 비만세포의 탈과립 및 비만세포로부터 유리되는 히스타민의 양을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
- PEM381에 대한 5-LO 억제 효능 측정은 lipoxygenase inhibitor screening assay kit를 이용하여 실험하였다. 샘플 10 L에 5-LO(220 units/mL) 90 L와 1 mM 아라키돈산 10 L를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체 (chromogen) 100」L를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA autoreader 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- PEM381에 대한 COX 억제 효능은 Reddy 등의 방법을 변형하여 실험하였다(20). 효소 20 L(COX-1: 60 units or COX-2: 30 units), 100 mM Tris-HCl buffer(pH 8.
- 반응이 끝난 비만세포가 들어있는 복강 부유액 20 L 를 슬라이드글라스 위에 올려놓은 후 비만세포가 침전될 수 있도록 실온에서 10분간 정치시켰다. 광학현미경으로 1,000배의 배율 하에서 비만세포를 관찰하여 정상형과 탈과립형으로 구분하였다. 실험군 임의로 선택한 10곳의 시야에서 관찰된 비만세포의 수를 세어, 다음과 같은 식으로 탈과립율을 계산하였다.
- 2 mL(2x105 cells)에 샘플 20 L를 처리한 후 37oC에서 2시간 배양한 다음 MTT 용액(2 mg/mL) 20 L를 첨가하여 2시간 배양하였다. 그 후 상층액을 제거하여 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide)를 well 당 100」L씩 넣고 20분간 반응시킨 다음 ELISA autoreader 570 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 식으로 생존율을 계산하였다. 생존율(%) = (실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
- 2). 또한 각각의 추출분말을 대량공정시 나타날 수 있는 수율 변동성을 감안하여 10여종의 PEM381 을 제조하여 각각 분석하였다. 분석에 사용된 HPLC는 Waters 시스템으로 600 controller, Delta 600 pump 그리고 2487 UV detector를 사용하였고 컬럼은 Symmetry C18(5」m, 4.
- 샘플 10 L에 5-LO(220 units/mL) 90 L와 1 mM 아라키돈산 10 L를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체 (chromogen) 100」L를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA autoreader 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 5-LO 억제율(%) 다음과 같은 식을 이용하여 IC50값으로 나타내 었으며 양성 대 조군으로 첨 차와 노르디 히 드로구아야레틱산(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)을 사용하였다.
- 수컷 마우스 양쪽 귀 에 anti-DNP IgE(1.2 g/mL) 10 L씩 주사하고 47시간 경과 후, 샘플을 경구 투여하였다. 한 시간 뒤 (즉, anti-DNP IgE 주사 48시간 경과 후) DNP-albumin 0.
- 식품 소재로 사용 가능한 구아바잎(중국산), 녹차잎(중국산) 그리고 장미꽃잎(파키스탄산)을 세척하고 마쇄하여 건조한 뒤 각각 다음과 같은 방법으로 3회 반복하여 추출하였다. 먼저 구아바잎 추출분말은 건조 중량 1,000 g에 약 10배에 달하는 50% 에탄올을 첨가하여 60oC에서 2시간 동안 추출하여 감압농축한 뒤 동결 건조시켜 151~210 g의 추출 분말을 얻어 약 15~21%의 회수율을 나타내었다.
- 뒤 실험에 사용하였다. 실험 기간 중에 물은 자유로이 섭취시켰으며, 사육실 온도는 22±2oC, 습도는 55±5% 및 명암은 12시간 주기로 자동 조절하였다.
- 광학현미경으로 1,000배의 배율 하에서 비만세포를 관찰하여 정상형과 탈과립형으로 구분하였다. 실험군 임의로 선택한 10곳의 시야에서 관찰된 비만세포의 수를 세어, 다음과 같은 식으로 탈과립율을 계산하였다. 탈과립율 (%) = (탈과립 된 비만세포 수/비만세포 총수) x 100
- 약물 반응 후 복강 비만세포를 4oC 에서 150 xg로 10분간 원심분리한 다음, 상층액내의 히스타민양을 측정하였다. 히스타민 측정은 Harvima 등의 방법을 수정, 보완하여 다음과 같이 실시하였다(26).
