Ribosomal DNA ITS 유전자를 이용한 왕지렁이(빈모강: 지렁이과) 그룹의 계통분류 Molecular Phylogeny of the Amynthas-complex (Oligochaeta: Megascolecidae) Inferred from ITS Nucleotide Sequences원문보기
지렁이과 (family Megascolecidae) 왕지렁이속 (genus Amynthas) 그룹을 rDNA ITS 유전자를 이용하여 계통 유연관계를 알아보고자 하였다. 2과 10속에서 26종의 DNA 염기서열을 이용하여 종간 계통적 유연관계를 MP (Maximum Parsimony), NJ (Neighbor Joining), QP (Quartet Puzzling)로 계통도를 작성하였다. 염기서열이 확보된 Megascolecidae (지렁이과)의 국내외 26종에 대한 계통 분석은 위 3개의 알고리즘 모두 동일한 5개의 그룹으로 나뉘는 것을 확인하였다. 또한 Amynthas 속은 크게 한국산 그룹과 필리핀산 그룹으로 구분되었다. 첫 번째 그룹, Amynthas jirensis, A. agrestis, A. gucheonensis, A. sopaikensis, A. bubonis, A. multimaculatus, A. koreanus, A. dageletensis, A. heteropodus, A. odaesanensis, Pontoscolex sp., Pheretima sp. 1와 다른 그룹, Dendropheretima banahawensis. Amynthas halconensis, A. isarogensis, A. mindrooensis, Pithemera sp. 2, Pithmera sp. 1, and Pleionogaster sp.이다. 이는 ITS 유전자가 속간의 차이를 보여주는 것보다 동일한 속이라 하더라도 지리적 차이에 따른 환경의 영향을 받았음을 알 수 있다. 즉 형태적 분화가 이루어졌다고 하더라도 유전적으로는 동질성을 나타내고 있음을 알 수 있다. 형태적 특징에 의한 명백한 차이는 구분되지 않았다.
지렁이과 (family Megascolecidae) 왕지렁이속 (genus Amynthas) 그룹을 rDNA ITS 유전자를 이용하여 계통 유연관계를 알아보고자 하였다. 2과 10속에서 26종의 DNA 염기서열을 이용하여 종간 계통적 유연관계를 MP (Maximum Parsimony), NJ (Neighbor Joining), QP (Quartet Puzzling)로 계통도를 작성하였다. 염기서열이 확보된 Megascolecidae (지렁이과)의 국내외 26종에 대한 계통 분석은 위 3개의 알고리즘 모두 동일한 5개의 그룹으로 나뉘는 것을 확인하였다. 또한 Amynthas 속은 크게 한국산 그룹과 필리핀산 그룹으로 구분되었다. 첫 번째 그룹, Amynthas jirensis, A. agrestis, A. gucheonensis, A. sopaikensis, A. bubonis, A. multimaculatus, A. koreanus, A. dageletensis, A. heteropodus, A. odaesanensis, Pontoscolex sp., Pheretima sp. 1와 다른 그룹, Dendropheretima banahawensis. Amynthas halconensis, A. isarogensis, A. mindrooensis, Pithemera sp. 2, Pithmera sp. 1, and Pleionogaster sp.이다. 이는 ITS 유전자가 속간의 차이를 보여주는 것보다 동일한 속이라 하더라도 지리적 차이에 따른 환경의 영향을 받았음을 알 수 있다. 즉 형태적 분화가 이루어졌다고 하더라도 유전적으로는 동질성을 나타내고 있음을 알 수 있다. 형태적 특징에 의한 명백한 차이는 구분되지 않았다.
Phylogeny of the species mainly from the genus Amynthas in family Megascolecidae was inferred at the molecular level using ITS regions in rDNA. With 26 species of earthworms from 10 genera in 2 families, a stretch comprising the 3'-end of the 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, and 5' end of 28S rRNA w...
