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문제 정의
- 분획물을 대상으로 콜라겐 합성 증진효과를 검색하였으며, EtOAc와 butanol 분획에서 활성이 관찰되었다. 따라서, EtOAc와 butanol 분획물을 대상으로 유효 성분을 분리하고자 하였다. Vacuum liquid chromatography 및 세파덱스 LH-20 column chromatography를 실시하여 Figure 3와 같이 화합물 1과 2를 분리 정제하였다.
- 또한 돌외에서 유효성분을 분리하여 분광학적 기법으로 화학구조를 동정하였고, 분리된 화합물의 활성을 확인하였다. 본 연구를 통하여 돌외 추출물의 피부 주름 개선 효과를 확인하여 기능성 화장품 소재로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 돌외 잎 에탄올 추출물의 콜라겐 (collagen) 생합성 촉진작용에 대하여 검색하였다. 또한 돌외에서 유효성분을 분리하여 분광학적 기법으로 화학구조를 동정하였고, 분리된 화합물의 활성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 주름 개선 활성 물질을 개발하기 위하여 제주 자생 덩굴식물인 돌외(G. pentaphyllum)를 선정하여 추출물을 얻고 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성 촉진 여부를 평가하였다. 평가결과 돌외 에탄올 추출물은 100 µg/mL 농도에서 세포독성 없이 165%의 콜라겐 생성 증가율을 보였다.
제안 방법
- 96-Well plate에 HDFn 세포를 1 × 105개씩 분주하여 24 h 배양한 후, 다양한 농도로 시료를 첨가하였다.
- VLC (10 × 5 cm, silica gel, 20 ~ 40 mash)에서 Hex-EtOAc (0 ~ 100%), EtOAc-MeOH (0 ~ 50%)를 사용하여, 각 용매의 배합비를 5 ~ 10%씩 증감하여 극성을 높이는 방법으로 각 100 mL씩 용출한 후, 각 분획을 TLC로 확인하여 spot 패턴이 비슷한 것들을 모아 총 4개의 분획물(Fr. 1-4)을 얻었다.
- 본 연구에서는 돌외 잎 에탄올 추출물의 콜라겐 (collagen) 생합성 촉진작용에 대하여 검색하였다. 또한 돌외에서 유효성분을 분리하여 분광학적 기법으로 화학구조를 동정하였고, 분리된 화합물의 활성을 확인하였다. 본 연구를 통하여 돌외 추출물의 피부 주름 개선 효과를 확인하여 기능성 화장품 소재로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 6에서 나타난 메틸 피크의경우 down field shift하는 양상을 보이는 것으로 보아 전기음성도가 큰 산소와 결합된 메톡시(methoxy)임을 알 수 있다. 메톡시기의 위치를 확인하기 위하여 2-D NMR인 HMBC 스펙트럼을 분석하였다. 그 결과, C-4’ (δ 150.
- 이후 FBS 가 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체하고, 시료를 첨가하여 24 h 동안 배양하였다. 배양액을 모아서 procollagen type Ⅰ protein synthesis kit를 이용하여 콜라겐 전구체의 C-말단의 양을 측정하였다.
- 분리된 화합물 1과 2를 대상으로 하여 사람 섬유아세포의 프로콜라겐 합성 증가율을 조사하였다.
- 제주에서 채집한 식물인 돌외의 에탄올 추출물로부터 유효 성분을 분리하기 위하여 우선 n-hexane, chloroform, EtOAc, n-butanol로 용매분획을 실시하였다. 분획물을 대상으로 콜라겐 합성 증진효과를 검색하였으며, EtOAc와 butanol 분획에서 활성이 관찰되었다. 따라서, EtOAc와 butanol 분획물을 대상으로 유효 성분을 분리하고자 하였다.
- 0 g을 물에 현탁하여 n-hexane을 가한 다음 잘 흔들고 방치하여 수용액층과 n-hexane층을 얻었다. 수용액층을 다시 chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol 순으로 용매 분획하였다. 각각의 용매 분획물을 감압 농축하여 n-hexane층에서 1.
