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문제 정의
- cereus 1-1 균주는 기존의 미생물을 이용한 ALA 생산에서 많이 사용되었던 광합성세균에 비해 배양과정에 광이 필요하지 않으며 ALA 과량생산을 위한 저해제 levulinic acid를 넣지 않아도 비슷한 수준으로 ALA를 다량으로 생산할 수 있어 훨씬 경제적이고 배양시간이 짧아 오염의 우려 또한 적다. 본 연구는 ALA 의 미생물학적 생산을 위하여 B. cereus 균주를 이용한 최초의 시도이며 ALA를 가장 효율적으로 생산할 수 있는 최적 조건을 찾는데 중점을 두었다.
- 본 연구에서는 광합성 세균이 아닌 호기성 세균을 이용하여 환경에 해를 주지 않는 무공해 미생물 제초제를 생산하기 위하여 Bacillus cereus 1-1 균주의 ALA 생산을 조사하였다. B.
제안 방법
- ALA를 최대로 생산할 수 있는 조건을 찾기 위해 본 배양 5시간 만에 첨가하는 산(acetic acid, glutamic acid, lactic acid, propionic acid, pyruvic acid, sulfuric acid)의 종류를 달리하여 같은 농도로 첨가하였다. 산을 첨가하지 않은 대조군에서는 ALA 가 전혀 생산되지 않았으며, 유기산인 acetic acid 등을 넣었을 때 sulfuric acid를 첨가한 경우보다 5배 이상 많은 양의 ALA가 생산되었다(Fig.
- B. cereus 1-1 균을 TCY 배지에서 전 배양하고, 이 배양액을 1% 농도로 접종하여 새 TCY 배지에 본 배양을 시작하였으며, 배양시간에 따른 균 생장을 측정하였고 배지의 pH 변화를 알아보았다(Fig. 1). 접종 13시간 만에 최대 생장을 보이며 접종 후 1시간에서 6시간에 걸쳐 대수적 생장을 보이는 것이 나타났다.
- ALA 생성의 전단계가 저해를 받는다(12). B. cereus 1-1 균주의 ALA 생합성 경로가 C-5 경로인지 알아보기 위하여 glutamic acid를 첨가한 배양에서 gabaculine을 40 |1M 가하여 ALA 생산이 저해되는지 조사하였다.
- B. cereus 1-1 균주의 배지 종류에 따른 ALA 생산을 알아보기 위하여 TCY, LB, PCA, NB 배지에 각각 접종하여 18시간 전 배양한 다음 동일배지에서 본 배양하면서 배양시간에 따른 ALA 생산량을 측정하였다.
- 3%)를 사용하였다. Glucose는 B. cereus 1-1 균 접종 직전에 점가하였으며 생육 중간에는 유기산 중에서 주로 acetic acid를 첨가하여 pH의 변화와 ALA 생산을 조사하였다.
- TCY 배지에 첨가하는 glucose가 초기 배양 과정에서 배지의 pH를 좌우하므로 농도를 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%로 변화 시켜 첨가하여 ALA 생산량을 비교하여 보았다. glucose의 농도가 0.
- 그람 양성이며 포자를 형성하고 배양 결과 천연의 친환경 제초제 성분인 ALA의 생산을 확인하였다.
- 진탕 배양하면서 600 nm 파장에서 optical density를 측정하여 균 생장을 보았으며, 배양시간에 따른 배지 pH의 변화를 조사하였고, 배양 과정 각 시기에 acetic acid를 16 mM 첨가하면서 ALA 생산을 비교하였으며, acetic acid 첨가량과 본 배양 시작 시 첨가하는 glucose를 농도 별로 조절하여 ALA 생산의 최적 조건을 찾았다. 대수기 후기에 첨가하는 산의 종류(acetic acid, glutamic acid, lactic acid, propionic acid, pyruvic acid, sulfuric acid)를 달리하여 비교하였으며, 배양 시간과 배지 종류(TCY, LB, PCA, NB)에 따른 ALA 생산을 보았다.
- 보다 정확한 분류를 위해서 API 50 CHB kit (France, Biomerieux)를 사용하였으며 아울러서 Motility test medium (Difco)을 이용하여 운동성 여부를 조사하였다.
