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문제 정의
- 본 연구에서는 많은 암세포에 세포독성을 나타내어 화학적 암 예방제로 개발하고자 하는 후박 열수 추출물에 대한 유전독성 여부를 평가하였다. 유전독성 평가는 식품의약품안전청고시 저]1999-61 호의 "의약품 등의 독성시험기준"에 따라 실시하였으며, Salmonella typhimurium을 이용한 복귀돌연변이시험과 포유동물 배양세 포를 이용한 염색체 시험, 그리고 소핵 시험을 수행하였다.
제안 방법
- 예비독성시험을 실시하였다. 1X105 세포를 사용하였고, 6시간 동안 추출물을 농도별(공비 2로 5 단계의 농도)로 처리하고 0.4% trypan blue로 염색하여 염색 세포 수를 세어서 세포증식을 50% 억제하는 농도를 산출하고 본 시험의 최고농도로 하였다. 양성대조물질인 mitomycin C(MMC}은 멸균 증류수에 그리고 Benzo(a)pyrene (B(a)l가은 DIMS에 용해하여 각각 1과 20)ig/ml의 농도로 사용하였다.
-
Salmonella typhimurium을 이용한 복귀돌연변이시험.
- 세포를 KCI 저장액(37。0에서 20분간 방치 후, 고정액(methanol : glacial acetic acid = 3 : 1)Q로 3번 반복하여 고정시킨 후 slide를 제작하였다. Slide를 완전하게 말린 후, 5% Giemsa(Gibco-lnvitrogen Corporation Inc. of Grand Island, NY, USA) 용액으로 염색하고 현미경으로 관찰하였다. 한 농도시험 당 100개의 세포분열 중 기상을 현미경하(L000X)에서 염색체이상을 유무를 관찰하였다.
- 2 배양액에 접종한 다음 37℃에 16시간 동안 200회/분의 속도로 선회 배양하였다. 각 균주는 본시험에 앞서 histidine 요구성, crystal violet 감수성, UV 감수성 , ampicillin 또는 tetracycl in 내성 및 자발복귀 돌연변이 빈도 등의 유전적인 특성을 확인하였다.
- 관찰하여 1, 。0。개의 다염성적혈구에서의 소핵 출현 빈도수를 계수하였다. 시험물질의 농도를 2 g/kg, 1 g/kg, 0.
- 염색체이상은 크게 구조이상(structural aberration)^ 수적이상(numerical aberration)으로 분류하였고, 구조이상은 gap(chromatid and chromosome gap), ctb(chromatid break), cte(chromatied exchange), csb (chromosome break), cse(chromosome exchange)으로 구분하여 기록하였다. 구조이상의 종류를 1개 이상 갖는 세포를 양성세포 1개로 계수하고 그 종류를 각각 기록하였다. 염색체이상의 수가 통계학적으로 유의성 있게 용량 의존적으로 증가하거나 하나이상의 용량단계에서 제현성 있게 양성반응을 나타낼 경우를 양성으로 하였다.
- 배양종료 후 45℃에서 용해한 top agar(연한천 용액) 2 ml를 첨가하여 잘 혼합한 후, 변이원성 검색용 (Vogel-Bonner minimal medium E) 위에 중층 하여 37℃에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 콜로니 수를 계측하였다. 균의 생육저해와 시험물질의 침전, 분출을 육안 및 실체현미경을 사용하여 관찰하였다. 독성여부의 판정을 위해서는 각 용량 당 3장의 plate를 사용하여 복귀변이성 콜로니 수의 평균치를 구하였다.
- 25% trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 배양 용기로부터 떼어낸 후 원심 분리하여 세포를 모았다. 대사활성 부재하의 시험은 CHO 세포를 Petri dish에서 3일간 배양 후 시험물질(37.5 Mg/plate~600 pg/plate) 및 양성대조물질(mitomycin C, 1 μg/ml) 함유 배양액을 첨가하여 24시간 배양하였고, 세포 수거 2시간 전에 colce-mid(Gibco-lnvitrogen Corporation Inc. of Grand Island, NY, USA)를 처리한 후, 0.25% trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 배양용기로부터 떼어낸 후 원심 분리하여 세포를 모았다. 세포를 KCI 저장액(37。0에서 20분간 방치 후, 고정액(methanol : glacial acetic acid = 3 : 1)Q로 3번 반복하여 고정시킨 후 slide를 제작하였다.
- 예비 독성시험에서 결정된 50% 세포독성농도를 최고 농도로 하고, 공비 2로 3단계의 농도를 시험농도로 하였다. 대사활성 존재하의 시험은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 Petri dish에서 3일간 배양 후 시험물질(50)ig/plate~ 800 μg/plate) 및 양성대조물질(Benzo(a)pyrene, 20 pig/ml) 함유 배양액에 S-9 혼합액(배양액의 20%)을 첨가하여 6시간 배양하고 보통배양액으로 교환하여 18시간 이상 더 배양하였고 세포 수거 2시간 전에 colcemid(Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA))를' 처리한 후, 0.25% trypsin-EDTA를 사용하여 세포를 배양 용기로부터 떼어낸 후 원심 분리하여 세포를 모았다. 대사활성 부재하의 시험은 CHO 세포를 Petri dish에서 3일간 배양 후 시험물질(37.
- 균의 생육저해와 시험물질의 침전, 분출을 육안 및 실체현미경을 사용하여 관찰하였다. 독성여부의 판정을 위해서는 각 용량 당 3장의 plate를 사용하여 복귀변이성 콜로니 수의 평균치를 구하였다. 시험물질을 처리한 모든 군에서 복귀변이성 콜로니 수가 TA 98과 TA 100 균주에서는 음성 대조군의 2배 이상이고 7A 1535에서는 3배 이상이며, 용량반응관계가 인정될 때, 복귀변이 유발 능양성으로 판정하였다 (Kim and Margolin, 1999).
