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문제 정의
- Berberine은 퇴행성뇌질환 후보치료물질로 인식되고 있으나, 아직까지 퇴행성 뇌질환에서의 정확한 효능이나 구체적인 작용기전에 대한 연구는 되어있지 않다. 따라서 본 연구에서는 berberine이 LPS 자극에 의해 활성화된 신경소교세포인 BV2 세포로부터 생성되는 염증매개물질인 NO, PGE2, proinfla mmatoiy cytokine의 생성억제효과 및 그 조절작용을 조사함으로써 berberine의 항염증효과를 검증하고, 나아가 퇴행성뇌질환 치료제로서의 개발 가능성을 평가하고자 수행하였다.
- 및 항염.항암효과가 탁월 한 것으로 보고되면서 치료제 개발에 주요 관심 대상이 되고 있다20翎 이에 저자는 이전 연구에서34) 황련의 분획에 따른 퇴행성 뇌질환의 항염증효과를 확인하였으며 본 연구에서는 황련의 주성분인 berberine의 퇴행성 뇌질환치료 가능성을 조사하고자 쥐의 뇌신경소교세포주인 BV2 세포로부터 생성되는 염증매개물질들에 대한 berberine의 억제효과를 조사하였다.
- 본 연구에서는 퇴행성 뇌질환 치료를 위한 항염증 한약성분을 개발하기 위해서 신경소교세포인 BV2 세포를 이용하여 berberine의 항염증 효과를 조사하였다. Berberine은 50pM/ml 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으며, LPS에 의해 유도된 염증 매개 물질인 NO, PGE2 및 TNF-a, IL-邙의 생성을 처리농도에 의존적이고 유의적으로 감소시켰다.
제안 방법
- 이를 microplate reader(Molecular Devices) 를 이용하여 550-600nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 무처리군의 세포생존도 (cell viability) 100%를 기준으로 berberine 처리군의 상대적인 세포 생존 도를 계산하였다.
- 세포로부터 생성되는 NO의 양은 세포 배양액 중 존재하는 NO2-의 형태를 Griess 시약반응을 이용하여 측정하였다. '즉, BV2 세포를 1x105 cells/ml로 24-well plate에 하룻밤 배양한 후 berberine을 여러 농도로 처리하여 다음 30분간 배양하고 다시 LPS(1 屿/M)를 처리하여 24시간 배양함으로써 세포 활성화를 유도하였다.
- 세포로부터 배양액을 수거한 후 PGE2 EIA kit(Cayman Chemical Company, MI, US A) 를 이용하여 PGE2 양을 측정하였다. 생성된 PGE2의 양은농도 (pg/ml) 는 PGE2 EIA standard를 기준으로 환산하여 계산하였다.
- BV2 세포로부터 생성되는 염증사이토카인(proinfl ammatory cytokine) 인 TNF-a와 ILTP의 양을 즉정하기 위하여 세포를 1x105 cells/ml로 24-well plate에 하룻밤 배양한 후 berberine을 여러 농도로 처리하여 다음 30분간 배양하고 다시 LPS(lWml)를 처리하여 24시간 배양함으로써 세포 활성화를 유도하였다. 세포로부터 배양액을 수거한 후 Ready-Set -Go mouse TNF-a/IL-iP Cyto-SetsTM Biosource ELISA kits를 이용하여 측정하였다.
- 세포로부터 배양액을 수거한 후 Ready-Set -Go mouse TNF-a/IL-iP Cyto-SetsTM Biosource ELISA kits를 이용하여 측정하였다. 생성된 TNF-a 와 ILT。의 양은 각 recombinant cytokine 표준단백질의 흡광도를 기준으로 농도(pg/M)를 계산하였다.