- 장미꽃잎 추출분말은 건조 중량 1,000 g에 약 10배에 달하는 물을 첨가한 다음 100oC 에서 2시간 동안 열수 추출하여 식힌 후 4oC 에서 200 xg로 10분간 원심분리하여 상등액을 감압농축한 뒤 동결 건조시켜 403~464 g을 얻어 약 40~46%의 회수율을 나타내었다. 위의 방법으로 얻어진 구아바잎 추출분말, 녹차잎 추출분말 그리고 장미꽃잎 추출 분말 각각을 일정한 무게비율로 혼합하여 식물추출 복합물 (PEM381)을 제조하였다. 또한 첨차 20 g을 세척하고 마쇄하여 건조한 다음 건조 중량 20 g에 약 10배에 달하는 물을 가한 다음 100oC 에서 2시간 동안 열수추출하여 식힌 후 감압 농축하여 동결 건조시켜 4 g의 추출분말을 얻어 회수율 20% 를 나타내었다.
- ig/mL) 25 L를 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 이렇게 반응시킨 후 비만세포의 탈과립 및 비만세포로부터 유리되는 히스타민의 양을 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
- 대부분 복강 비만세포들은 원형 또는 난 원형으로 세포질 안에 많은 과립들로 충만되어 있고, 세포윤곽이 뚜렷하였다. 이렇게 세포의 모양이 원형이나 타원형으로 세포 윤곽이 분명하고, 세포질내에 광굴절율이 높은 과립들로 충만된 상태를 정상형 비만세포로 구분하였다. 반면, 세포 윤곽이 불분명하고 세포질내 과립들이 세포표면으로 돌출되어 있거나 세포 주위에 흩어져 있는 경우를 탈과립형으로 구분하였다.
- 즉, SD 계 랫드를 에테르로 마취시켜 희생시킨 후 HEPES-Tyrode buffer(136 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCb, 0.6 mM NaH2PO4, 2.75 mM MgCh, 5.4 mM HEPES, 1.0 mg/mL bovine serum albumin, 1.0 mg/mL glucose, pH 7.4) 10 mL를 랫드의 복강내에 주입하고 90초간 복벽을 가볍게 마사지 하였다. 복벽 중앙선을 절개하고 복강 세척액을 스포이드로 채취하여 4oC 에서 200 xg로 10분간 원심분리시킨 뒤 상층 부유액을 버리고, HEPES-Tyrode buffer로 비만세포 수가 1x106 cells/mL되도록 재부유시켜 실험에 사용하였다.
- 2 g/mL) 10 L씩 주사하고 47시간 경과 후, 샘플을 경구 투여하였다. 한 시간 뒤 (즉, anti-DNP IgE 주사 48시간 경과 후) DNP-albumin 0.25 mg과 Evans blue 1.25 mg을 용해한 생리식염수 0.25 mL를 꼬리정맥에 주사하여 반응을 일으켰다. 30분 후 경추 탈골하여 치사시킨 다음 양쪽 귀 혈관으로부터 누출된 Evans blue 색소량을 측정하였다.
- 실험하였다(20). 효소 20 L(COX-1: 60 units or COX-2: 30 units), 100 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0) 90 L, 30 M EDTA 20 L, 150 M hematin 20 L 그리고 샘플 20 L를 혼합하여 25oC에서 5분간 반응시키고 5 mM TMPD 5 L와 20 mM 아라키돈산 5 L를 첨가하여 25oC에서 5분간 반응시 킨 후 ELISA autoreader 603 nm에서 흡광도를 측정하였다. COX 억제율(%)은 다음과 같은 식을 이용하여 IC50 값으로 나타내었으며 양성대조군으로 항알레르기효능이 우수한 식물소재로 알려져 있는 첨차(21)와 NSAIDs 중의 흐?나인 인도메타신(indomethacin, Inteban®)을 사용하였다.
- 히스타민 측정은 Harvima 등의 방법을 수정, 보완하여 다음과 같이 실시하였다(26). 상층액 10, .
대상 데이터
- 5-lipoxygenase, hematin, arachidonic acid, N, N, N', N'-tetramethyl-p-phenylenediamine(TMPD), compound 48/80, bovine serum albumin(BSA), anti-dinitrophenyl(DNP) IgE, DNP-albumin, Evans blue, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), nordihydroguaiaretic acid, epigallocatechin gallate(EGCG), ellagic acid 그리고 gallic acid는 Sigma사(USA)에서 구입하였다. Lipoxygenase inhibitor screening assay kit(catalog No.