Phylogeny of the species mainly from the genus Amynthas in family Megascolecidae was inferred at the molecular level using ITS regions in rDNA. With 26 species of earthworms from 10 genera in 2 families, a stretch comprising the 3'-end of the 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, and 5' end of 28S rRNA was amplified by applying the primers ITS-1, ITS-2. Phylogenetic analyses of nucleotide sequences with a help of MP, NJ, and QP yielded 5 groups similarly. Genus Amynthas was separated largely into two groups, Korean and Philippine origins. Species grouped into the 1st were Amynthas jirensis, A. agrestis, A. gucheonensis, A. sopaikensis, A. bubonis, A. multimaculatus, A. koreanus, A. dageletensis, A. heteropodus, A. odaesanensis, Pontoscolex sp., Pheretima sp. 1, and Dendropheretima banahawensis. Amynthas halconensis, A. isarogensis, A. mindrooensis, Pithemera sp. 2, Pithmera sp. 1, and Pleionogaster sp. clustered into one clade forming the 2nd group. Polypheretima sp. 1 and polypheretima. sp. 2 stayed closely together representing a separate monophyletic status, forming the 3rd group, apart from species in other genera. Archipheretima sp. falls into the 4th group. Distinct morphological characteristics from Archipheretima also coinsides with its branching away from others in the previously reported molecular analyses. Similar to Perionyx excavatus that has been selected as an outgroup, Aporrectodea tuberculata also showed a long branch in the phylogram, but it differed from other 24 species included in the analyses. Unlike others, for example, its habitat is very closely related to that of man.
Phylogeny of the species mainly from the genus Amynthas in family Megascolecidae was inferred at the molecular level using ITS regions in rDNA. With 26 species of earthworms from 10 genera in 2 families, a stretch comprising the 3'-end of the 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, and 5' end of 28S rRNA was amplified by applying the primers ITS-1, ITS-2. Phylogenetic analyses of nucleotide sequences with a help of MP, NJ, and QP yielded 5 groups similarly. Genus Amynthas was separated largely into two groups, Korean and Philippine origins. Species grouped into the 1st were Amynthas jirensis, A. agrestis, A. gucheonensis, A. sopaikensis, A. bubonis, A. multimaculatus, A. koreanus, A. dageletensis, A. heteropodus, A. odaesanensis, Pontoscolex sp., Pheretima sp. 1, and Dendropheretima banahawensis. Amynthas halconensis, A. isarogensis, A. mindrooensis, Pithemera sp. 2, Pithmera sp. 1, and Pleionogaster sp. clustered into one clade forming the 2nd group. Polypheretima sp. 1 and polypheretima. sp. 2 stayed closely together representing a separate monophyletic status, forming the 3rd group, apart from species in other genera. Archipheretima sp. falls into the 4th group. Distinct morphological characteristics from Archipheretima also coinsides with its branching away from others in the previously reported molecular analyses. Similar to Perionyx excavatus that has been selected as an outgroup, Aporrectodea tuberculata also showed a long branch in the phylogram, but it differed from other 24 species included in the analyses. Unlike others, for example, its habitat is very closely related to that of man.
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문제 정의
1999). 동물계 의 종 식 별용 유전자로 주로 사용되는 부위는 ITS와 CO1, 그리고 cyto b를 많이 이용하고 있으나, 본 연구에서는 ITS 유전자 부위를 사용하여 연구자들에 의해서 분류학적으로 논란이 되고 있는 지렁이과내 왕지렁이속 그룹에 대해 분자생물학적인 방법을 이용하여 종간, 속간 유연관계 및 지리적 분포와의 관계를 알아보고자 하였다. 또한 국내에서 우점종인 Amynthas 속의 종들은 동남아지역에서 주로 채집되는 그룹과는 다른 점에 착안하여 Amynthas를 중심으로 한 Pheretima-complex 그룹의 분류학적 난 점에 도움이 되고자 본 연구를 수행하였다.