- 본 배양은 TCY 배지에 전 배양균 1%를 가하였으며 진탕속도는 200 rpm, 온도는 30~33℃로 조절하여 배양하였다. 사용균주의 ALA 생산이 최대가 되는 조건을 찾기 위해 배양조건을 변화시켰다. 진탕 배양하면서 600 nm 파장에서 optical density를 측정하여 균 생장을 보았으며, 배양시간에 따른 배지 pH의 변화를 조사하였고, 배양 과정 각 시기에 acetic acid를 16 mM 첨가하면서 ALA 생산을 비교하였으며, acetic acid 첨가량과 본 배양 시작 시 첨가하는 glucose를 농도 별로 조절하여 ALA 생산의 최적 조건을 찾았다.
- 6) 1 ml와 acetyl acetone 40 ㎛를 첨가하여 10분 정도 끓여 식힌다. 상기 용액 1 nd와 신선한 Ehrlich 시약(lg p-dimethyl- aminobenzaldehyde, 42 ml glacial acetic acid, 8 ml 70% per- chloric acid) 1 ml를 넣고 잘 섞은 다음 10분 후 556 nm에서 흡광도를 측정하였으며(5), ALA (Sigma Co.)의 표준곡선을 이용하여 농도를 결정하였다.
- subtilis에서처럼 크고, 다른 유기산 첨가와 더불어서 glutamic acid를 첨가하여도 ALA가 2 mM 정도 생산되는 것으로 보아 C-5 경로를 통하여 합성하는 것으로 예상하였다. 이를 확인하기 위하여 acetic acid와 glutamic acid를 각각 첨가한 배양액을 배양시간에 따라 취하여 생산된 ALA의 양을 조사하였다. Glutamic acid가 직접적인 ALA 합성의 기질로 사용된다면 acetic acid를 첨가한 배양액보다 많은 양의 ALA를 지속적으로 생산할 것으로 예상하고 조사한 결과, Fig.
- 사용균주의 ALA 생산이 최대가 되는 조건을 찾기 위해 배양조건을 변화시켰다. 진탕 배양하면서 600 nm 파장에서 optical density를 측정하여 균 생장을 보았으며, 배양시간에 따른 배지 pH의 변화를 조사하였고, 배양 과정 각 시기에 acetic acid를 16 mM 첨가하면서 ALA 생산을 비교하였으며, acetic acid 첨가량과 본 배양 시작 시 첨가하는 glucose를 농도 별로 조절하여 ALA 생산의 최적 조건을 찾았다. 대수기 후기에 첨가하는 산의 종류(acetic acid, glutamic acid, lactic acid, propionic acid, pyruvic acid, sulfuric acid)를 달리하여 비교하였으며, 배양 시간과 배지 종류(TCY, LB, PCA, NB)에 따른 ALA 생산을 보았다.
대상 데이터
- ALA를 생산하는 호기성 세균에 대한 연구를 위하여 본 실험에서 사용된 균주는 B. cereus 1-1 균(KCTC 11067BP)으로 충북 청주시 서원대학교 주변 토양 시료에서 분리되었다.
- 본 실험에서 사용한 기본 배지는 전 배양과 본 배양 모두 TCY 액체 배지 (tryptone 1%, casamino acid 1%, yeast extract 1%, glucose 0.3%)를 사용하였다. Glucose는 B.
성능/효과
- B. cereus 1-1 균을 접종하고 대수기까지 배양한 뒤 acetic acid를 첨가하면 배지의 pH가 어느 정도 낮아지며 이것이 균주생육 환경의 변화를 야기하여 배양 18시간 경에 이르러 배양액을 취하여 측정한 결과 ALA 생산이 급격히 증가하는 것을 발견하였으며, 특히 접종 6시간 후인 대수기 말에 acetic acid를 첨가하면 생산량이 최대치를 나타냈다(Fig. 2).
- 3%의 이ucose가 포함되어 있어야 배양과정에서 ALA 생산에 적절한 pH 조건이 맞게 되는 것으로 보인다. B. cereus 1-1 균의 ALA 생산에는 배양 초기에 glucose를 첨가하는 것이 효과적이며, 균이 생장하여 대수기 후기에 이르렀을 때 acetic acid를 16 mM 첨가하여 배양을 계속하면 ALA가 최대 2 mM까지 생산되었는데 이는 C-5 경로를 통하여 이utamic acid로부터 ALA를 생산하는 다른 세균들(36)에 비하면 대단히 많은 양이며, C-4 경로를 통하여 ALA를 생산하는 광합성세균의 배양조건을 최적화시킨 경우(32, 33)의 절반에 해당하는 농도를 생산한 것으로 더 이상의 유전적 재조합을 거치지 않고도 산업적으로 ALA를 생산할 수 있는 정도이다. ALAD의 저해제인 levulinic acid를 주가로 첨가한다면 더욱 많은 양의 ALA를 생산할 것으로 기대한다.
