본 연구에서는 기능성 식품 첨가물 소재 또는 의약품으로 사용 가능한 한천올리고당의 대량생산을 위하여 agarase 생산균주인 Bacillus cereus ASK202에 대해 유전자 cloning 방법을 이용하여 한천분해효소 고생산성 균주로의 개발을 시도하였다. 원균주의 chromosomal DNA를 무작위적으로 절단하여 agarase를 생산하는 gene 부위를 선별한 결과, 83,300 Da의 agarase(Eba1)를 생산하는 재조합 균주 E. coli BL21(DE3)/pEBA1를 얻을 수 있었다. E. coli BL21(DE3)/pEBAl에서 유도물질로 IPTG를 첨가한 후 induction 5시간 후에 agarase가 원균주에 비해 8배 증가한 양이 고발현되었다. 발현된 agarase는 Asx(Aspartic acid, Asparagine), Glycine와 같은 산성 아미노산의 함량과 Alanine과 같은 중성 아미노산의 함량이 높았으며, pH 5.6, $40^{\circ}C$에서 최적의 활성을 나타내었다. 최적 기질 agar에 대한 $K_m$과 $V_{max}$값은 0.068 mg/$m{\ell}$과 0.094mg/$m{\ell}{\cdot}min$으로 한천의 ${\beta}$-결합을 자르는 ${\beta}$-agarase로 판명되었다.
본 연구에서는 기능성 식품 첨가물 소재 또는 의약품으로 사용 가능한 한천올리고당의 대량생산을 위하여 agarase 생산균주인 Bacillus cereus ASK202에 대해 유전자 cloning 방법을 이용하여 한천분해효소 고생산성 균주로의 개발을 시도하였다. 원균주의 chromosomal DNA를 무작위적으로 절단하여 agarase를 생산하는 gene 부위를 선별한 결과, 83,300 Da의 agarase(Eba1)를 생산하는 재조합 균주 E. coli BL21(DE3)/pEBA1를 얻을 수 있었다. E. coli BL21(DE3)/pEBAl에서 유도물질로 IPTG를 첨가한 후 induction 5시간 후에 agarase가 원균주에 비해 8배 증가한 양이 고발현되었다. 발현된 agarase는 Asx(Aspartic acid, Asparagine), Glycine와 같은 산성 아미노산의 함량과 Alanine과 같은 중성 아미노산의 함량이 높았으며, pH 5.6, $40^{\circ}C$에서 최적의 활성을 나타내었다. 최적 기질 agar에 대한 $K_m$과 $V_{max}$값은 0.068 mg/$m{\ell}$과 0.094mg/$m{\ell}{\cdot}min$으로 한천의 ${\beta}$-결합을 자르는 ${\beta}$-agarase로 판명되었다.
An agarase gene from Bacillus cereus ASK202 was expressed in high levels by E. coli BL21(DE3)/pEBA1 using pET28a(+) vector system with the inducible T7 promoter in the presence of isopropyl- ${\beta}$ -thiogalactopyranoside. The open reading frame encodes 761 amino acid residues with a ca...
An agarase gene from Bacillus cereus ASK202 was expressed in high levels by E. coli BL21(DE3)/pEBA1 using pET28a(+) vector system with the inducible T7 promoter in the presence of isopropyl- ${\beta}$ -thiogalactopyranoside. The open reading frame encodes 761 amino acid residues with a calculated molecular weight of 83,300 daltons and a potential signal peptide about 36 amino acid residues at the N-terminus. E. coli BL21(DE3)/pEBA1 produce 1280 unit/ ${\ell}$ of agarase. The optimum physical condition for the agarase activity was pH 5.6, and $40^{\circ}C$, respectively. The agarase activity was stable up pH $4.0{\sim}9.0$ and $4{\sim}40^{\circ}C$. The km and maximum rate of metabolism for agar were 0.068mg/$m{\ell}$ and 0.094mg/$m{\ell}{\cdot}min$, respectively.
An agarase gene from Bacillus cereus ASK202 was expressed in high levels by E. coli BL21(DE3)/pEBA1 using pET28a(+) vector system with the inducible T7 promoter in the presence of isopropyl- ${\beta}$ -thiogalactopyranoside. The open reading frame encodes 761 amino acid residues with a calculated molecular weight of 83,300 daltons and a potential signal peptide about 36 amino acid residues at the N-terminus. E. coli BL21(DE3)/pEBA1 produce 1280 unit/ ${\ell}$ of agarase. The optimum physical condition for the agarase activity was pH 5.6, and $40^{\circ}C$, respectively. The agarase activity was stable up pH $4.0{\sim}9.0$ and $4{\sim}40^{\circ}C$. The km and maximum rate of metabolism for agar were 0.068mg/$m{\ell}$ and 0.094mg/$m{\ell}{\cdot}min$, respectively.
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문제 정의
본 연구에서는 기능성 식품 첨가물 소재 또는 의약품으로 사용 가능한 한천올리고당의 대량생산을 위하여 agarase 생산균 주인 Bacillus cereus ASK202에 대해 유전자 cloning 방법을 이용하여 한 천분해효소 고 생산성 균주로의 개발을 시도하였다. 원균주의 chromosomal DNA를 무작위적으로 절단하여 agarase를 생산하는 gene 부위를 선별한 결과, 83, 300 Da의 agarase(Ebal)를 생산하는 재조합 균주 E.