따라서 여기에서는 MP를 중심으로 기술하였다. 또한 Amynthas 속은 크게 한국산 그룹과 필리핀산 그룹으로 구분되었다.
동물계 의 종 식 별용 유전자로 주로 사용되는 부위는 ITS와 CO1, 그리고 cyto b를 많이 이용하고 있으나, 본 연구에서는 ITS 유전자 부위를 사용하여 연구자들에 의해서 분류학적으로 논란이 되고 있는 지렁이과내 왕지렁이속 그룹에 대해 분자생물학적인 방법을 이용하여 종간, 속간 유연관계 및 지리적 분포와의 관계를 알아보고자 하였다. 또한 국내에서 우점종인 Amynthas 속의 종들은 동남아지역에서 주로 채집되는 그룹과는 다른 점에 착안하여 Amynthas를 중심으로 한 Pheretima-complex 그룹의 분류학적 난 점에 도움이 되고자 본 연구를 수행하였다. 본 논문에서 취급한 한국과 필리핀을 제외한 동남아시아의 다른 지역, 즉 베트남, 중국, 라오스 등의 Pheretima-complex 그룹의 다른 종들을 추가하여, 차후 이 분류 그룹에 대한 계통을 알아보는데 도움이 되고자 한다.
또한 국내에서 우점종인 Amynthas 속의 종들은 동남아지역에서 주로 채집되는 그룹과는 다른 점에 착안하여 Amynthas를 중심으로 한 Pheretima-complex 그룹의 분류학적 난 점에 도움이 되고자 본 연구를 수행하였다. 본 논문에서 취급한 한국과 필리핀을 제외한 동남아시아의 다른 지역, 즉 베트남, 중국, 라오스 등의 Pheretima-complex 그룹의 다른 종들을 추가하여, 차후 이 분류 그룹에 대한 계통을 알아보는데 도움이 되고자 한다.
(2배엽성 동물과 모기). 본 연구에서는 ITS 유전자에 대한 실험을 진행하여 지렁이과 분류군에 대한 계통을 추적하여 보았다. 하지만 본 실험에서도 나타난 바와 같이 속 이하의 그룹을 계통분류 하는데 있어서는 한 종류의 유전자 부위가 아니라, 다른 유전자 부위를 같이 분석한다면 더욱 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있으리라 생각된다.
지 렁 이 과 (family Megascolecidae) 왕지 렁 이 속 (genus Amynthas) 그룹을 rDNA ITS 유전자를 이용하여 계통 유연관계를 알아보고자 하였다. 2과 10속에서 26종의 DNA 염기서열을 이용하여 종간 계통적 유연관계를 MP (Maximum Parsimony), NJ (Neighbor Joining), QP (Quartet Puzzling)로 계통도를 작성하였다.
제안 방법
밝혔다. 2과 10속 26종에 대한 ITS 전체 염기서열을 구했으며, 정렬된 염기서열을 바탕으로 종간 계통 유연관계를 확인하기 위하여 MP (Maximum Parsimony), NJ (Neighbor Joining), QP (Quartet Puzzling)로 계통도를 작성하였다 (Fig. 1). 계통도에 나타난 특징적 결과를 살펴보면 다음과 같다.
알아보고자 하였다. 2과 10속에서 26종의 DNA 염기서열을 이용하여 종간 계통적 유연관계를 MP (Maximum Parsimony), NJ (Neighbor Joining), QP (Quartet Puzzling)로 계통도를 작성하였다. 염기서열이 확보된 Megascolecidae(지렁이과)의 국내외 26종에 대한 계통분석은 위 3개의 알고리즘 모두 동일한 5개의 그룹으로 나뉘는 것을 확인하였다.
Genomic DNA 추출은 kit (Qiagen)를 사용하였으며, 추출한 genomic DNA로부터 ITS 염기서열을 분석하기 위하여 지렁이 genomic DNA를 주형으로 한 PCR을 수행하였다. PCRe 94℃에서 30초, 63℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초의 조건으로 35 cycles를 수행하였다.
