[논문]담수에 자생하는 수생식물에서 분리된 내생균류의 지베렐린 생산과 동정

유영현; 강상모; 최유미; 이명철; 김종국

doi:10.4489/kjm.2015.43.1.71

담수에 자생하는 수생식물에서 분리된 내생균류의 지베렐린 생산과 동정
Gibberellins Production and Identification of Endophytic Fungi Isolated from Aquatic Plant in Fresh Water 원문보기

한국균학회지 = The Korean journal of mycology, v.43 no.1, 2015년, pp.71 - 76

유영현 (경북대학교 생명과학부) , 강상모 (경북대학교 응용생명과학부) , 최유미 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터) , 이명철 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터) , 김종국 (경북대학교 생명과학부)

초록
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수생식물 샘플은 낙동강과 금호강이 만나는 달성습지에서 자라풀을 채집하였다. 자라풀의 뿌리에서 내생균류를 분리하고 형태가 다른 균주를 관찰하여 최종적으로 16개 균주를 선발하였다. 내생균류의 배양여과액은 식물생장촉진활성 검정을 위하여 난장이벼에 처리하여 스크리닝하였으며, HD1008 균주가 식물생장촉진활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. HD1008 균주의 배양여과액을 HPLC와 GC/MS-SIM을 이용하여 분석하였고, HD1008 균주가 식물호르몬인 지베렐린 $GA_1$ (1.2 ng/100 mL)과 $GA_4$ (5 ng/100 mL) 를 생산하는 것을 정량분석을 통하여 확인하였다. 또한, HD1008균주의 beta-tubulin 유전자 염기서열을 이용하여 동정에 이용하였으며, 분자적인 방법과 형태적인 방법으로 관찰하였을 때, 지베렐린을 생산하는 새로운 P. trzebinskii로 동정되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Aquatic plant Hydrocharis dubia (Blume) Backer was collected from the Dalsung wetland in Daegu. Sixteen endophytic fungi with different colony morphologies were isolated from the roots of aquatic plants. Waito-c rice (WR) seedlings were treated with fungal culture filtrates (FCF) for screening plant growth-promoting activity. In the results, HD1008 strain isolated from aquatic plant showed highest plant growth-promoting activity. The FCF of HD1008 strain was analyzed using gas chromatography mass spectrometry (GC/MS) with selected ion monitoring (SIM). Analysis of the FCF of HD1008 strain found that it contained gibberellins (GA) ($GA_1$, 1.2 ng/100 mL; $GA_4$, 5 ng/100 mL). Phylogenetic tree of HD1008 strain was constructed by partial internal transcribed spacer (ITS) region and partial beta-tubulin gene sequences. Therefore, we describe HD1008 strain as a new gibberellin-producing Penicillium trzebinskii based on morphological and molecular characteristics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 달성습지에 자생하고 있는 수생식물인 자라풀의 뿌리로부터 분리된 내생균류가 식물생장과 관련하여 생장저해 또는 생장촉진 등에 영향을 미치는지 확인하였다. 생장활성 스크리닝과 이차대사산물을 분석하여 생리활성을 나타내는 활성 지베렐린 중의 하나인 GA1과 GA4는 식물-내생균류 상호관계 및 유용물질에 대한 연구 소재로 보고되고 있다[13, 14].
본 연구는 담수지역인 강 배후 습지에 자생하는 수생식물의 내생균류에 대한 연구로서 내생균류가 수생식물의 생장에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 그래서 수생식물의 뿌리로부터 분리된 내생균류를 활용하여 식물생장촉 진활성 스크리닝, 이차대사산물 분석 및 유용미생물의 동정을 수행하였다.
특히 염환경에 자생하는 균류 중에서 Penicillium속에 포 함되는 종들에 의하여 생산한다고 알려져 있으며[12, 14], 드물게 Aspergillus 속[21], Cadophora 속[14], Cladosporium 속[22]에서도 생산한다고 보고되고 있다. 현재 수생식물과 공생하는 내생균류의 식물호르몬 생산에 대한 연구는 거의 없는 실정이므로 본 연구에서 보고하고자 한다. 물론 다양하고 많은 양의 지베렐린을 생산하는 것은 아니지만 본 연구를 시작으로 수생식물과 공생하는 내생균류뿐만이 아니라 내생세균 등 다양한 공생미생물에 대한 연구가 필요할 것이다.