- iNOS, COX-2 및 염증사이토카인들의 유전자 발현을 조사하기 위해 각 세포(M06cells/ml)를 6-wel 1 plate에 배양하고 berberine을 농도별로 30분간 전처리한 후 LPS(1 昭/ml)를 처리하여 6시간 동안 배양한 후 세포를 수거하였다. 세포로부터 TRIzol 용액 (Invitrogen)을 이용하여 total RNA를 분리한 후, oligo-(dT) primer와 Improm-IITM reverse transcri ptase(Promega Bioscience, San Luis Obispo, USA) 를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 후 세포를 수거하였다. 세포로부터 TRIzol 용액 (Invitrogen)을 이용하여 total RNA를 분리한 후, oligo-(dT) primer와 Improm-IITM reverse transcri ptase(Promega Bioscience, San Luis Obispo, USA) 를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 1 碍에 및 iNOS, COX-2, TNF-a, 丄-邛에 대한 각 specific primers(sence, anti-sence)를 넣은 후 10x buffe (lOmM Tris-HCl, pH 8.
- 세포로부터 TRIzol 용액 (Invitrogen)을 이용하여 total RNA를 분리한 후, oligo-(dT) primer와 Improm-IITM reverse transcri ptase(Promega Bioscience, San Luis Obispo, USA) 를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 1 碍에 및 iNOS, COX-2, TNF-a, 丄-邛에 대한 각 specific primers(sence, anti-sence)를 넣은 후 10x buffe (lOmM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KC1, 0.1% Triton X-100), 250uM dNTP, 1U Tag polymerase 등을 혼합하여 denaturation을 위해 94oC에서 30초, anne aling을 위해 55-60oC에서 50초 및 extension을 위해 70oC에서 60초 조건에서 25-30 cycles로 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조군로 GAPDH를 사용하였다.
- iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 조사하기 위해각 세포(lxl06cells/ml)를 6-well plate에 배양하고 berberine을 농도별로 30분간 전처리한 후 LPSC比g/ ml)를 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포를 수거하였다. 세포를 수거하여 lx ice-cold PBS로 두 번 세척한 다음 lysis buffer(lM Tris-HCl, 5M NaCl, 0.
- 5% Triton XT00, protease inhibitor cocktail) 100 M를 넣어 세포를 lysis시켰다. 이를 14, 000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수한 후 Bradford 용액과 BSA 표준용액을 이용하여 단백질 양을 정량하고 20“g의 단백질을 10% polyacrylamide gel을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 전기영동 후 gel을 분리하여 nitrocellulose(NC) membrane에 옮기고 5% skim milk 로 실온에서 1시간 동안 blocking 시켰다.
- 다음날 membrane을 TBS-T 용액으로 3 회 세척하고 TBS-T로 희석된(1:5000) horseradish peroxidase- conjugated 이차항체를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 TBS-T로 3회 세척한 다음 enhanced chemiluminescence detection system 을 이용하여 X-ray film에 감광시켰다. 각 단백 질의발현에 대한 대조군으로 actin에 대한 일차항체 (Sigma)를 이용하여 위와 동일한 방법으로 Western blot을 수행하였다.
- Berberine의 세포독성을 조사하기 위해서 BV2 세포에 10〜20g/ml의 berberine을 처리한 후 MTT assay를 수행하였다(그림 1).
- Berberine이 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해서 세포에 여러 농도의 berberine을 처리한 다음, 세포배양액으로부터 NO 양을 Griess reagent로 측정하였다(그림 2).
- 한편, berberine이 NO 생성효소인 iNOS의 유전자 및 단백질 발현에도 억제효과를 나타내는지 확인하기 위하여 여러 농도의 berberine을 BV2 세포에 처리한 다음, RT-PCR(그림 2B) 및 Western blot을 수행하였다(그림 2C).
- Berberine이 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 PGE2 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해서 세포에 여러 농도의 berberine을 처리한 다음, 세포배양액으로부터 PGE2 양을 EIA kit로 측정하였다(그림 3).
- Berberine이 PGE2 생성효소인 COX-2의 유전자 및 단백질 발현에도 억제효과를 나타내는지 확인하기 위하여 여러 농도의 berberine을 BV2 세포에 처리한 다음, RT-PCK그림 3B) 및 Western blot을 수행하였다(그림 30.