Maximum Parsimony 분석은 P* AUP 에서 Heuristic search를 1,000회 반복 실행하였고, Neighbor Joining 분석 또한 P* AUP 에서 실행 하였으며 , GTR (general time- reversible) model를 이용하여 1,000회 반복하였다. Quartet Puzzlinge Tree-Puzzle에서 실행하여 HKY (Hasegawa -Kishino-Yano) model로 계통분석을 하였다.
PCR 산물을 1.0% agarose gel에서 80 V로 전개하여 그 band 양상을 확인하였으며, HiYield Gel/PCR DNA fragments Extraction Kit (RBC)를 이용하여 PCR산물을 추출하였다. 추출한 plasmid의 염기서열을 각각 forward(T7), reverse (SP6) primer로 분석하여 ITS 염기서 열을 확인하였다.
PCRe 94℃에서 30초, 63℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초의 조건으로 35 cycles를 수행하였다. 반응에 사용한 ITS primer는 다음과 같다.
본 연구에서는 2과 10속에서 26종의 18S rRNA gene 의 3'말단부터 ITS1, 5.8S rRNA gene, ITS2, 28S rRNA gene 5'의 일부분을 포함하는 영역까지 총 DNA 염기서열 1, 413개중에서 G-Block를 실행하여 뽑힌 924개의 염기서열을 가지고 이들 사이의 계통 유연관계를 분석하였다. 이 염 기서 열 가운데 에는 primer부분인 18S (152 bp), 28S (164 bp)를 포함하였으며, ITS2 사이의 5.
8S rRNA gene, ITS2, 28S rRNA gene 5'의 일부분을 포함하는 영역까지 총 DNA 염기서열 1, 413개중에서 G-Block를 실행하여 뽑힌 924개의 염기서열을 가지고 이들 사이의 계통 유연관계를 분석하였다. 이 염 기서 열 가운데 에는 primer부분인 18S (152 bp), 28S (164 bp)를 포함하였으며, ITS2 사이의 5.8S (146 bp)도 포함하여 분석하였다.
0% agarose gel에서 80 V로 전개하여 그 band 양상을 확인하였으며, HiYield Gel/PCR DNA fragments Extraction Kit (RBC)를 이용하여 PCR산물을 추출하였다. 추출한 plasmid의 염기서열을 각각 forward(T7), reverse (SP6) primer로 분석하여 ITS 염기서 열을 확인하였다.
확보된 염기서열을 바탕으로 Clustal X, MEGA, * PAUP 등의 분석 프로그램을 이용하여 계통적 유연관계를 밝혔다. 2과 10속 26종에 대한 ITS 전체 염기서열을 구했으며, 정렬된 염기서열을 바탕으로 종간 계통 유연관계를 확인하기 위하여 MP (Maximum Parsimony), NJ (Neighbor Joining), QP (Quartet Puzzling)로 계통도를 작성하였다 (Fig.
대상 데이터
또한 필리핀은 중국이나 베트남 등지와는 달리 Pithemera, Metapheretima, Polypheretimatima 등의 개 체들이 다양하게 출현하는 지역이고, 최근 신속으로 기재된 Dendro-pheretima가 서식하는 지역이다. 또한 본 연구에서는 한국산 왕지렁이와 비교하기 위하여 최근 채집한 필리핀산 왕지렁이 3종을 포함하였다. 빈모강 내에서 지렁이과의 Pheretima-complex에 대한 계통상의 위치를 추론하기 위한 분석에서 사용된 분류군은 Table 1과 같다.
국내에 기재된 80종의 왕지렁이속 가운데는 1930 년대와 60년대에 기재되고, 다시 채집되지 않는 종들이 대부분이다. 본 논문에서는 최근에 채집이 빈번하게 되는 종들과, 우리나라 주변국가 중 표본을 용이하게 확보할 수 있는 필리핀을 선택하였다. 필리핀은 현재 국내에는 단 1종도 보고되 지 않은 Pheretima 속에 포함하는 종들이 대부분으로 (James 2004) 왕지렁이속 (Amynthas)으로 9종만이 보.