제안 방법

내생균류의 배양여과액은 식물생장촉진활성 검정을 위하여 난장이벼에 처리하여 스크리닝하였으며, HD1008 균주가 식물생장촉진활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. HD1008 균주의 배양여과액을 HPLC와 GC/MS-SIM을 이용하여 분석하였고, HD1008 균주가 식물호르몬인 지베렐린 GA1 (1.2 ng/100 mL)과 GA4 (5 ng/100 mL)를 생산하는 것을 정량분석을 통하여 확인하였다. 또한, HD 1008균주의 beta-tubulin 유전자 염기서열을 이용하여 동정에 이용하였으며, 분자적인 방법과 형태적인 방법으로 관찰하였을 때, 지베렐린을 생산하는 새로운 P.
본 연구는 담수지역인 강 배후 습지에 자생하는 수생식물의 내생균류에 대한 연구로서 내생균류가 수생식물의 생장에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 그래서 수생식물의 뿌리로부터 분리된 내생균류를 활용하여 식물생장촉 진활성 스크리닝, 이차대사산물 분석 및 유용미생물의 동정을 수행하였다.
그리고 스트렙토마이신 80 ppm이 포함된 hagem minimal 배지를 사용하여 25°C에서 식물뿌리시료를 배양하였으며[13] 뿌리 단면에서 생장한 균사를 획선도말법을 이용하여 분리하였다.
6 프로그램과 다중정렬은 ClustalW, 거리계산은 Tamura-Nei 상수 모델, 계통수(phylogenetic tree) 는 neighbor-joining (NJ) 방법을 이용하였다[16]. 그리고 형태적인 관찰을 위하여, MEA배지, CYA배지, CREA배지를 사용하였고, 광학현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany) 을 사용하여 분생포자경(conidiophore)과 분생포자(conidium) 의 미세구조를 관찰하여 동정에 이용하였다.
난장이벼의 종자를 uniconazol (20 ppm)과 스포탁에 1일 처리를 통하여 발아시켜 water agar에 파종하였으며, 유묘의 이엽기 엽액 부분에 균류의 농축된 배양여과액(10 μL)을 처리하여 7일간 생장을 관찰하였다.
달성습지에 자생하고 있는 수생식물인 자라풀(Hydrocharis dubia (Blume) Backer)을 채집하여 식물뿌리를 세척하고, 계면활성제(tween 80)와 표백제(perchloric acid 1%)를 처리하여 살균하였다. 그리고 스트렙토마이신 80 ppm이 포함된 hagem minimal 배지를 사용하여 25°C에서 식물뿌리시료를 배양하였으며[13] 뿌리 단면에서 생장한 균사를 획선도말법을 이용하여 분리하였다.
난장이벼의 종자를 uniconazol (20 ppm)과 스포탁에 1일 처리를 통하여 발아시켜 water agar에 파종하였으며, 유묘의 이엽기 엽액 부분에 균류의 농축된 배양여과액(10 μL)을 처리하여 7일간 생장을 관찰하였다. 대조구는 물과 농축된 CBM배지를 같은 조건으로 사용하여 5반복으로 진행하였으며, 난장이벼의 지상부길이(shoot length)와 식물체길이(plant length)를 측정하였다. 통계처리는 SPSS ver.
식물생장촉진활성을 나타내는 HD1008 균주의 배양여과액을 추출하여 high performance liquid chromatography(HPLC)로 분석하였고, 후보물질을 선정하여 chromatography mass spectrometry with selected ion monitoring (GC/MS-SIM)으로 정량분석 하였다[12-14].
식물생장촉진활성을 나타내는 HD1008 균주의 분자적인 동정을 위하여, 동결건조된 균체를 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였고, beta-tubulin 유전자(primers: Bt2a, Bt2b) [15]의 염기서열을 동정에 이용하였으며, NCBI Gen- Bank에 blast 검색과 문헌조사를 통하여 근연종의 유전자 염기서열을 선발하였다. 선발된 근연종들과의 유연관계도 작성은 MEGA ver.