- Berberine이 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는염증사이토카인인 TNF-a와 IL-1P 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해서 여러 농도의 berberine을처리한 다음, 세포배양액으로부터 TNF-a와 IL-1P 양을 ELISA로 측정하였으며, 유전자발현을 RT-PC 日로 조사하였다(그림 4).
- 1% Triton X-100), 250uM dNTP, 1U Tag polymerase 등을 혼합하여 denaturation을 위해 94oC에서 30초, anne aling을 위해 55-60oC에서 50초 및 extension을 위해 70oC에서 60초 조건에서 25-30 cycles로 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조군로 GAPDH를 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 berberine은 황련으로부터 분리된 것을 서울대학교 천연 물연구소로부터 제공받았다. LPS(E.
- (San Diego, CA, USA), iNOS와 COX-2 항체를 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA), Horseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG 를 Sigma 로부터 구입하였다. ECL Western blotting detection reagent는 Amersham(Buckingha m아!底, UK)으로부터 구입하였다.
- (Santa Cruz, CA), Horseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG 를 Sigma 로부터 구입하였다. ECL Western blotting detection reagent는 Amersham(Buckingha m아!底, UK)으로부터 구입하였다.
- 생쥐의 뇌신경소교세포 (mouse microglial cell line) 인 BV2 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, GibcoBRL, Invitrogen Life Technology, MD, USA), 1% penicillin(GibcoBRL) 및 streptomycin (GibcoBR L)이 포함된 DMEM 배지(Hyclone, UT, Canada) 에서37°C, 5% C02 조건으로 배양하였다.
데이터처리
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균土평균표준오차 (standard error of mean; SEM)로 나타내었으며 통계학적 분석은 Graphpad Prism program의 Student t-test로 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 이를 다시 TBS-T로 3회 세척한 다음 enhanced chemiluminescence detection system 을 이용하여 X-ray film에 감광시켰다. 각 단백 질의발현에 대한 대조군으로 actin에 대한 일차항체 (Sigma)를 이용하여 위와 동일한 방법으로 Western blot을 수행하였다.
성능/효과
- BV 세포에서 berberine 처리에 의한 세포생존도 (cell viability)는 무처리군의 세포생존도 100%를 기준으로 10tzg/ml, 20“g/찌, 50昭/찌, 100您/끼 및 200 昭/ml 농도에서 각각 95.3±0.15%(mean±SEM), 97.3±1.14%, 95.6+0.51%, 84.9±0.55% 및 53.6+2.53% 로 측정되었다. 즉, BV2 세포에서는 50㈤/ml의 berberine 농도까지 90% 이상의 세포생존도를 나타내어 독성이 없는 것으로 나타났다.
- 53% 로 측정되었다. 즉, BV2 세포에서는 50㈤/ml의 berberine 농도까지 90% 이상의 세포생존도를 나타내어 독성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 이후 berberine의 항염효과에 대한 모든 실험은 50 昭/찌이하의 농도에서 수행하였다.
- 42iiM 농도로 현저히 증가하였다 (그림 2A). 또한 berberine 처리농도 lug/ml, 5昭/ml, 10Kg/ml, 20昭/ml 및 50傾/ml 에서 각각 35.6+0.2211M, 29.5+0.49iiM, 16.2±0.68pM, 6.9±0.42pM 및 5.3±0.0如 M 농도로 NO가 검출되어 LPS에 의해 유도된 NO 생성이 berberine 처리농도에 의존적이고 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 특히 berberine 농도 20妇0과 50昭/ml을 처리하였을 때 활성화된 BV2 로부터 NO의 생성이 대조군 수준으로 억제되는 것을 알 수 있었다.
