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문제 정의
- 있는지 확인해 보고자하였다. 따라서 지금까지 보고되지 않은 나이에 따른 피부세포 특히 노화된 피부세포 및 이에 자외선을 조사하여 제니스테인이 세포의 활성 , type I pN 콜라겐의 합성에 어떤 영향을 미치는가와 MMP-1의 합성에 미치는 영향에 대해서 조사하여 비타민 A와 같이 자연 노화를 억제할 수 있는지에 대해 알아보았다.
- 본 실험에서는 연령별로 제니스테인이 MMP-1의 합성에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였으며 그 결과는 Fig. 6에 나타내었다. 0세, 22세, 39세 및 54세의 여성 엉덩이 피부 섬유아세포에서 MMP-1의 합성량을 비교하여 보면, 0세와 22세의 세포에서 MMP-1의 합성은 39세, 54세에 비해 매우 낮은 수준이었다.
- 본 연구에서는 화장품에 첨가하여 피부미용제로 사용하고 있는 이소플라본 중 특히 효과가 가장 크다고 생각되는 제니스테인에 대하여 피부미용 효과 특히 비타민 A와 같은 효과가 있는지 확인해 보고자하였다. 따라서 지금까지 보고되지 않은 나이에 따른 피부세포 특히 노화된 피부세포 및 이에 자외선을 조사하여 제니스테인이 세포의 활성 , type I pN 콜라겐의 합성에 어떤 영향을 미치는가와 MMP-1의 합성에 미치는 영향에 대해서 조사하여 비타민 A와 같이 자연 노화를 억제할 수 있는지에 대해 알아보았다.
- 36]. 섬유아세포에 UVA의 조사로 인해 콜라겐 합성이 감소되는 것을 제니스테인이 얼마나 방어하는지 알아보았다. 결과는 Fig.
- 제니스테인이 섬유아세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 알아보았다. 제니스테인에 의한 엉덩이 피부 섬유아세포의 type I pN 콜라겐 합성 정도는 Fig.
제안 방법
- 5와 같다. 0 세와 54세의 여성에게서 얻은 얼굴(광노출 부위)과 엉덩이 (비노출 부위)의 피부 섬유아세포를 사용하여 콜라겐 매트릭스를 제작하였다. 대조군으로서 54세에서 얻은 세포와 0세에서 얻은 세포의 콜라겐 합성을 비교해보면 54세의 세포는 0세에 비해 기본적으로 type I pN 콜라겐의 합성이 유의하게 적었다.
- 35 mm culture dishes에 섬유아세포를 1 x 105 cells를 seeding한 후 2주간 제니스테인을 lb, M 농도로 넣은 DMEM 배지로 키웠다. 2주 뒤 에 phosphate buffered saline(PBS)으로 wash한 후, 0.2% glutaraldehyde와 2% formaldehyde로 7분간 고정시킨후, 40 mM citric acid/phosphate(pH 6.0), 5 mM K3FeCNg, 5 mM K4FeCN6, 150 mM NaCl과 2 mM MgCh에 1 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl P-D-galactopyranoside 이 되도록 녹인 용액을 CO2가 없는 37℃에서 24시간 둔 후, 파란색으로 염색된 세포들을 광학현미경으로 관찰하고 사진 촬영을 하였다.
- 2에 나타내었다. Fig. 1에서 대조군으로서 여러 연령층에서 분리된 섬유아세포의 세포 성장을 알아보기 위해, 제니스테인을 처리하지 않고 세포 분열정도를 측정하였다. 나이가 증가됨에 따라서 0세를 100%로 하였을 때 22세는 81%, 39세는 75%, 54세는 51%로 세포 증식 이 유의적으로 감소하였다(p<0.
- MMP-I의 합성은 배양된 세포의 배양액을 채취하여 ELISA kit(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 사용하여 측정하였다. 섬유아세포를 24-well multi plate에 well 당 5 x IO"*개 넣고, 10% FBS를 첨가한 DMEM배지에 24시간 배양하였다(pH 7.