에서키고, 생산되는 효소를 분리. 정제하여 그 특성에 관하여 조사하였다.
제안 방법
BamH. I -Hzndin 제한 효소 인식 부위를 가지는 PCR product가 삽입 된 plasmid를 pEBAl이라 명명하고, 숙주세포로 T7 RNA polymerase# 가지고 있는 E. coli BL21(DE3)에서 새로이 제조한 발현 벡터를 transformation 시켰다.
재조합 plasmid 제작에사용된 pUC19 vector.로는 agarase의 대량 생산을 유도할 수 없으므로 PCR을 이용하여 pBA41에서 agarase 만을 coding하고 있는 open reading frame 2.3kb를 증폭하여 T7 promoter를 갖는 pET28a(+)와 재조합하여 E. coli BL2KDE3)에서 고발현실험을 수행하였다(Fig. 1).
coli JM83을 ampicillin, X-gal, IPTG가 첨가된 LB 한천평판배지 (LAXI)에 도말하여, 37℃에서 16시간 배양하였다. 흰 colony로 1차적으로 선별하고, 1차 선별된 21,000개 가량의 colony를 lysozyme을 함유하는 soft agar로 overlay총卜 여 37C에서 12시간 반응 시켜 cell 내부의 enzyme을 밖으로 유출시킨 후, Gran's iodine solution (0.05 M Iodine in 0.12 M Potassium Iodide)을 부어 한천이 분해될때 나타나는 clear zone을 확인하였다(E. coli JM83/pBA41). 재조합 plasmid 제작에사용된 pUC19 vector.
성능/효과
DNA 염기 배열로부터 추정한 아미노산 조성을 분석한 결과, Asx(Aspartic acid, Asparagine), Glycine와 같은 산성 아미노산의 함량과 Alanine 와 같은 중성 아미노산의 함량이 많은 반면, Histidine, Methionine, Cysteine 등은 함유량이 적은 것으로 나타났다. 또한, N-terminal 부위에 amino acid 36개 정도의 hydrophobic 한 potential signal sequence가 있는 것으로 예상되었다.
E. coli BL21(DE3)/pEBAl에서 발현된 agarase를 His - binding kit를 이용하여 분리 정제한 결과, 83.3kDa의 단일 band를 얻을 수 있었다. 12 배양액을 원심분리하여 얻어낸 균체를 sonication 하면 1280니nit가 생산되었으며 최종적으로 분리 .
coli BL21(DE3)/pEBAl에서 유도물질로 IPTG를 첨가한 후 induction 5시간 후에 agarase가 원균주에 비해 8배 증가한 양이고발현되었다. 발현된 agarase는 Asx(Aspartic acid, Asparagine), Glycine와 같은산성 아미노산의 함량과 Alanine과 같은 중성아미노산의 함량이 높았으며, pH 5.6, 40C에서 최적의 활성을 나타내었다. 최적기질 agar에 대한 km과 Vmax 값은 0.
생산되는 agarase의 분비위치를 정확하게 판단하기 위하여 plate 상에 colony를 배양한 후 lysozyme이 함유되지 않은 soft agar를 처리한 colony 주위에는 투명한 환이전혀 형성되지 않았으나(Fig. 2-1), lysozyme으로 세포벽을 파쇄한 경우 pEBAl plasmid를 함유하는 colony 주위에 큰 환이 형성되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2-2). 또한 액체 배양한 균체를 sonication 한 실험에서도 intracellular 부분에 96% 이상 대부분의 agarase가 존재하고 있는 것으로 나타났다.
시도하였다. 원균주의 chromosomal DNA를 무작위적으로 절단하여 agarase를 생산하는 gene 부위를 선별한 결과, 83, 300 Da의 agarase(Ebal)를 생산하는 재조합 균주 E. coli BL21(DE3)/pEBAl를 얻을 수 있었다. E.
또한, N-terminal 부위에 amino acid 36개 정도의 hydrophobic 한 potential signal sequence가 있는 것으로 예상되었다. 이 signal sequence N-말단에양전하를 띤 Lysine이 존재하고 있었으며 helix destabilizing 아미노산인 Proline과 Glycine이 중간중간 4개 존재하는 hydrophobic core가 연속되어 있는 것을 관찰할수 있었다(Fig. 3).
0에서 24시간 방치하여도 효소 활성이 100% 유지되는 것으로 나타났다. 정제된 Ebal는 agar에 대해 가장 높은 기질 특이성을 가지고있으며, 기질 친화력을 측정한 결과 Michaelis constant (km) 값은 0.068 mg/m2 였으며, Vmax값은 0.094 mg/mH . min인 것으로 확인되었다.
효소는 40℃, pH 5.6, 10 mM citric acid-sodium citrate buffer에서 최대활성을 가지며, 4~40℃ 범위, pH 4.0~9.0에서 24시간 방치하여도 효소 활성이 100% 유지되는 것으로 나타났다. 정제된 Ebal는 agar에 대해 가장 높은 기질 특이성을 가지고있으며, 기질 친화력을 측정한 결과 Michaelis constant (km) 값은 0.
후속연구
이러한 특성은, 원 균주 Bacillus cereus ASK202와 mutant 균주 Bacillus cereus ASK202-N3 유래의 agarase 와 다른 결과로, 원 균주는 적어도 3가지 이상의 agarase를 생산하는 것으로 추정되어지며, 앞으로 이들의 발현기작에 대해 깊이 있는 연구가 필요할 것으로 사료되어진다.
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