본 연구에서 사용한 유전자는 rDNA의 ITS 이다. 이 유전자는 상위 분류군이 아니라 속 내, 종 또는 개체군간 유연 정도를 알아볼 때 주로 사용되는 유전자로써 식물에서 많이 이용하고 있으며, 최근에는 동물 그룹에서도 그 이용이 증가되고 있다(Baldwin et al.
채집은 지렁이가 많이 서식하고 있는 국내외 삼림에서 식생, 토양형태, 토양 내의 위치 등을 고려하여 지렁이가 성적으로 성숙하고 활동이 가장 활발한 시기인 7 월에서 10월 사이에 실시하였다. 동정 및 분류는 Sims and Easton(1972), Easton(1979, 1982)의 기재를 참고하였다.
데이터처리
사용하여 정렬하였다. Sequence alignment는 DNA 염기서열을 기초로 한 분자계통 연구에서 편중되지 않은 객관적인 계통수를 얻는데 있어 중요한 요소 중 하나이므로 (Castresana 2000) Clustal X를 이용해 aligned된 sequence file을 최근에 고안된 G-Block (http://www. embl-heidelberg.de/~castresa/Gblocks/Documentation/ Gblocks_documentation.html) program을 이용하여 신뢰성 있는 realignment를 수행하고 이를 바탕으로 P* AUP (Swofford 2002)과 Tree-Puzzle 5.0 program 을 이용하여 계통분석을 실시하였다.
즉, 차후 이 ITS 와 더불어서, C이과 cyto b에 대한 실험을 진행하여 이들 유전자에 대한 지렁이, 특히 국내에서 많이 서식하고 있는 지렁이과 그룹, 종에 대한 유연관계를 확인할 수 있을 것이다. 부가적으로 모델테스트 프로그램을 통해서 GTR+I+G 모델이 선택되었고, 선택된 모델을 Bayesian 프로그램에 적용하여 계통분석 결과를 얻었다. 같은 Perionyx excavatus 종을 outgroup으로 하여 1,000, 000번 분석한 결과, PAUP로 분석된 계통도와 다른 점을 발견하지 못했는데 이는 PAUP를 통해서 분석한 결과를 강하게 뒷받침 해주고 있다.
3. 데이터 분석
분류군들로부터 얻어진 염기서열을 Clustal X program 을 사용하여 정렬하였다. Sequence alignment는 DNA 염기서열을 기초로 한 분자계통 연구에서 편중되지 않은 객관적인 계통수를 얻는데 있어 중요한 요소 중 하나이므로 (Castresana 2000) Clustal X를 이용해 aligned된 sequence file을 최근에 고안된 G-Block (http://www.
이론/모형
Quartet Puzzlinge Tree-Puzzle에서 실행하여 HKY (Hasegawa -Kishino-Yano) model로 계통분석을 하였다.
10월 사이에 실시하였다. 동정 및 분류는 Sims and Easton(1972), Easton(1979, 1982)의 기재를 참고하였다. 국내에 기재된 80종의 왕지렁이속 가운데는 1930 년대와 60년대에 기재되고, 다시 채집되지 않는 종들이 대부분이다.
성능/효과
1 및 Polypheretima sp. 2 종은 단계 통을 형 성 하는데, 이 Polypheretima 속에 속하는 2종은 다른 속에 속하는 종들에 비하여 훨씬 뚜렷하게 나누어지는 것을 확인할 수가 있다. 이 Polypheretima 속은 Metapheretima 속에 속하는 종들 중 일부 다른 형태적 특징에 의해서 Easton(1979)에 의해서 새로운 속으로 나누어 진 바 있다.