- 구입하였다. Lipoxygenase inhibitor screening assay kit(catalog No. 76700), cyclooxygenase-1 그리고 cyclooxygenase-2는 Cayman사(USA)에서, S-adenosyl(methyl-14C)methionine 은 Perkin Elmer Life Science사(USA)에서, percoll 용액은 Pharmacia사(USA)에서, cocktail 용액은 Ultima Gold제품 (PerkinElmer사, USA), 구아바잎, 녹차잎 그리고 장미꽃잎은 (주)진용내츄럴(수원시 팔달구)에서, 첨차(Rubus suavissimus)는 농림생약(충남 아산시)에서 각각 구입하였다. UV-VIS 흡광계는 Spectronic Genesys 5(Milton Roy사, USA) 모델, ELISA autoreader는 VERSA max(Molecular devices사, USA) 모델, inverted microscope는 TS100-F (Nikon사, Japan) 모델, liquid scintillation analyzer는 A2300(Canberra사, Australia) 모델, high performance liquid chromatography(HPLC) 시스템 및 컬럼은 Waters (Waters사, USA) 모델을 각각 사용하였다.
- SD계 랫드(수컷, 8주령)와 ICR계 마우스(수컷, 7주령)는 (주)오리엔트 바이오(경기도 가평)에서 구입하여 1주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 실험 기간 중에 물은 자유로이 섭취시켰으며, 사육실 온도는 22±2oC, 습도는 55±5% 및 명암은 12시간 주기로 자동 조절하였다.
- 0) 90 L, 30 M EDTA 20 L, 150 M hematin 20 L 그리고 샘플 20 L를 혼합하여 25oC에서 5분간 반응시키고 5 mM TMPD 5 L와 20 mM 아라키돈산 5 L를 첨가하여 25oC에서 5분간 반응시 킨 후 ELISA autoreader 603 nm에서 흡광도를 측정하였다. COX 억제율(%)은 다음과 같은 식을 이용하여 IC50 값으로 나타내었으며 양성대조군으로 항알레르기효능이 우수한 식물소재로 알려져 있는 첨차(21)와 NSAIDs 중의 흐?나인 인도메타신(indomethacin, Inteban®)을 사용하였다. COX 억제율(%) = [(대조군의 흡광도-실험군의 흡광도)/대 조군의 흡광도] x 100
- 또한 각각의 추출분말을 대량공정시 나타날 수 있는 수율 변동성을 감안하여 10여종의 PEM381 을 제조하여 각각 분석하였다. 분석에 사용된 HPLC는 Waters 시스템으로 600 controller, Delta 600 pump 그리고 2487 UV detector를 사용하였고 컬럼은 Symmetry C18(5」m, 4.6x250 mm)을 사용하였다. 각각의 성분에 대한 분석조건은 다음과 같다(Table 1).
- 30분 후 경추 탈골하여 치사시킨 다음 양쪽 귀 혈관으로부터 누출된 Evans blue 색소량을 측정하였다. 양성대조군으로 프로메타진 하이드로클로라이 드 (promethazine hydrochloride, Phenergan®: H1 histamine receptor antagonist)를 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 3회 반복하여 평균士표준오차로 나타내었고, 유의수준은 p<0.05로 Student's t-test를 실시하였다.
이론/모형
- PEM381에 대하여 수동피부아나필락시스 반응 억제 효능을 알아보기 위하여 Kim 등의 방법을 이용하여 실험하였다 (27). 수컷 마우스 양쪽 귀 에 anti-DNP IgE(1.
- 76700), cyclooxygenase-1 그리고 cyclooxygenase-2는 Cayman사(USA)에서, S-adenosyl(methyl-14C)methionine 은 Perkin Elmer Life Science사(USA)에서, percoll 용액은 Pharmacia사(USA)에서, cocktail 용액은 Ultima Gold제품 (PerkinElmer사, USA), 구아바잎, 녹차잎 그리고 장미꽃잎은 (주)진용내츄럴(수원시 팔달구)에서, 첨차(Rubus suavissimus)는 농림생약(충남 아산시)에서 각각 구입하였다. UV-VIS 흡광계는 Spectronic Genesys 5(Milton Roy사, USA) 모델, ELISA autoreader는 VERSA max(Molecular devices사, USA) 모델, inverted microscope는 TS100-F (Nikon사, Japan) 모델, liquid scintillation analyzer는 A2300(Canberra사, Australia) 모델, high performance liquid chromatography(HPLC) 시스템 및 컬럼은 Waters (Waters사, USA) 모델을 각각 사용하였다. 그 이외의 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다.