대상 데이터

수생식물 샘플은 낙동강과 금호강이 만나는 달성습지에서 자라풀을 채집하였다. 자라풀의 뿌리에서 내생균류를 분리하고 형태가 다른 균주를 관찰하여 최종적으로 16개 균주를 선발하였다.
그리고 스트렙토마이신 80 ppm이 포함된 hagem minimal 배지를 사용하여 25°C에서 식물뿌리시료를 배양하였으며[13] 뿌리 단면에서 생장한 균사를 획선도말법을 이용하여 분리하였다. 식물생장촉진 활성 스크리닝을 위하여 분리된 내생균류를 Czapek broth medium (CBM) 50 mL에 진탕배양한 후에 여과하였으며, 배양여과액을 동결건조하여 농축액을 실험재료로 사용하였다[14].
자라풀의 뿌리로부터 형태적으로 다른 16개 균주를 분리하였으며, 이들 균류의 농축된 배양여과액을 난장이벼에 처리하였을 때, 다른 균류들보다 생장촉진활성이 우수 한 HD1008 균주를 선발하였다(Table 1). 대조구 중에서 증류수를 처리한 조건의 경우에 지상부길이 4.
수생식물 샘플은 낙동강과 금호강이 만나는 달성습지에서 자라풀을 채집하였다. 자라풀의 뿌리에서 내생균류를 분리하고 형태가 다른 균주를 관찰하여 최종적으로 16개 균주를 선발하였다. 내생균류의 배양여과액은 식물생장촉진활성 검정을 위하여 난장이벼에 처리하여 스크리닝하였으며, HD1008 균주가 식물생장촉진활성이 가장 높은 것으로 확인되었다.

데이터처리

통계처리는 SPSS ver. 18.0 (SPSS Inc. Chicago, IL. USA)을 이용하여 일원 배치분산분석(ANOVA)과 Duncan's multiple range test (DMRT) 사후검정을 통하여 결과값을 도출하였다.

이론/모형

식물생장촉진활성을 나타내는 HD1008 균주의 분자적인 동정을 위하여, 동결건조된 균체를 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였고, beta-tubulin 유전자(primers: Bt2a, Bt2b) [15]의 염기서열을 동정에 이용하였으며, NCBI Gen- Bank에 blast 검색과 문헌조사를 통하여 근연종의 유전자 염기서열을 선발하였다. 선발된 근연종들과의 유연관계도 작성은 MEGA ver. 6 프로그램과 다중정렬은 ClustalW, 거리계산은 Tamura-Nei 상수 모델, 계통수(phylogenetic tree) 는 neighbor-joining (NJ) 방법을 이용하였다[16]. 그리고 형태적인 관찰을 위하여, MEA배지, CYA배지, CREA배지를 사용하였고, 광학현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany) 을 사용하여 분생포자경(conidiophore)과 분생포자(conidium) 의 미세구조를 관찰하여 동정에 이용하였다.

성능/효과

HD1008 균주의 염기서열을 NCBI GenBank에 등록하여 internal transcribed spacer (ITS)영역에서 accession number KP691070과 beta-tubulin의 accession number KP691069를 받았다. 그리고 HD1008 균주의 beta-tubulin 유전자 염기서열을 사용하여 동정을 수행하였을 때, HD1008균주는 Penicillium속의 section Aspergilloides에 포함되는 P. trzebinskii 균주로 확인할 수 있었으며, 분류학적인 위치를 확인하기 위하여 표준균주와 참고문헌들을 활용하여 계통학적인 위치를 확인할 수 있었다(Fig. 2) [17, 18].
자라풀의 뿌리에서 내생균류를 분리하고 형태가 다른 균주를 관찰하여 최종적으로 16개 균주를 선발하였다. 내생균류의 배양여과액은 식물생장촉진활성 검정을 위하여 난장이벼에 처리하여 스크리닝하였으며, HD1008 균주가 식물생장촉진활성이 가장 높은 것으로 확인되었다. HD1008 균주의 배양여과액을 HPLC와 GC/MS-SIM을 이용하여 분석하였고, HD1008 균주가 식물호르몬인 지베렐린 GA1 (1.
자라풀의 뿌리로부터 형태적으로 다른 16개 균주를 분리하였으며, 이들 균류의 농축된 배양여과액을 난장이벼에 처리하였을 때, 다른 균류들보다 생장촉진활성이 우수 한 HD1008 균주를 선발하였다(Table 1). 대조구 중에서 증류수를 처리한 조건의 경우에 지상부길이 4.56 cm, 식물 체길이 9.48 cm였고, 농축된 배지를 처리한 경우에는 생장 능의 지상부길이가 5.02 cm, 식물체길이 10.30 cm였으며, HD1008 균주는 지상부길이 7.70 cm, 식물체길이 16.06 cm 인 것을 측정할 수 있었다. 생장촉진활성 스크리닝을 통하여 HD1008 균주의 배양여과액에는 식물생장을 촉진시키는 유용물질이 포함되어 있을 것으로 생각되었다.
2 ng/100 mL)과 GA4 (5 ng/100 mL)를 생산하는 것을 정량분석을 통하여 확인하였다. 또한, HD 1008균주의 beta-tubulin 유전자 염기서열을 이용하여 동정에 이용하였으며, 분자적인 방법과 형태적인 방법으로 관찰하였을 때, 지베렐린을 생산하는 새로운 P. trzebinskii로 동정되었다.
3). 또한, 형태적인 특징을 확인했을 때, P. trzebinskii에 속하는 종으로서 자루에 마디가 형성되는 유사한 특징을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 HD1008 균주는 P.
형태적인 동정을 위하여, 다양한 배지에서 생장한 균주의 형태를 관찰하였고, MEA배지에서 생장한 균주를 광학 현미경으로 관찰하였을 때, 분생포자경의 자루(stipe)는 200~600 × 2.5~3.5 μm 크기에 표면이 거칠었고, 경자(phialides) 는 9~12 × 2.5~3.5 μm 크기였으며, 분생포자는 2.5 ~3 × 2~2.5 μm 크기의 원형에 가까운 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).