- 이후 type I collagenase 용액을 제거한 뒤, 표피를 제거한 후 진피를 수술용 칼로 잘게 조각낸 후 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco BRL, USA) 배지를 넣고, 75 cm2 티슈 플라스크에 정치하였다. 그리고 조각난 티슈에서 세포가 피부 조직 밖으로 배출되어 플라스크 안에서 자라면 이를 회수하여 실험에 사용하였다. 세포는 DMEM 배 지 에, 0.
- 대조군으로서나 이별로 배양된 세포의 콜라겐 합성을 측정한 결과, 나이가 증가함에 따라서 콜라겐의 합성량은 감소하였으며 , 22세, 39세 , 54세의 세포에서 0세와 비교하였을 때 각각 26%, 27%, 62%의 유의적 감소를 보였다. 나이에 따른 제니스테인의 콜라겐 합성능을 측정하기 위해, 제니스테인을 10-5 M로 처리하고 type I pN 콜라겐량을 측정하였다. 각 나이별 세포에 제니스테인을 처리하였을 때, 각각의 비처리군과 비교하여 0세, 22세에서는 약간 증가되는 경향이 보였으나 통계적인 유의차는 없었다.
- 노화로 증가되는 §-galactosidase(Senescence-associated P-galactosidase, SA-p-Gal) 활성은 senescent cell staining kit(Sigma, USA)를 사용하여 염색하였다. 35 mm culture dishes에 섬유아세포를 1 x 105 cells를 seeding한 후 2주간 제니스테인을 lb, M 농도로 넣은 DMEM 배지로 키웠다.
- 실험은 4에서 10계대의 섬유아세포를 사용하였다. 단층배양과 콜라겐 매트릭스에서 배양한 세포를 이용하여 세포 생장과 콜라겐 및 MMP-1의 합성량을 측정하였다[5].
- 실험에 사용된 자외선은 UVA로서 15 J/cn?의 자외선을 CUBE 401 lamp(UVATEC, USA)를 사용하여 조사하였다. 자외선을 조사하기 전에 international light radiometer(IL 1700, Newburyport, MA, USA, calibrated against a spectroradiameter and standard lamp)를 이용하여 자외선 양을 측정하였다.
- 4). 이후 FBS를 첨가하지 않은 DMEM배지에 제니스테인을 100M 농도로 첨가하여 48시간 동안 배양하고 상층액을 회수하였다. 그 후 회수된 상증액을 이용하여 kit에서 제공된 96-well plate에 coating 하고, 4℃에서 overnight방치한 후, TPBS(0.
- 처리하였다. 이후 SA-§-Gat을 염색하여 세포 변화를 측정하였다. 제니스테인을 처리하지 않은 경우는 Fig.
- 조사하였다. 자외선을 조사하기 전에 international light radiometer(IL 1700, Newburyport, MA, USA, calibrated against a spectroradiameter and standard lamp)를 이용하여 자외선 양을 측정하였다. 자외선 조사 전 섬유아세포의 양은 배양 플레이트에 80-90%로 차도록 키웠으며, DMEM 배지를 제거 후 PBS로 2회 씻어주었다[35].
- 제니스테인의 콜라겐 합성 효과를 단층배양을 통해 알아보았으나(Fig. 3, 4), 좀 더 in vivc와 유사한 상황에서 알아보기 위해 [5], 콜라겐 매트릭스를 활용하여 3차원 배양조건에서 콜라겐 합성을 측정하였고 결과는 Fig. 5와 같다. 0 세와 54세의 여성에게서 얻은 얼굴(광노출 부위)과 엉덩이 (비노출 부위)의 피부 섬유아세포를 사용하여 콜라겐 매트릭스를 제작하였다.
- 5 mL씩 추가하여 매트릭스를 유지하였다. 제작된 콜라겐 매트릭스에 제니스테인을 10-5M 농도로 72시간 처리한 후, 배양액을 회수하여 단층배양과 동일한 방법으로 Takara kit을 사용하여 콜라겐 합성량을 측정하였다.