- 용매분획 후 얻어진 EtOAc 분획물(1.2 g)을 분리 정제하기 위하여 우선 vacuum liquid chromatography (VLC)를 수행하였다. VLC (10 × 5 cm, silica gel, 20 ~ 40 mash)에서 Hex-EtOAc (0 ~ 100%), EtOAc-MeOH (0 ~ 50%)를 사용하여, 각 용매의 배합비를 5 ~ 10%씩 증감하여 극성을 높이는 방법으로 각 100 mL씩 용출한 후, 각 분획을 TLC로 확인하여 spot 패턴이 비슷한 것들을 모아 총 4개의 분획물(Fr.
- 섬유아세포에서 합성된 프로콜라겐은 세포외기질(extracellular matrix)로 분비되어 세포 표면에 존재하는 procollagen peptidase에 의해 C-peptide가 분해되고 고분자화 과정을 거쳐 활성 콜라겐으로 전환된다. 이러한 원리를 이용하여 콜라겐 생성량의 증가는 사람 섬유아세포(HDFn)에 돌외 추출물을 처리하여 procollagen type I C-peptide (PIP)의 함량을 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 Figure 2에 나타나 있다.
- 제주에서 채집한 식물인 돌외의 에탄올 추출물로부터 유효 성분을 분리하기 위하여 우선 n-hexane, chloroform, EtOAc, n-butanol로 용매분획을 실시하였다. 분획물을 대상으로 콜라겐 합성 증진효과를 검색하였으며, EtOAc와 butanol 분획에서 활성이 관찰되었다.
- 화합물 1과 2의 화학 구조는 핵자기공명분광기 (NMR spectroscopy)를 통해 얻어진 스펙트럼을 분석하여 규명되었다. 화합물 1의 1H-NMR 스펙트럼 분석 결과 화학적이동(δ) 7.
- 따라서, 화합물 2는 플라보노이드 배당체인 quercetin 3-O-rutinoside로 동정하였다. 화합물 2의 화학구조 동정은 문헌치와 비교하여 확정하였다[24].
- 평가결과 돌외 에탄올 추출물은 100 µg/mL 농도에서 세포독성 없이 165%의 콜라겐 생성 증가율을 보였다. 활성 성분을 규명하기 위하여 추출물로부터 용매분획 및 크로마토그래피 등의 분리과정을 거쳐 2개의 성분을 분리하였다. 분리된 플라보노이드 배당체 Ombuin 3-O-rutinoside(1) 및 quercetin 3-O-rutinoside(2)는 세포 독성 없이 농도 의존적으로 콜라겐 생성 촉진 활성을 나타내었다.
대상 데이터
- 13C-NMR 스펙트럼에서 화합물 1보다 두 개의 탄소가 적은 총 27개의 탄소 signal이 관측되었다. 1H-NMR과 함께 자세히 분석해 본 결과, 화합물의 1에서 나타나는 두 개의 메톡시피크가 화합물 2에서는 나타나지 않는다.
- 순상 (normal-phased) column chromatography (CC)에는 실리카겔 60 (Merk, 95 - 110 µm, Germany), 세파덱스 LH-20 (sigma, Sweden)을 사용하였다. Thin layer chromatography (TLC)는 실리카겔 60F254 (Merck, Germany)을 사용하였다. 구조 분석에는 FT-NMR (JNM-ECX400, JEOL, Japan)을 사용하였다.
- 구입한 human dermal fibroblast neonatal (HDFn) 세포를 Dulbeco’s modified eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가하여 5% CO2, 37 ℃ 조건하에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용된 돌외(Gynostemma pentaphyllum Makino)는 제주산으로 제주자원식물산업연구소(Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 돌외의 추출과정 및 분획에 사용된 용매들은 시약급을 사용하였다.
- 인간 섬유아세포(HDFn)는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 세포 생존율 측정에는 methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)를 Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 이 중에서 카보닐 시그날(δ 177.5 ppm)을 포함해서 15개의 sp2 탄소(δ 177.5 ~ 92.2) 시그날이 관찰되어 화합물 1은 플라보노이드 골격을 함유한 화합물로 예상하였다.
- 콜라겐 생합성능 측정에는 procollagen type I protein synthesis kit (Takara, Japan)을 구입하여 사용하였다. 인간 섬유아세포(HDFn)는 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 세포 생존율 측정에는 methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)를 Sigma (Sigma Chemical Co.