- 복벽 중앙선을 절개하고 복강 세척액을 스포이드로 채취하여 4oC 에서 200 xg로 10분간 원심분리시킨 뒤 상층 부유액을 버리고, HEPES-Tyrode buffer로 비만세포 수가 1x106 cells/mL되도록 재부유시켜 실험에 사용하였다. 복강 비만세포 부유액으로부터 비만세포의 순수분리는 Hachisuka 등의 방법을 이용하여 다음과 같이 분리하였다(23). Isotonic Percoll 용액(10xHank's 용액 1 mL + Percoll 9 mL) 3.
- 분리한 복강 비만세포에 대한 PEM381의 독성을 알아보기 위하여 Sladowski 등의 방법으로 3-(4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 측정을 실시하였다(24). 분리한 복강 비만세포 0.
- 비만세포의 형태와 탈과립 유무의 관찰은 Cochrane 과 Douglas의 방법으로 실시하였다(25). 반응이 끝난 비만세포가 들어있는 복강 부유액 20 L 를 슬라이드글라스 위에 올려놓은 후 비만세포가 침전될 수 있도록 실온에서 10분간 정치시켰다.
성능/효과
- 누출된다. PEM381 을 0.5, 2, 5, 15 그리고 50 ㎎/㎏(체중) 경구 투여 시 마우스 양쪽 귀에 누출된 Evans blue 양은 각각 17.1±3.1, 12.3±2.4, 10.5±2.9, 8.8±1.8 그리고 6.6± 1.5 日을 나타내어 농도 의존적으로 수동 피부아나필락시스 반응을 억제하였다. 특히 PEM381 15 ㎎/㎏(체중) 이상 경구 투여군부터 50% 이상의 억제율을 나타내었다(Table 5).
- PEM381(최종농도: 0.01, 0.1 그리고 1 mg/mL)에 대하여 MTT 방법으로 복강 비만세포의 독성을 측정한 결과 각각 94.8±2.7, 114.0±0.9 그리고 160.6±9.0% 생존율을 나타내었다. PEM381은 실험에 사용된 범위의 농도까지 세포독성은 없었으며 오히려 0.
- PEM381에 대하여 5-LO 억제 효능을 측정한 결과 PEM381 의 IC50 값은 14.11 ±0.51 ppm으로 알레르기 유발 물질인 류코트리엔류 합성을 효과적으로 억제하였다. 또한 첨 차 추출 분말에 대한 5-LO 억제능은 100 ppm 이상으로 나타나 PEM381 과 비교시 현저하게 억제능이 떨어지는 것으로 나타났다(Table 4).
- PEM381에 대하여 COX 억제 효과를 측정한 결과 COX-2의 IC50값은 5.57±0.41 ppm으로 나타나 시중에서 항알레르기 효능이 우수한 식물소재로 알려져 있는 첨차 추출 분말보다는 약 6배 (34.23/5.57) 우수한 활성을 나타냈고 인도메타신보다는 약 2배(5.57/2.79) 떨어지는 활성을 나타냈다. PEM381 에 대한 COX-1의 IC50값은 14.
- 결론적으로 PEM381 이 아라키돈산을 염증과 알레르기 유발물질 인 프로스타글란딘류과 류코트리 엔류로 각각 전환시키는 COX와 LO의 활성을 억제하였고, 비만세포의 탈과립, 탈과립으로 인한 히스타민 유리 및 수동 피부아나필락시스 반응을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 1). 본 연구에서 얻어진 결과들은 PEM381 이 알레르기성 비염, 아토피 피부염 및 기관지천식 같은 제 I 형 알레르기 반응의 예방과 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사한다.
- 그 결과 PEM381은 5-LO IC50 값이 14.11 ±0.51 ppm으로 나타났고, COX-1에 비해 COX-2를 선택적으로 억제하는 것으로 나타났다. 또한 PEM381은 compound 48/80에 의한 비만세포의 탈과립과 히스타민 유리를 농도 의존적으로 억제할 뿐만 아니라 수동피부아나필락시스 반응도 억제하였다.
- 비만세포 부유액에 compound 48/80 용액을 첨가한 후 1분이 지난 뒤 관찰하면 비만세포의 형태, 크기, 표면윤곽 등에서 원래 완충용액에 부유된 정상비만세포와 매우 유사하였다. 다시 20분 경과 후 현미경을 통해 관찰된 비만세포들은 약 95% 정도의 비만세포들에서 세포막의 불연 속성과 약간의 광굴절율 감소, 과립들의 돌출 현상들이 관찰되었다 (Fig. 4). 비만세포 부유액에 PEM381( 최종농도: 0.