- 한편, 제니스테인이 노화에 의해 증가되는 SA-P-GaH 어떤 영향을 주는지 알아보기 위하여 77세 된 피부의 섬유아세포를 배양 후 제니스테인을 10-7 m로 2주간 처리하였다. 이후 SA-§-Gat을 염색하여 세포 변화를 측정하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 자외선은 UVA로서 15 J/cn?의 자외선을 CUBE 401 lamp(UVATEC, USA)를 사용하여 조사하였다. 자외선을 조사하기 전에 international light radiometer(IL 1700, Newburyport, MA, USA, calibrated against a spectroradiameter and standard lamp)를 이용하여 자외선 양을 측정하였다.
- 48 mg/mL glutamine, 100 IU/mL penicillin, 50 ug/mL streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclon, USA» 첨가한 후 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 실험은 4에서 10계대의 섬유아세포를 사용하였다. 단층배양과 콜라겐 매트릭스에서 배양한 세포를 이용하여 세포 생장과 콜라겐 및 MMP-1의 합성량을 측정하였다[5].
데이터처리
- 모든 자료는 mean ± S.E.로 나타내었고 One-way ANOVA 를 사용하여 통계 처리하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 세포 증식은 Mosmann의 방법 [22]을 사용하였다. 섬 유아세포를 96-well plate에 well당 6xl03개로 깔고 5% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 37℃에서 18시간 동안 정치하였다.
성능/효과
- 6에 나타내었다. 0세, 22세, 39세 및 54세의 여성 엉덩이 피부 섬유아세포에서 MMP-1의 합성량을 비교하여 보면, 0세와 22세의 세포에서 MMP-1의 합성은 39세, 54세에 비해 매우 낮은 수준이었다. 22세는 0세에 비해 약 40%정도 증가되었으나 통계적인 유의차는 없었다.
- 05). 54 세의 얼굴과 엉덩이 두 부위를 비교하면, 얼굴 부위의 세포를 사용한 매트릭스에서 엉덩이의 세포를 사용한 매트릭스에 비해 기본적인 type I pN 콜라겐의 합성량이 18% 적어 유의적인 차이를 보였다. 제니스테인을 10< M로 72시간 처리하였을 때, 엉덩이 세포는 비처리군에 비해서 type I pN 콜라겐의 합성이 21%, 얼굴 세포는 비처리군에 비해 14% 의 유의적 증가를 보였다(p<0.
- 18-29세에 비하여 80세 이상에서는 MMP-1은 40%, MMP-2는 82%, MMP-9은 52% 증가되었다. 80세 이후 피험자에게 1%의 비타민 1르를 7일간 도포하였을 때 , 증가된 MMP-1 및 MMP-9가 다시 18-29세의 수준으로 40% 정도 감소되었다. Kang 등[14]에 의하면 피부에 2 minimal erythema dose의 자외선을 조사하였을 때, 10분 뒤에는 2배, 20분 뒤에는 3 배의 H2O2가 발생하였다.
- 진피와 표피 사이에 많이 염색되는 procollagen의 양도 80세 이후에서는 매우 감소되었다. 80세 이후의 피험자에 비타민 A를 7일간 도포한 결과 대조군에 비하여 type I pN 콜라겐 합성량이 65% 증가하였다. 그리고 제니스테인은 섬유아세포에서 kinase와 상호 작용을 하여 type I pN 콜라겐의 전사 활성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다[35].
- 그리고 54세의 광노출 부위인 얼굴과 비노출 부위인 엉덩이 피부에서 얻은 모두의 세포에서 콜라겐 생성 이 대조군들보다 증가된 것은 제니스테인이 광노화 및 자연노화에 모두 효과적인 것으로 추측할 수 있으며, Fig. 4에서와 같이 나이에 따라 더욱 효과적인 것으로 생각되었다.
- 05). 그리고 본 섬유아세포들에 제니스테인을 처리하였을 때 0세, 22세에서는 MMP-1의 합성량에 차이가 거의 없었으나 39세와 54세의 세포에서는 MMP-1 이 비처리군에 비해 각 42%, 36%로 유의적으로 감소되었다(p<0.05).
