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문제 정의
- 본 연구는 예로부터 약용 및 식용으로 사용되는 구릿대에서, 효용가치가 뿌리 에 비하여 부족한 것으로 알려진 잎의 기능성을 분석하여 새로운 소재로 활용하기 위해 폴리페놀 화합물 함량, 전자공여능, SOD 유사활성능, 아질산염 소거 능을 측정하였으며, 생리학적 효과를 알아보기 위하여 xanthine oxidase 저 해 활성 및 tyrosinase 저 해 활성을 측정하였다.
제안 방법
- 다음과 같이 측정하였다. 1 mM의 NaNCh 용액 2 mL에 일정 농도의 구릿대 추출물을 첨가하고, 여기에 0.1 N HCI (pH 1.2)과 0.2 M citrate buffer를 사용하여 반응용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 6.0으로 조정한 후, 반응용액의 부피를 10 mL로 하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 각각 1 mL씩 취하였다. 여기에 2% acetic acid를 5 mL를 첨가하고, griess reagent (A:B=1:1, A; 1% sulfanilic acid in 30% acetic acid, B; 1% naphthylamine in 30% acetic acid) 0.
- 구릿대 잎의 추출물 제조는 Hg 1과 같다 환류 물 추출물 (Reflux water extract: RW)과 환류 에탄올 추출물(Reflux ethanol extract: RE)은 환류 냉각관을 부착시킨 둥근 플라스크에 생체 시료 당 10배에 해당되는 증류수 및 70% 에탄올을 넣고 80℃와 60℃의 수욕 상에서 3시간씩 3회 반복 추출하였다. 가압 열수 추출물(Pressure heating water extract: PW)은 시료의 30배 분량의 증류수를 넣고 압력추출기로 H0℃, 1.
- 4 mL 첨가하여 vortex mixing 후, 실온에서 15분간 반응시켰다. 반응시킨 시료를 520 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조구는 griess reagoit 대신 증류수 0.4 mL를 가하여 상기와 동일한 방법으로 측정하여 구릿대 추출물의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었다.
- 4 mL 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV/VIS spectrophotometer사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 화합물은 tannic acid를 이용하여 최종농도가 0, 37.5, 75, 150, 300 Ug/mL가 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 725 nm 에서 흡광도를 측정하여 표준곡선으로부터 구릿대 뿌리 추출물의 종 폴리페놀 화합물 함량을 구하였다.
- 모아진 추출액은 filter paper로 여과한 다음, rotatory vacuum evaporator(Eyela 400 series, Japan)로 감압농축한 후에 동결건조(FD 5510 SPT, Ilshin Korea)하여 분말로 제조하였다. 추출물은 일정 농도로 희석하여 폴리페놀 및 항산화성과 생리활성 측정을 위한 시료로 사용하였으며, 대조구는 추출물 대신 천연항산화제인 아스코르브산(Sigma, USA)을 추출물과 동일한 농도로 첨가하여 항산화성 및 생리활성을 비교하였다.
대상 데이터
- 본 실험 재료인 구릿대(4 dahuricd)는 2004년 7월에 경북 경산의 한약재 생산 농가에서 채집하였으며, 잎 부분만을 따로 분리하여 세척하고 물기를 제거한 다음 -75℃에서 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험은 독립적으로 3회 이상 반복 실시하여 실험결과를 평균 土 표준편차로 나타내었다. 실험군간의 유의성을 검정하기 위하여 SPSS 12.
- 평균 土 표준편차로 나타내었다. 실험군간의 유의성을 검정하기 위하여 SPSS 12.0 for windows program을 이용하여 ANOVA test를 행한 후 유의성이 있는 경우, p<0.05수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 저해 활성은 Yagi 등(41)의 방법에 따라 측정하였다. 0.
- Xanthine oxidase 저 해 활성 측정 은 Stirpe 와 Crte(40) 의 방법에 따라 실시하였다. 각 시료용액 0.