- 0如 M 농도로 NO가 검출되어 LPS에 의해 유도된 NO 생성이 berberine 처리농도에 의존적이고 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 특히 berberine 농도 20妇0과 50昭/ml을 처리하였을 때 활성화된 BV2 로부터 NO의 생성이 대조군 수준으로 억제되는 것을 알 수 있었다. Berberine의 단독처리는 NO 생성에 영향을 주지 않았다(data not shown).
- LPS 처리 후 현저히 증가하였다. 또한 LPS에 의해 유도된 iNOS의 유전자 및 단백질 발현은 berberine 처리 후 농도 의존적으로 억제되었다. 따라서 berberine에 의한 활성화된 BV2로부터의 NO 의 생성 억제효과는 iNOS의 유전자 전사단계의 조절(post-transcriptional gene regulation)로부터 이루어짐을 알 수 있었다.
- 또한 LPS에 의해 유도된 iNOS의 유전자 및 단백질 발현은 berberine 처리 후 농도 의존적으로 억제되었다. 따라서 berberine에 의한 활성화된 BV2로부터의 NO 의 생성 억제효과는 iNOS의 유전자 전사단계의 조절(post-transcriptional gene regulation)로부터 이루어짐을 알 수 있었다.
- 49pg/ml 농도로 증가하였다 (그림 3A). 또한 berberine 처리농도 5ug/ml, 10yg/nil, 20(®/ml 및 50昭/ml에서 각각 1229.0±0.51卩 M, 949.4±20.51pM, 649.4+20.51uM, 511.9±30.16pM 및 375.2+4.63uM 농도로 PGE2가 검출되어 LPS에 의해 유도된 PGE2 생성이 berberine 처리농도에 의존적이고 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 한편, Berberine의 단독처리는 PGE2 생성에 영향을 주지 않았다(data not shown).
- 또한 LPS에 의해 유도된 C0X-2의 유전자 및 단백질 발현은 berberine 처리 후 현저히 감소하였다. 따라서 berberine에 의한 활성화된 BV2로부터의 PGE2의생성 억제효과는 NO/iNOS에서와 마찬가지로 C0X- 2의 유전자 전사단계의 조절로부터 이루어짐을 알 수 있었다.
- 또한 LPS에 의해 생성된 두 염증사이토카인 모두 berberine 처리농도에 의존적이고 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다.
- 한편, berberine은 BV2세포에서 LPS에 의해 유도된 TNF-a와 IL-16의 유전자 발현을 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났다(그림 4C). 따라서 berberi ne에 의한 활성화된 BV2로부터의 TNF-a와 IL-1P 의 생성억제효과는 이들 유전자의 전사단계 조절에 의해 나타남을 알 수 있었다.
- 먼저, 활성화된 BV2 세포로부터 생성되는 염증 물질인 NO에 대한 berberine의 억제효과를 조사한 결과, beberine 처리 농도에 의존적으로 NO 생성이 억제되는 것을 확인하였다(그림 2A). 활성산소종인 NO는 일반적으로 대식세포 및 간세포에서 L-argini ne으로부터 NO 합성경로(NO synthase pathway; NOS)를 통해 iNOS에 의해 합성되는 작은 분자량의 자유라디칼(free radical)로서 세포내 항상성 유지, 신경전달물질 운반, 항암작용 및 세포독성 등에 관여하는 신호전달자로서, 특히 LPS나 interferon-gam madFN-y), P-amyloid 등의 자극으로 활성화된 대.
- N。는 전염증성(pro-in由animation) 또는 항염증성(anti-inflammation) 기능을 동시에 하는 것으로 알려져 있으나, 생체 내 과도한 NO 생성은 오히려 세포를 파괴하고 shock에 의한 혈관 확장 및 염증반응을 촉진하여 조직에 독성으로 작용하여 손상을 유발하게 된다. 따라서 본 연구결과를 통해 iNOS 발현을 차단함으로써 NO 생성을 억제시킬 수 있는 berberine이 다양한 염증성 질환치료에 매우 효과적일 수 있음을 알 수 있었다. 비록 천연물의 iNOS 생성에 대한 세포기전이 정확히 밝혀져 있지는 않지만, NO 생성을 억제하는 약물의 경우 전처리가 iNOS promoter activity를 억제하거나 iNOS 유전자의 전사(transcription)를 억제하는 것으로 알려져 있다30>.