부가적으로 모델테스트 프로그램을 통해서 GTR+I+G 모델이 선택되었고, 선택된 모델을 Bayesian 프로그램에 적용하여 계통분석 결과를 얻었다. 같은 Perionyx excavatus 종을 outgroup으로 하여 1,000, 000번 분석한 결과, PAUP로 분석된 계통도와 다른 점을 발견하지 못했는데 이는 PAUP를 통해서 분석한 결과를 강하게 뒷받침 해주고 있다.
염 기서 열 이 확보된 Megascolecidae (지 렁 이 과)의 국내외 26종에 대한 계통분석은 위 3개의 알고리즘 모두 동일한 5개의 그룹으로 나뉘는 것을 확인하였다. 따라서 여기에서는 MP를 중심으로 기술하였다.
염 기서 열 이 확보된 Megascolecidae (지 렁 이 과)의 국내외 26종에 대한 계통분석은 위 3개의 알고리즘 모두 동일한 5개의 그룹으로 나뉘는 것을 확인하였다. 따라서 여기에서는 MP를 중심으로 기술하였다.
이 그룹 종들의 특징은 국내에서는 전혀 채집되지 않고, 필리핀에서 채집된 종이었다. 특히 국내에서 채집되는 Amynthas 속의 종과는 달리 필리핀에서 채집된 3 종의 Amynthas 종은 이 두 번째 그룹에 모두 속하는 것으로 확인되었다. 이는 동일한 속이라 하더라도 지리적 차이에 따른 환경의 영향을 받았음을 알 수 있다.
후속연구
Amynthas 속의 다른 종들은 2쌍의 저장낭을 가지고 있으나 이들 종은 저장낭이 많은 쪽에서 적은 방향으로 진화를 하고 있다는 Thai (1983)의 가설과도 일치하는 경향을 보인다. 앞으로 mtDNA의 다른 유전자 부위를 비교하여 금번 연구에서 나타난 부분을 확인할 필요성이 있다.
하지만 본 실험에서도 나타난 바와 같이 속 이하의 그룹을 계통분류 하는데 있어서는 한 종류의 유전자 부위가 아니라, 다른 유전자 부위를 같이 분석한다면 더욱 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있으리라 생각된다. 즉, 차후 이 ITS 와 더불어서, C이과 cyto b에 대한 실험을 진행하여 이들 유전자에 대한 지렁이, 특히 국내에서 많이 서식하고 있는 지렁이과 그룹, 종에 대한 유연관계를 확인할 수 있을 것이다. 부가적으로 모델테스트 프로그램을 통해서 GTR+I+G 모델이 선택되었고, 선택된 모델을 Bayesian 프로그램에 적용하여 계통분석 결과를 얻었다.
즉 분석에 사용된 다른 종들은 환대가 제14마디에서 시작하여 16마디에서 끝나는 전형적인 지렁이과 종류의 특징을 보여주고 있다. 차후, 다른 유전자, 즉 mtDNA 유전자 분석을 통하여 이러한 내용을 지지해주는 결과가 도출된다면 형태적 형질에 있어서 환대의 중요성, 또한 지렁이과 내에서 이 속에 속하는 종들의 계통분류학상 위치를 재 논의하는 중요한 단서를 확보할 수 있을 것이다. Archipheretima sp.
본 연구에서는 ITS 유전자에 대한 실험을 진행하여 지렁이과 분류군에 대한 계통을 추적하여 보았다. 하지만 본 실험에서도 나타난 바와 같이 속 이하의 그룹을 계통분류 하는데 있어서는 한 종류의 유전자 부위가 아니라, 다른 유전자 부위를 같이 분석한다면 더욱 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있으리라 생각된다. 즉, 차후 이 ITS 와 더불어서, C이과 cyto b에 대한 실험을 진행하여 이들 유전자에 대한 지렁이, 특히 국내에서 많이 서식하고 있는 지렁이과 그룹, 종에 대한 유연관계를 확인할 수 있을 것이다.
참고문헌 (28)
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