- 각 시료의 전자공여능 측정은 Blois의 방법(37)에 준하여 구릿대 잎 추출물의 DPPH (1, 1 -diphenyl-2-picryl hydrazyl) 에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 일정 농도의 시료 2ml에 2x10, M DPPH용액(dissolved in 99% Ethanol)을 1 mL 가하고, vortex mixing 하여 37 ℃ 에서 30분간 반응시켰다.
- 구릿대 잎 추출물은 동결 건조된 시료를 DW에 10 mg/mL 의 농도로 희석하여 Folin-Denis(35, 36)법으로 측정하였다. 즉 시료를 1 yg/mL 농도로 증류수에 녹인 다음, Folin- ciocalteu's phenol reagent 0.
- 구릿대 추출물의 SOD 유사활성은 Marklund와 Marklund (38)의 방법에 따라 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogaUol의 생성 량을 측정하여 SOD 유사 활성으로 나타내었다. 즉, 일정 농도의 시료 0.
- 아질산염(NaNOz) 소거 작용은 Kato 등(39)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 1 mM의 NaNCh 용액 2 mL에 일정 농도의 구릿대 추출물을 첨가하고, 여기에 0.
성능/효과
- 세가지 유형의 추출물 모두에서 시료의 농도가 높아질수록 DPPH에 대한 전자공여능도 증가하는 경향을 나타내었고, 100 lig/mL의 농도에서 PW의 전자 공여 능이 더 높았으나, 농도가 높아짐에 따라 RE의 전자 공여 능이 높아졌다. 1,000 lig/mL의 농도에서 PW는 70.08%를 나타내었고, RE에서는 76.02%로 가장 높은 전자공여 효과를 나타내었다. 이는 Kim 등(45)의 솔잎과 녹차 추출물과, An 등(46)에서 진달래꽃 추출물 등에서 에탄올 추출물이 더 높은 SOD 유사활성능을 나타낸다는 결과와 일치하였다.
- 06%~5433%로 100 μg/mL의 농도에서는 RE의 아질산염 소거능이 높았으며, 300 ug/mL에서는 세가지 주줄물이 모두 유사한 소거효과를 나타내었다. 500-1,000 ug/mL로 농도가 증가함에 따라 PW는 54.33%로 가장 높은 아질산염 소거효과를 나타내었으며 RW와 RE는 유사한 소거능을 나타내었다 pH 3.0에서는 PW(5.06% ~35.67%)>RW(8.45% ~ 31.71%)>RE 8.2 5%~25.08%의 순으로 나타났으며, Pg 경우 저농도에서는 아질산염 소거효과가 낮았으나, 1,000 ㎍/mL의 농도에서는 가장 높은 것으로 분석되다. RE와 PW는 농도에 따라 유의적인 차이를 나타내었으나, RW는 유의적인 차이가 없었다.
- RW에서는 29.33%~99.71%로 가장 높은 저해 활성을 나타내었으며, RE는 2727%~96.77% 그리고 PW에서는 47.51%~97.95% 의 xanthine oxidase 저해효과를 나타내었다. 대조군으로 측정한 아스코르브산은 84.
- 1 mL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 IN HCI 1 mL를 가하여 반응을 정지시킨 후, 반응액 중에 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하였다. Xanthine oxidase 저해 활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율 (%)로 나타내었다.
- pH L2에서 RW는 10.89%~44.24%였으며 RE에서는 17.24%~4424%, 그리고 PW에서는 5.06%~5433%로 100 μg/mL의 농도에서는 RE의 아질산염 소거능이 높았으며, 300 ug/mL에서는 세가지 주줄물이 모두 유사한 소거효과를 나타내었다. 500-1,000 ug/mL로 농도가 증가함에 따라 PW는 54.
- 06 mg/g) 의 순으로 폴리페놀을 함유하는 것으로 분석되었다(Table 1). 가압 열수 추출 방법을 이용한 PW 추출물에서 가장 많은 폴리페놀을 함유하여 환류 추출물보다 1.3배 ~2배 이상 많은 폴리페놀이 추출된 것으로 나타났다. 이는 가압 열수 추출방법이 KX)℃ 이상의 고온과 높은 압력으로 환류 추출방법보다 많은 폴리페놀을 추출할 수 있었던 것으로 판단된다.