- B. cereus 1-1 균주에 의한 ALA 생산 경로가 C-4 경로보다는 C-5 경로일 가능성이 B. subtilis에서처럼 크고, 다른 유기산 첨가와 더불어서 glutamic acid를 첨가하여도 ALA가 2 mM 정도 생산되는 것으로 보아 C-5 경로를 통하여 합성하는 것으로 예상하였다. 이를 확인하기 위하여 acetic acid와 glutamic acid를 각각 첨가한 배양액을 배양시간에 따라 취하여 생산된 ALA의 양을 조사하였다.
- 이를 확인하기 위하여 acetic acid와 glutamic acid를 각각 첨가한 배양액을 배양시간에 따라 취하여 생산된 ALA의 양을 조사하였다. Glutamic acid가 직접적인 ALA 합성의 기질로 사용된다면 acetic acid를 첨가한 배양액보다 많은 양의 ALA를 지속적으로 생산할 것으로 예상하고 조사한 결과, Fig. 5에서와 같이 glutamic acid를 첨가한 경우 ALA의 최대생산량은 비슷하였지만 acetic acid를 첨가한 경우보다 지속적으로 8시간 이상 합성이 계속되는 것을 확인할 수 있었다.
- Motility test medium에 균을 천자배양하여 2일 내지 3일간에 걸쳐서 배양하면서 운동성 여부를 조사해 본 결과 1-1 균주는 운동성이 있는 것으로 나타났으며, 따라서 1-1 균주를 Bacillus cereusS. 동정하였다.
- sphaeroides를 이용한 ALA 생산에서 Sasaki 등 (34)이 조사한 바로는 중성 범위에서는 ALA synthetase (ALAS) 의 활성이 높으며 반면에 ALA dehydratase (ALAD)의 활성은 낮게 나타났다. 그러나 pH가 8.0에 이르면 반대의 결과를 보이는데 ALAD의 활성이 증가하여 ALA가 tetrapyrrole 생합성에 이용되어 소모되며, 또한 배양액의 pH가 8.0을 넘게 되면 ALA 성분 자체가 불안정해지는 것으로 생각된다.
- 대수기 후기에 16 mM acetic acid를 첨가하고 배양을 계속하면서 최초 접종 후 18시간 만에 측정하였을 때 2 mM의 ALA가 생산되었으며 acetic acid의 첨가량이 적거나 많으면 생산량은 급격히 감소하였다. 미세한 pH의 차이나 첨가된 유기산의 농도 차이가 ALA 합성에 큰 영향을 주는 것으로 추정된다.
- 8에 해당하는 대수기 후기인 접종 후 6시간에 acetic acid를 넣는 경우 ALA가 2 mM로 가장 많이 생산되었고, 첨가시기가 이르거나 늦어지면 생산량은 급격히 감소하였다. 따라서 B. cereus 1-1 균 배양을 시작하여 대수기 후기에 이르렀을 때 배지의 pH를 측정하면서 pH 6.8에 이르렀을 때 acetic acid를 첨가하는 것이 효과적이라고 판단된다.
- 저자들은 Fe2+이 ALA synthetase를 직접적으로 저해하는 것으로 보았는데, 전체적으로 보면 Fe2+이 배지 중의 용존산소를 줄였고 결국 ALA 생산에 산소가 저해요인이었음을 알 수 있다. 본 실험에 사용한 B. cereus 1-1 균주는 호기성 세균이며, 진탕 배양을 통해서 ALA가 효율적으로 생산되는 것으로 미루어 보았을 때 광합성세균과는 달리 C-5 경로에 의하여 ALA를 합성함을 확인할 수 있었다.
- acid, pyruvic acid, sulfuric acid)의 종류를 달리하여 같은 농도로 첨가하였다. 산을 첨가하지 않은 대조군에서는 ALA 가 전혀 생산되지 않았으며, 유기산인 acetic acid 등을 넣었을 때 sulfuric acid를 첨가한 경우보다 5배 이상 많은 양의 ALA가 생산되었다(Fig. 3). 이 결과로 보아 배지의 pH도 중요한 변수가 되지만 유기산이 효과적임을 알 수 있었고, 이는 B.