- 02) 떨어지는 활성을 지니고 있는 것으로 나타났다. 따라서 PEM381은 COX-1의 높은 억제로 인한 위장관 및 신장의 부작용을 최소화할 수 있을 것으로 사료된다. 실제로 PEM381의 COX-2 IC50/COX-1 IC50의 비가 첨차 추출분말보다는 약 16배(6.
- 5). 따라서 PEM381은 제 I 형 알레르기 반응의 병태생리에 중요한 역할을 하는 비만 세포막을 안정화시켜 비만세포의 탈과립을 조절하여 제 I 형 알레르기 반응을 억제할 것으로 사료된다.
- 51 ppm으로 알레르기 유발 물질인 류코트리엔류 합성을 효과적으로 억제하였다. 또한 첨 차 추출 분말에 대한 5-LO 억제능은 100 ppm 이상으로 나타나 PEM381 과 비교시 현저하게 억제능이 떨어지는 것으로 나타났다(Table 4).
- 유리된 히스타민은 혈관확장과 근육수축을 일으켜 알레르기 증상을 유발한다. 복강 비만세포 부유액에 compound 48/80을 처 리하였을 때 히스타민 유리율은 104.0 ±9.3%이었으나, PEM381(최종농도: 0.01, 0.1 그리고 1 mg/mL)을 전처리하고 compound 48/80을 처리할 경우 히스타민 유리율은 각각 24.8±2.2, 20.8±1.8 그리고 12.1±5.2% 를 나타내어 농도 의존적으로 히스타민 유리를 억제하였다(Fig. 6). 비만세포 탈과립 관찰과 비만세포 탈과립으로 유리되는 히스타민양 측정 결과로부터 PEM381은 비만세포 탈과립 자체를 억제할 뿐만 아니라 탈과립으로 인한 히스타민 유리를 억제함으로써 제 I 형 알레르기 반응을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
- 1). 본 연구에서 얻어진 결과들은 PEM381 이 알레르기성 비염, 아토피 피부염 및 기관지천식 같은 제 I 형 알레르기 반응의 예방과 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사한다.
- 4). 비만세포 부유액에 PEM381( 최종농도: 0.01, 0.1 그리고 1 mg/mL)을 10분간 처 리하고 compound 48/80을 첨가하여 20분간 반응 후 비만세포 탈과립율을 측정한 결과 각각 14.2±1.9%, 11.3±2.1%, 그리고 5.5±3.0%를 나타내어 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 5). 따라서 PEM381은 제 I 형 알레르기 반응의 병태생리에 중요한 역할을 하는 비만 세포막을 안정화시켜 비만세포의 탈과립을 조절하여 제 I 형 알레르기 반응을 억제할 것으로 사료된다.
- 6). 비만세포 탈과립 관찰과 비만세포 탈과립으로 유리되는 히스타민양 측정 결과로부터 PEM381은 비만세포 탈과립 자체를 억제할 뿐만 아니라 탈과립으로 인한 히스타민 유리를 억제함으로써 제 I 형 알레르기 반응을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
- 따라서 PEM381은 COX-1의 높은 억제로 인한 위장관 및 신장의 부작용을 최소화할 수 있을 것으로 사료된다. 실제로 PEM381의 COX-2 IC50/COX-1 IC50의 비가 첨차 추출분말보다는 약 16배(6.32/0.38), 인도메타신보다는 약 367배(139.50/0.38) 떨어지는 것으로 나타나 첨 차 추출 분말과 인도메타신보다 더 선택적으로 COX-2 를 억제하는 것으로 나타났다(Table 3).
- 5 日을 나타내어 농도 의존적으로 수동 피부아나필락시스 반응을 억제하였다. 특히 PEM381 15 ㎎/㎏(체중) 이상 경구 투여군부터 50% 이상의 억제율을 나타내었다(Table 5).
후속연구
- LO는 현재까지 type 5-, 8-, 9-, 11-, 12- 그리고 type 15-LO 등 다양한 종류가 알려져 있으며 특히 포유동물에서 5-LO 에 의해 생성된 류코트리엔류는 제 I 형 알레르기 증상 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(16-19). 따라서 선택적인 COX-2 억제 활성과 5-LO 억제 활성을 갖는 물질들은 부작용이 적은 제 I 형 알레르기 치료제로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 PEM381은 compound 48/80에 의한 비만세포의 탈과립과 히스타민 유리를 농도 의존적으로 억제할 뿐만 아니라 수동피부아나필락시스 반응도 억제하였다. 이상의 결과로 PEM381은 알레르기성 비염, 아토피 피부염 및 기관지천식 같은 제 I 형 알레르기 질환에 대하여 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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