- 05). 그리고 얼굴에서 얻은 세포의 type I pN 콜라겐 합성량이 엉덩이에서 얻은 세포에 비해 31%로 유의적으로 적었다. 그러나 0세에서 얻은 세포에서는 제니스테인 처리에 의해 type I pN 콜라겐의 합성이 변화되지 않았다.
- 제니스테인의콜라겐 합성 촉진 작용은 TGF- β 통한 직접적인 작용일수도 있으며, 혹은 콜라겐의 분해효소인 MMP-1의 합성을 억제하여 콜라겐의 분해를 막는 간접적인 효과일 수도 있고 또한 이들의 복합작용일 수도 있다. 그리고 전술과 같이 , 제니스테인의 항산화 활성이나 COX-2 억제에 의한 염증 억제작용이 콜라겐 합성을 촉진할 수 있었을 것으로 생각되었다.
- 1에서 대조군으로서 여러 연령층에서 분리된 섬유아세포의 세포 성장을 알아보기 위해, 제니스테인을 처리하지 않고 세포 분열정도를 측정하였다. 나이가 증가됨에 따라서 0세를 100%로 하였을 때 22세는 81%, 39세는 75%, 54세는 51%로 세포 증식 이 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 이들 세포에 제니스테인을 처리하였을때, 각각 나이의 비처리군과 비교하여 0세에서는 102%, 22 세에서는 107%, 39세에서 105%로 세포 증식이 큰 차이가 없었다.
- 0 세와 54세의 여성에게서 얻은 얼굴(광노출 부위)과 엉덩이 (비노출 부위)의 피부 섬유아세포를 사용하여 콜라겐 매트릭스를 제작하였다. 대조군으로서 54세에서 얻은 세포와 0세에서 얻은 세포의 콜라겐 합성을 비교해보면 54세의 세포는 0세에 비해 기본적으로 type I pN 콜라겐의 합성이 유의하게 적었다. 즉, 54세의 엉덩이에서 얻은 세포는 (서에 비해 type I pN 콜라겐 합성량이 25%, 54세의 얼굴에서 얻은 세포는 0세에 비해 39% 유의적으로 감소하였다(p<0.
- 3과 같다. 대조군으로서나 이별로 배양된 세포의 콜라겐 합성을 측정한 결과, 나이가 증가함에 따라서 콜라겐의 합성량은 감소하였으며 , 22세, 39세 , 54세의 세포에서 0세와 비교하였을 때 각각 26%, 27%, 62%의 유의적 감소를 보였다. 나이에 따른 제니스테인의 콜라겐 합성능을 측정하기 위해, 제니스테인을 10-5 M로 처리하고 type I pN 콜라겐량을 측정하였다.
- 억제할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서 77세의 노화된 섬유아세포에 항산화제인 제니스테인 처리로 세포 노화가 어느 정도 억제되어 SA-P-Gal 활성도가 억제된 것으로 생각되 었다.
- 1에 관한 얘기로, Varani 등의 연구[34]에 의하면 나이에 따라 진피에 존재하는 섬유아세포의 수가 줄어들었으며, 이들 진피를 배양하였을 때, 18-29세의 경우 76%, 80세 이후 피부의 경우 38%로 배양되어 나오는 섬유아세포의 수가 크게 줄었다. 또한 80세 이후의 피검자에게 1% 비타민 A를 7일간 피부에 도포 후 생검하여 섬유아세포 수를 측정하였을 때 , 세포증식 이 3배 이상 유의적으로 증가되었다. Ashcroft 등의 연구(2)에 의하면, 여성이 노화되면서 피부의 상처치유 속도는 감소하며 이런 노화에 의한 변화는 호르몬 보충요법에 의해 회복된다.
- 또한 UVA에 의해 콜라겐 합성이 매우 억제된 상황에서도 합성 증가 효과가 있었으며 , 자연노화가 많이 진행된 세포에서 더욱 효과적임을 알 수 있었다. 이것은 제니스테인의 tyrosine kinase의 저해 효과도 있겠으나 무엇보다 자외선으로 생성되는 pyrimidine dimer의 생성을 광보호 효과로 방지하였기 때문으로 생각되었다.