- 구조 분석에는 FT-NMR (JNM-ECX400, JEOL, Japan)을 사용하였다. 콜라겐 생합성능 측정에는 procollagen type I protein synthesis kit (Takara, Japan)을 구입하여 사용하였다. 인간 섬유아세포(HDFn)는 한국 세포주 은행에서 구입하였다.
이론/모형
- Thin layer chromatography (TLC)는 실리카겔 60F254 (Merck, Germany)을 사용하였다. 구조 분석에는 FT-NMR (JNM-ECX400, JEOL, Japan)을 사용하였다. 콜라겐 생합성능 측정에는 procollagen type I protein synthesis kit (Takara, Japan)을 구입하여 사용하였다.
- 세포 생존율 측정은 Mosmann[22]의 방법을 변형한 MTT 정량법을 이용하여 측정하였다. 96-Well plate에 HDFn 세포를 1 × 105개씩 분주하여 24 h 배양한 후, 다양한 농도로 시료를 첨가하였다.
성능/효과
- MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과, 추출물을 100 µg/mL 농도로 처리하였을 경우에도 섬유아세포에서 세포 독성은 나타나지 않았다.
- 화합물 1과 2는 100 µg/mL 농도에서 대조군에 비하여 120% 및 128%의 콜라겐 생성 증가율을 보였다. MTT 검사법을 이용한 세포 생존율 확인 결과, 100 µg/mL 농도에서도 세포 독성은 나타나지 않았다.
- 그 결과, C-4’ (δ 150.1)과 C-7 (δ 165.1)이 메톡시 기의 수소와 상관관계를 나타내었다.
- 이것은 메틸기가 4’-OH와 7-OH에 치환되어 있음을 나타낸다. 이상의 결과를 종합하여 화합물 1은 플라보노이드 배당체인 ombuine 3-O-rutinoside로 동정하였다. 또한, 문헌상의 데이터와 비교하여 구조를 확정하였다[23].
- pentaphyllum)를 선정하여 추출물을 얻고 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성 촉진 여부를 평가하였다. 평가결과 돌외 에탄올 추출물은 100 µg/mL 농도에서 세포독성 없이 165%의 콜라겐 생성 증가율을 보였다. 활성 성분을 규명하기 위하여 추출물로부터 용매분획 및 크로마토그래피 등의 분리과정을 거쳐 2개의 성분을 분리하였다.
- 화합물 1과 2는 100 µg/mL 농도에서 대조군에 비하여 120% 및 128%의 콜라겐 생성 증가율을 보였다.
- 화합물 1의 1H-NMR 스펙트럼 분석 결과 화학적이동(δ) 7.72, 7.55, 7.24, 6.69, 6.37 ppm의시그날은 방향족 프로톤에 해당됨을 예측할 수 있다.
- 화합물 2의 NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 화합물 1과 거의 유사함을 알 수 있었다. 13C-NMR 스펙트럼에서 화합물 1보다 두 개의 탄소가 적은 총 27개의 탄소 signal이 관측되었다.
후속연구
- 앞으로 후속적인 연구를 통하여 이 부분은 계속 규명해 나갈 예정이다. 결론적으로 본 연구에서는 플라보노이드 배당체를 함유한 돌외 추출물은 진피 콜라겐 생성 증진을 통한 주름개선 화장품 소재로서의 개발 가능성을 확인할 수 있었다.
- 8 × 10-3%)의 수율은 매우 낮은 수준이다. 그러나, 향후 추출 공정을 최적화하는 과정을 통하여 유효성분의 추출 수율은 증가되리라 기대한다.
- 이 결과는 추출물 내에서 콜라겐 생합성을 촉진하는 다른 종류의 활성 성분들이 존재하고 있음을 보여주고 있다. 앞으로 후속적인 연구를 통하여 이 부분은 계속 규명해 나갈 예정이다. 결론적으로 본 연구에서는 플라보노이드 배당체를 함유한 돌외 추출물은 진피 콜라겐 생성 증진을 통한 주름개선 화장품 소재로서의 개발 가능성을 확인할 수 있었다.
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