- 측정한 결과는 Table 2와 같다. 각 추출물의 농도가 100-1000 ng/mL에서 RE(55.61% ~76.02%)>PW(6L55% ~70.08%)>RW(48.86%~61.14%^ 전자공여능을 나타내는 것으로 분석되었다. 세가지 유형의 추출물 모두에서 시료의 농도가 높아질수록 DPPH에 대한 전자공여능도 증가하는 경향을 나타내었고, 100 lig/mL의 농도에서 PW의 전자 공여 능이 더 높았으나, 농도가 높아짐에 따라 RE의 전자 공여 능이 높아졌다.
- 화합물이 작용하는 것으로 알려져 있다. 구릿대 잎 추출물의 폴리페놀 화합물의 함량을 측정한 결과, 가압 열수 추출물(PW; 95.23 mg/g)>환류 에탄올 추출물(RE; 69.81 mg/g)>환류 물 추출물(RW; 41.06 mg/g) 의 순으로 폴리페놀을 함유하는 것으로 분석되었다(Table 1). 가압 열수 추출 방법을 이용한 PW 추출물에서 가장 많은 폴리페놀을 함유하여 환류 추출물보다 1.
- 모든 추출물에서는 시료의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 xanthine oxidase 저해 활성이 높아졌다. 구릿대 잎의 환류 물 추출물인 RW는 500 ng/mL 이상의 농도에서 97% 이상의 저해효과를 나타내었으며, 대조군인 아스코르브산의 88%보다 높은 xanthin oxidase 저해 활성을 나타내었다. PW에서는 100 ug/mLe 농도에서도 약 47%의 저해 활성을 나타내었으며, 500 ㎍/mL에서도 90%의 매우 높은 저해 활성을 나타내었다.
- Table 6과 같다. 구릿대의 환류 에탄올 추출물인 RE는 9.91%~46.25%로 가장 높은 저해율을 나타내었으며, RW 는 4.94%~29.23%, 그리고 PW는 1.47%~23.88%로 구릿대 추출물 중에서 가장 낮았으며, 구릿대 모든 추출물에서 농도가 높아짐 에 따라 tyrosinase 저해 활성이 유의적으로 증가하였다. Tyrosinase 저해효과가 높은 천연물질로 알려져있는 아스코르브산은 100 ug/mL 이상의 농도에서 도 96% 이상의 높은 저해효과를 나타내었다.
- 농도에 따른 구릿대 추출물의 SOD 유사활성능을 측정한 결과 RE에서는 4.27% ~19.00%로 가장 높은 활성을 나타내었으며, PW에서는 6.92%-17.15, RW에서는 2.42%~ 13.45%의 범위로 분석되었다Qable 3). 대조군인 아스코르브산은 100 ug/mL 이상의 농도에서도 99% 이상의 SOD 유사활성을 나타내었으며, 농도에 따른 유의적인 차이는 없었다.
- 60% 로 RW보다 낮은 소거능을 나타내었다. 대조군으로 아스코르브산은 pH 1.2에서 88% 이상의 소거능을 나타내었으며, pH 3.0과 6.0에서도 70% 이상의 소거능을 나타내었다. 본 실험결과를 Mom 등(44)의 pH 1.
- 05%의 저해효과를 나타내었다. 모든 추출물에서는 시료의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 xanthine oxidase 저해 활성이 높아졌다. 구릿대 잎의 환류 물 추출물인 RW는 500 ng/mL 이상의 농도에서 97% 이상의 저해효과를 나타내었으며, 대조군인 아스코르브산의 88%보다 높은 xanthin oxidase 저해 활성을 나타내었다.
- 0에서도 70% 이상의 소거능을 나타내었다. 본 실험결과를 Mom 등(44)의 pH 1.2의 조건에서 녹차 (98.96%), 박하(93.98%), 애엽 (75.91 %), 당귀(57.72%), 갈근 (54.94%), 식방풍(41.87%) 등의 결과와 비교하면 녹차, 박하 그리고 애엽 보다는 낮았으나 당귀, 갈근, 식방풍 보다는 높은 소거능을 나타내었다. Kim 등(52)의 팽이버섯, 하수오 행인, 오미자 등이 20% 이하의 아질산염 소거능을 나타내었다는 결과와 비교하면 구릿대 잎 추출물은 높은 소거 능을 나타내는 것으로 분석되었다.
