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제안 방법
- 9종의 지베렐린생산 균주를 동정하기 위해서 배양된 균체로부터 DNA를 분리하여 Internal Transcribed Spacer(ITS)영역을 증폭하였다(Fig. 2). ITS 영역의 PCR 증폭 및 염기 서 열 분석반응을 위해 사용한 primei.
- Bioassay에서 control보다 waito-c 줄기를 신장시키는 균을 Czapek's 액체배지에 접종한 후 30℃에서 180 rpm으로일주일간 진탕 배양한 배양액을 membrane filter로 여과하고, 6N HC1 을 이용하여 pH를 2.5로 조절하였으며, 내부표준물질로는 20 ng의 [17.17-2H2] GAb GA3, GA4, GA7 그리고 GA53을 추출하기 전 배양액에 첨가하였다. 배양액에동일한 양의 ethylacetate를 첨가하여 3개로 나눈 후 ethyl acetate를 휘발시키고 60% Methanol로 희석한 후 2N NHQH로 pH를 8.
- Spectrophotometric method를 사용하여 밝혀진 지베렐린생산균을 Czapek's(l% glucose, 1% Bacto-peptone, 0.1% KH2PO4, 0.05% KC1, 0.05% MgSO4-7H2O, 0.001% FeSO47H2O, pH 7.3±0.2) 액체배지에 접종한 후 30℃에서 180 rpm으로 일주일간 진탕 배양한 배양액을 여과한 후 30배 농축한 농축액을 waito-c의 이엽기 엽액 부분에 10 나를 처리해서 일주일간 유묘의 생장을 측정하였다. Bioassay 결과 control®! 배지를 처리한 벼의 신장은 평균 9.
- 5 mL씩 총 50 분획으로 나누었다. 각 GA의 정확한 머무름 시간은 각 분획당 소량(15 μL)을 취하여 liquid scintillation spectrometry 를 이용(Beckman, 1801)하여 3H-GA 표준물질의 유무를 확인하여 결정하였다.
- 5로 조정한 후 ethylacetate로 3회분획한 후 감압농축하였다. 농축한 잔사를 methanol에 용해시켜 0.2 μm membrane filtei로 여과한 후 HPLC용 분석 시료로 사용하였다.
- 본 연구에서는 지베렐린 생산성이 있는 다양한 균주를 확인하고자, 식물의 뿌리에서 지베렐린을 생산하는 진균류를분리하고, 여러 종류의 지베렐린 중 활성이 있다고 알려진 GAi, GA3, GA4, GA7과 GA9의 생산량을 GC-MS(Gas chromatography-mass spectrometer)로 즉정하였고, Internal Transcribed Spacer(ITS)의 염기서열 분석을 수행하여 미생물을 동정하였다.
- 9x300 mm)을 사용하였으며 각 GA는 1% acetic acid를 포함한 28% methanol과 100% methanol 용액의 농도구배로 분리하였다. 유속은 분당 1.5 mL로 유지하였으며 1.5 mL씩 총 50 분획으로 나누었다. 각 GA의 정확한 머무름 시간은 각 분획당 소량(15 μL)을 취하여 liquid scintillation spectrometry 를 이용(Beckman, 1801)하여 3H-GA 표준물질의 유무를 확인하여 결정하였다.
- 정성과 정량분석을 위해 Hydrocarbon standard를 이용중}여 KRI 값을 구하였으며, 각 GA와 [2H2]GA internal standards (obtained from Prof. Lewis N. Mander, Australian National University, Canberra, Australia)의 3개의 주요 ion mass를비교하여 정량하였다.
- 세척흐}였다. 표백제인 perchloric acid(l%)에 뿌리를 완전히 침전시킨 후 5분간씩 2회 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하고, 멸균된 가위를 이용하여 1.5 cm 정도로 절단한 후멸균 종이 위에서 물기를 완전히 제거한 뒤 Hagem(0.5% glucose, 0.05% KH2PO4, 0.05% MgSO4-7H2O, 0.05% NH4CI, 0.1% F* eCl Streptomycin 80 ppm, 1.5% Agar, pH 5.6) 배지를 이용하여 25℃에서 배양하여 , 사상균을 순수분리 하였다. 실험 결과 황금등 26종의 식물뿌리로부터 249 종의 진균을 분리하였다.
대상 데이터
- 5973 Network Mass Selective Detector(Hewlett Packard) 가 부착된 GC-MS를 사용하였으며 Data는 HP5970C Chemstation(Hewlett Packard)을 사용하여 처리하였다. 정성과 정량분석을 위해 Hydrocarbon standard를 이용중}여 KRI 값을 구하였으며, 각 GA와 [2H2]GA internal standards (obtained from Prof.
- 2. Nucleotide sequences of ITS region for the strain CI01, CI04, IBL03, IBL07, VP03, AT05, AK07, CP03 and CP04.
- 본 연구에 사용된 미생물은 한국미생물보존센터 (KCCM) 로부터 분양 받은 Gibberella fiijikuroi(KCCM 12329)를 control 균주로 사용하였으며 , 황금등 73종의 식물뿌리를 봉화약초시험장 및 대구칠곡 농업기술센터에서 수집하여 사용하였고, 시료는 비닐 팩에 담아 4℃에서 보관하였다.
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