- 22세는 0세에 비해 약 40%정도 증가되었으나 통계적인 유의차는 없었다. 반면, 39세는 0세에 비해 약 6배, 54세에서는 약 8배 이상 증가되어 노화됨에 따라 MMP-1의 합성량이 매우 증가됨을 알 수 있었다(p<0.05). 그리고 본 섬유아세포들에 제니스테인을 처리하였을 때 0세, 22세에서는 MMP-1의 합성량에 차이가 거의 없었으나 39세와 54세의 세포에서는 MMP-1 이 비처리군에 비해 각 42%, 36%로 유의적으로 감소되었다(p<0.
- 본 실험에서 제니스테인 처리로 54세의 섬유아세포에서 제니스테인 비처리에 비해 세포 증식 이 유의적으로 증가된것을 볼 때, 제니스테인이 비타민 A와 유사하게 자연 노화된 섬유아세포의 증식을 증가시킴을 알 수 있었으며 이런 경향은 젊은 피부에서 추출된 세포에서보다 노화가 진행된 세포에서 명확하게 나타남을 알 수 있었다. 이와 같이 제니스테인이 노화된 세포에서 더욱 세포를 증식시키는 것은 Ashcroft 등의 연구(2)에서와 같이 에스트로겐 유사체로서 성장호르몬 TGF-&분비를 촉진하여 나타난 것으로 보인다.
- 본 실험에서는 섬유아세포에서 MMP-1의 합성이 연령별로 증가되며, 0세와 비교할 때 39세 , 54세에서 매우 큰 차이로 유의적 증가를 보였다.
- 이상의 결과에서 보고된 바와 같이, 제니스테인이 섬유아세포에서 type I pN 콜라겐의 합성을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 또한 UVA에 의해 콜라겐 합성이 매우 억제된 상황에서도 합성 증가 효과가 있었으며 , 자연노화가 많이 진행된 세포에서 더욱 효과적임을 알 수 있었다.
- 그런데 이러한 나이에 따른 MMP-1의 증가도 제니스테인의 처리에 의해 39세와 54세에서와 같이 유의적으로 감소하였으며 그 감소 정도는 in vivo 세서 실험된 비타민 A와 유사한 30-40% 수준[34]이었다. 이상의 결과에서 제니스테인은 젊은 피부에서 MMP-1의 합성에는 큰 영향이 없으나, 노화된 피부에서 매우 증가되는 MMP-1의 합성을 억제하여 피부 노화를 방지할 가능성이 있음을 알 수 있었다.
- 54 세의 얼굴과 엉덩이 두 부위를 비교하면, 얼굴 부위의 세포를 사용한 매트릭스에서 엉덩이의 세포를 사용한 매트릭스에 비해 기본적인 type I pN 콜라겐의 합성량이 18% 적어 유의적인 차이를 보였다. 제니스테인을 10< M로 72시간 처리하였을 때, 엉덩이 세포는 비처리군에 비해서 type I pN 콜라겐의 합성이 21%, 얼굴 세포는 비처리군에 비해 14% 의 유의적 증가를 보였다(p<0.05). 그리고 얼굴에서 얻은 세포의 type I pN 콜라겐 합성량이 엉덩이에서 얻은 세포에 비해 31%로 유의적으로 적었다.
- 대조군으로서 54세에서 얻은 세포와 0세에서 얻은 세포의 콜라겐 합성을 비교해보면 54세의 세포는 0세에 비해 기본적으로 type I pN 콜라겐의 합성이 유의하게 적었다. 즉, 54세의 엉덩이에서 얻은 세포는 (서에 비해 type I pN 콜라겐 합성량이 25%, 54세의 얼굴에서 얻은 세포는 0세에 비해 39% 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 54 세의 얼굴과 엉덩이 두 부위를 비교하면, 얼굴 부위의 세포를 사용한 매트릭스에서 엉덩이의 세포를 사용한 매트릭스에 비해 기본적인 type I pN 콜라겐의 합성량이 18% 적어 유의적인 차이를 보였다.
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