후속연구

그리고 달성습지의 경우 크게 보면 하천습지에 속하지만 세부적으로는 강 배후 습지로 구분되며, 강의 범람에 영향을 매우 크게 받는 지역으로 하천과 내륙습지의 중간 형태를 가지는 독특한 생태계를 구성하고 있다. 그리고 이들 생태계에 대하여 생태적인 식생연구뿐만이 아니라 다방면적인 식물-미생물 연구가 필요 할 것이고, 독특한 형태의 유용미생물자원이 자생하고 있을 것으로 생각된다. 또한, 강 배후 습지와 더불어 국내에 다양한 하천, 산림, 고산습지 등과 같은 담수환 경지역에 자생하는 균류자원에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
그리고 이들 생태계에 대하여 생태적인 식생연구뿐만이 아니라 다방면적인 식물-미생물 연구가 필요 할 것이고, 독특한 형태의 유용미생물자원이 자생하고 있을 것으로 생각된다. 또한, 강 배후 습지와 더불어 국내에 다양한 하천, 산림, 고산습지 등과 같은 담수환 경지역에 자생하는 균류자원에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
현재 수생식물과 공생하는 내생균류의 식물호르몬 생산에 대한 연구는 거의 없는 실정이므로 본 연구에서 보고하고자 한다. 물론 다양하고 많은 양의 지베렐린을 생산하는 것은 아니지만 본 연구를 시작으로 수생식물과 공생하는 내생균류뿐만이 아니라 내생세균 등 다양한 공생미생물에 대한 연구가 필요할 것이다. 또한 이들 공생미생물은 수생식물의 생장증진, 면역력증진 등의 영향으로 수생식물의 생장활성에 도움을 줄 것이며, 이는 수생식물이 습지 및 담수생태계에 대한 수질 정화 등과 연계될 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	습지의 역할은?	습지는 육상생태계와 수생태계의 전이지대로서 두 지역의 생태계를 완충하고 홍수조절, 정화작용, 동식물의 서식처제공, 물질의 이동통로이자 변환장소, 이산화탄소의 농 도증가를 억제하여 기후를 안정하게 하는 역할을 한다[1]. 특히, 습지는 생물 종의 변환에 대하여 종 다양성을 유지하는데 우수하고, 생물상 발달에 유리한 측면을 가지고 있으며, 규모에 비하여 다른 생태계들 보다 생물다양성이 높다고 알려져 있다[2].
	식물생장과 관련에 영향을 주는 해안생태계의 균류는?	특히 염환경에 자생하는 균류 중에서 Penicillium속에 포 함되는 종들에 의하여 생산한다고 알려져 있으며[12, 14], 드물게 Aspergillus속[21], Cadophora속[14], Cladosporium 속[22]에서도 생산한다고 보고되고 있다. 현재 수생식물과 공생하는 내생균류의 식물호르몬 생산에 대한 연구는 거의 없는 실정이므로 본 연구에서 보고하고자 한다.
	본 연구에서 수생식물 샘플은 어디서 채집했는가?	수생식물 샘플은 낙동강과 금호강이 만나는 달성습지에서 자라풀을 채집하였다. 자라풀의 뿌리에서 내생균류를 분리하고 형태가 다른 균주를 관찰하여 최종적으로 16개 균주를 선발하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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