- 본 실험결과를 Moon 등(44)이 보고한 약용식 물의 메탄올 추출물인 녹차의 94.07%와 애엽의 68.90% 보다는 유사하거나 낮은 결과를 나타내었으나, 지구자엽(26.85%), 박하 (26.27%), 식방풍(5.58%) 보다는 높은 전자공여능을 나타내었다. 또한 민들레 잎의 물 추출물이 1,000 Ug/mL에서 50% 이상의 전자공여능을 나타낸다는 결과(47)와 비교하면 구릿대 잎은 전자공여능이 높다고 할 수 있다.
- 14%^ 전자공여능을 나타내는 것으로 분석되었다. 세가지 유형의 추출물 모두에서 시료의 농도가 높아질수록 DPPH에 대한 전자공여능도 증가하는 경향을 나타내었고, 100 lig/mL의 농도에서 PW의 전자 공여 능이 더 높았으나, 농도가 높아짐에 따라 RE의 전자 공여 능이 높아졌다. 1,000 lig/mL의 농도에서 PW는 70.
- 이처럼 뿌리보다 구릿대 생산량이 많은 구릿대 잎 추출물이 아질산염 소거작용에서도 우수한 작용을 나타낸 것으로 보아 구릿대 잎은 인체에 안전한 천연물로서 생식 및 식품 가공품, 보존제로서 이용이 가능할 것으로 판단된다.
- 9배 이상 높은 것으로 분석되었다. 특히 1,000 yg/mLS] RE 추출물은 30.50%로 RW와 PW의 5,000 yg/mL 농도에서 tyrosinase 저해율보다 높았으며, 동일한 농도의 PW보다는 13.4배 이상 저해율을 나타내었다.
- Tyrosinase 저해효과가 높은 천연물질로 알려져있는 아스코르브산은 100 ug/mL 이상의 농도에서 도 96% 이상의 높은 저해효과를 나타내었다. 환류 에탄올 추출물인 RE는 5,000 ㎍/mL 농도에서 46.25%로 저해 활성이 가장 높았고, 물을 용매로 사용한 추출물보다 1.5배 ~ 1.9배 이상 높은 것으로 분석되었다. 특히 1,000 yg/mLS] RE 추출물은 30.
후속연구
- 41 mg/g) 등과 비교하여도 구릿대 잎은 많은 폴리페놀을 함유하는 것으로 볼 수 있다. 그러므로 구릿대 잎 추출물은 항산화 효능을 나타내는 폴리페놀을 다량 함유하고 있어 천연 항산화제로써 이용 가치가 높은 것으로 생각되며, 특히 가압 열수 추출 방법을 이용하면 더욱 효과적으로 폴리페놀을 추출할 수 있을 것으로 판단된다.
- 이상의 결과에서 구릿대 잎은 높은 tyrosinase 저해 능력을 갖고 있으므로 식물의 효소적 갈변화를 방지하고자 하는 가공식품의 식품첨가물로 이용할 수 있으며, melanin 생성을 저해하는 피부 미백효과를 나타내는 기능성 화장품의 원료로 활용될 수 있는 생물자원인 것으로 판단된다.
- 9%라는 보고와 율피의 열수 추출물이 70%, 에탄올 추출물이 63%의 저해율을 보인다고 한 Jung 등(50) 의 결과와 비교하여도 구릿대 잎 추출물의 xanthine oxidase 저해 활성이 높은 것으로 분석되었다. 이와 같이 구릿대잎 추출물의 xanthine oxidase 저해 활성 효과가 우수한 것으로 보아, 구릿대 잎에서도 한방 생약재로 사용되고 있는 뿌리와 같은 한방의 진정, 진경과 같은 진통 완화에 효과가 있을 것으로 생각된다.
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