- 아울러서 C-5 경로에서 glutamate 1-semialdehyde (GSA)로부터 ALA로 전환시키는 효소인 GSA aminotransferase를 특이적으로 저해하는 gabaculine (3-amino-2, 3-dihydrobenzoic acid) 40 pM을 glutamic acid 16 mM과 동시에 첨가하였을 때 ALA 생산이 극히 저하됨을 알 수 있었다. 이것으로 볼 때 B.
- 3). 이 결과로 보아 배지의 pH도 중요한 변수가 되지만 유기산이 효과적임을 알 수 있었고, 이는 B. cereus 1-1 균주가 C-5 경로를 통해 ALA를 생산한다고 가정하였을 때, C-5 경로의 처음 단계에서 필요한 glutamic acid를 공급해 주는 과정에서 aminotransferase의 기질로 유기산이 이용됨을 시사하는 결과이다.
- 극히 저하됨을 알 수 있었다. 이것으로 볼 때 B. cereus 1-1 균주의 ALA 합성은 다른 Bacillus 속에서 보고된 것(10, 26) 과같이 C-5경로를 통하는 것으로 결론지을 수 있었다. 한편 광합성세균 R.
- spSemides의 경우에는 ALA 합성에 산소가 해로우며, 산소를 제거하였을 때 ALA 생산이 증가된다는 보고(15)와 배지 내에 Fe2+의 농도가 높을 때는 적게 생산되다가, 균 배양에 의해 고갈된 시점에서 ALA가 많이 생산된다는 보고가 있었다(31). 저자들은 Fe2+이 ALA synthetase를 직접적으로 저해하는 것으로 보았는데, 전체적으로 보면 Fe2+이 배지 중의 용존산소를 줄였고 결국 ALA 생산에 산소가 저해요인이었음을 알 수 있다. 본 실험에 사용한 B.
- 1-1 균주를 LB 평판에서 하룻밤 배양하고 API 50 CHB kit> 이용하여 2일 간에 걸쳐 1-1 균주의 다양한 탄수화물에 대한 이용 여부를 판독한 결과는 Table 1과 같다. 전형적인 B. cereus 균과 비교해 본 결과 mannose, sucrose, cellobiose에 대한 이용능에서 차이가 나는 것으로 나타났으며, 이 자료를 Biomerieux 회사(www.biomerieux. com)에서 제공하는 Apiweb을 통하여 분석한 결과 B. cereus의 가능성은 51.9%로, 그리고 B. mycoides는 46.6%로 나타났다. B.
- 1). 접종 13시간 만에 최대 생장을 보이며 접종 후 1시간에서 6시간에 걸쳐 대수적 생장을 보이는 것이 나타났다. 균이 생장하면서 배지의 pH는 7.
- 접종 후 18시간이 경과하면 이미 균은 정지기를 넘어 사멸기에 이를 것으로 판단되며, 세포내에 농축되었던 ALA가 배양액으로 용출되거나, 세포내에서 비정상적으로 과량의 ALA가 생산되어 배지로 방출되는 것으로 보인다. 실제로 광합성 세균 R.
- 한편 acetic acid를 첨가하는 시점에 따른 배양액 pH와 이 배양액에서의 ALA 생산을 연관시켜 보면, 균 생장의 대수기 초기에 acetic acid를 넣었을 때에는 낮은 농도의 ALA가 생산되었으며, 배지의 pH가 떨어졌다가 상승하여 pH 6.8에 해당하는 대수기 후기인 접종 후 6시간에 acetic acid를 넣는 경우 ALA가 2 mM로 가장 많이 생산되었고, 첨가시기가 이르거나 늦어지면 생산량은 급격히 감소하였다. 따라서 B.
후속연구
- cereus 1-1 균의 ALA 생산에는 배양 초기에 glucose를 첨가하는 것이 효과적이며, 균이 생장하여 대수기 후기에 이르렀을 때 acetic acid를 16 mM 첨가하여 배양을 계속하면 ALA가 최대 2 mM까지 생산되었는데 이는 C-5 경로를 통하여 이utamic acid로부터 ALA를 생산하는 다른 세균들(36)에 비하면 대단히 많은 양이며, C-4 경로를 통하여 ALA를 생산하는 광합성세균의 배양조건을 최적화시킨 경우(32, 33)의 절반에 해당하는 농도를 생산한 것으로 더 이상의 유전적 재조합을 거치지 않고도 산업적으로 ALA를 생산할 수 있는 정도이다. ALAD의 저해제인 levulinic acid를 주가로 첨가한다면 더욱 많은 양의 ALA를 생산할 것으로 기대한다.
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