- 될 수 있다. 본 연구에서 berberine은 활성화된 BV2 세포로부터 생성되는 PGE2를 효과적으로억제시켰으며(그림 3A), 나아가 COX-2의 유전자 및 단백질 발현을 현저히 감소시켰다. 즉, berberine이 COX-2의 발현(그림 3B, C)을 차단함으로써 PGE2 생성을 감소시키는 것으로 나타났으며 이는 berberi ne이 염증질환 치료에 효과적일 수 있음을 알 수 있다.
- 본 연구에서 berberine은 활성화된 BV2 세포로부터 생성되는 PGE2를 효과적으로억제시켰으며(그림 3A), 나아가 COX-2의 유전자 및 단백질 발현을 현저히 감소시켰다. 즉, berberine이 COX-2의 발현(그림 3B, C)을 차단함으로써 PGE2 생성을 감소시키는 것으로 나타났으며 이는 berberi ne이 염증질환 치료에 효과적일 수 있음을 알 수 있다.
- 결론적으로 본 연구를 통해 berberine은 LPS에 의해 활성화된 microglia로부터 과도하게 생성되는 NO, PGE2 등의 염증매개물질 및 TNF-a, IL-邙 와 같은 염증사이토카인을 iNOS, COX-2 및 염증사이토카인들의 유전자 발현단계의 조절을 통해 효과적으로 억제시킬 수 있는 것으로 나타났다. 즉, berberi ne은 신경소교세포에 대해 강력한 항염증 효과를 나타내는 성분으로서, 차후 단독 또는 기타 약물과의 혼합을 통해 차후 퇴행성뇌질환의 염증개선을 위한 치료제로 개발 가능할 것으로 기대된다
- Berberine은 50pM/ml 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으며, LPS에 의해 유도된 염증 매개 물질인 NO, PGE2 및 TNF-a, IL-邙의 생성을 처리농도에 의존적이고 유의적으로 감소시켰다. 또한 berberine에 의한 이들 염증매개물질의 생성 억제는 iNOS, COX-2 및 염증사이토카인의 유전자 및 단백질 발현 감소에 의한 것으로 나타났다.
- Berberine은 50pM/ml 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으며, LPS에 의해 유도된 염증 매개 물질인 NO, PGE2 및 TNF-a, IL-邙의 생성을 처리농도에 의존적이고 유의적으로 감소시켰다. 또한 berberine에 의한 이들 염증매개물질의 생성 억제는 iNOS, COX-2 및 염증사이토카인의 유전자 및 단백질 발현 감소에 의한 것으로 나타났다. 따라서 berberine은 활성화된 신경소교세포로부터 염증 매개 물질 생성을 효과적으로 억제시킴으로써 강력한 항염증 효과를 나타내었으며, 이는 berberine이 퇴행성 뇌 질환 치료를 위한 약물로 이용되어질 수 있음을 시사한다.
- 또한 berberine에 의한 이들 염증매개물질의 생성 억제는 iNOS, COX-2 및 염증사이토카인의 유전자 및 단백질 발현 감소에 의한 것으로 나타났다. 따라서 berberine은 활성화된 신경소교세포로부터 염증 매개 물질 생성을 효과적으로 억제시킴으로써 강력한 항염증 효과를 나타내었으며, 이는 berberine이 퇴행성 뇌 질환 치료를 위한 약물로 이용되어질 수 있음을 시사한다.
후속연구
- 억제시킬 수 있는 것으로 나타났다. 즉, berberi ne은 신경소교세포에 대해 강력한 항염증 효과를 나타내는 성분으로서, 차후 단독 또는 기타 약물과의 혼합을 통해 차후 퇴행성뇌질환의 염증개선을 위한 치료제로 개발 가능할 것으로 기대된다
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