- 돌연변이 복귀 시험을 위하여 균주는 Salmonella typhimurium LT2주 유래의 histidine 요구성 변이균주인 TA 98, TA 100 그리고 TA 1535를 사용하여 0.8% oxo id nutrient broth No. 2 배양액에 접종한 다음 37℃에 16시간 동안 200회/분의 속도로 선회 배양하였다. 각 균주는 본시험에 앞서 histidine 요구성, crystal violet 감수성, UV 감수성 , ampicillin 또는 tetracycl in 내성 및 자발복귀 돌연변이 빈도 등의 유전적인 특성을 확인하였다.
- 소핵 관찰은 2명의 관찰자에 의해 맹검법으로 검경 하였다. 마우스 1마리당 1,000개의 적혈구에서 다염성적혈구(polychromatic erythrocyte, PCE)와 정염성적혈구(normochromatic erythrocyte, NCE)의 비를 구하고, 다시 1,000개의 PCE 중에서 소핵을 가진 다염성 적혈구(micronucleated PCE, MNPCE)의 출현빈도를 구하였다. 계수 시 소핵의 크기는 세포 직경의 1/2로부터 식별 가능한 범위까지로 하였으며, 주변 유핵세포의 핵과 염색상이 동일한 것을 선택하였다.
-
마우스 골수세포를 이용한 소핵시험.
- 1 ml을 첨가하였다. 배양종료 후 45℃에서 용해한 top agar(연한천 용액) 2 ml를 첨가하여 잘 혼합한 후, 변이원성 검색용 (Vogel-Bonner minimal medium E) 위에 중층 하여 37℃에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 콜로니 수를 계측하였다. 균의 생육저해와 시험물질의 침전, 분출을 육안 및 실체현미경을 사용하여 관찰하였다.
- 본 시험에서는 투여 량 및 표본제작시기의 결정을 위하여 Hayashi et al(1984)의 투망법에 따라 각 군에 수컷 2마리씩을 배정하여 50% 의치 사랑을 구하였으며, 생리식염수 10ml/kg을 용매 대조군으로, mitomycin C 2 ㎎/㎏을 양성 대조군으로 설정하였다.
- 004%의 구연산 (Citric acid) 수용액에 수초간 담근 후 증류수에 수회 세척하고 공기 중에서 건조시켰다. 소핵 관찰은 2명의 관찰자에 의해 맹검법으로 검경 하였다. 마우스 1마리당 1,000개의 적혈구에서 다염성적혈구(polychromatic erythrocyte, PCE)와 정염성적혈구(normochromatic erythrocyte, NCE)의 비를 구하고, 다시 1,000개의 PCE 중에서 소핵을 가진 다염성 적혈구(micronucleated PCE, MNPCE)의 출현빈도를 구하였다.
- 수컷 ICR mice 에 대한 복강급성독성시험 결과, 후박열수추출물은 5 g/ kg, 2 g/kg 그리고 0.5 g/kg에서 독성을 나타내지 않아, 소핵시험은 2 g/kg, 1 g/kg 그리고 0.5 g/kg의 용량으로, 시험용량의 공비는 2로 3단계의 용량을 설정하여 실시하였다. 수컷 ICR mice는 군당 5마리로 후박열수추출물을희 복강 투여 후 48시간이 경과하였을 때 골수를 채취하여 표본을 제작하였다.
- 5 g/kg의 용량으로, 시험용량의 공비는 2로 3단계의 용량을 설정하여 실시하였다. 수컷 ICR mice는 군당 5마리로 후박열수추출물을희 복강 투여 후 48시간이 경과하였을 때 골수를 채취하여 표본을 제작하였다. 제작된 표본 도말면의 세포밀도를 현미경으로 관찰하였고, 골수내 미성숙 적혈구에 대한 다염성적혈구의 비와 소핵을 지니는 다염성적혈구의 출현 빈도를 용매대조군에 대해 통계처리 하였다.
- 멸균 정제수와 실험동물용 사료(삼양사료, 경기도 이천)를 자유로이 섭취하도록 하였다. 순화 기간을 거친 모든 동물의 체중을 측정, 20~30g의 범위에 드는 동물을 선별하여 무작위로 각 군에 5마리씩 배분하였다.
- , 1983)에 의하여 확립된 방법을 사용하여 다음의 복귀 돌연변이시험을 수행하였다. 시험물질의 농도 설정을 위한 예비독성시험은 TA 100 균주를 사용하였으며, 5 mg/plate* 최고농도로 하고 공비 2로 5단계 농도를 취하여 균주에 처리하였으며 직접법과 S-9 혼합액을 이용한 대사 활성법을 수행하였다. 예비독성시험 결과 5,000, 2, 500, 1, 250, 625, 313 μg/plate의 농도에서 시험물질에 의한 세포독성이 보이지 않아 본시험에서도 동일한 5,000, 2, 500, 1, 250, 625, 313 pig/plate5] 농도를 사용하였다.
- 계수하였다. 시험물질의 농도를 2 g/kg, 1 g/kg, 0.5g/kg로 하고 각각의 용량을 1회 복강투여 후 48시간째에 소핵을 관찰하였다. 경추탈골로 희생한 동물의 양쪽 대퇴골로부터 골수를 0.
- 그 결과 S9 혼합물 존재 시 최고농도는 800 μg/ mL으로, S9 혼합물 부재 시 최고농도는 600 μg/ml으로 결정되었다. 시험의 적용용량은 S9 혼합물 존재 시 800 μg/plate를 최고용량으로 하여 공비 2로 5단계를 설정하여 , 50 μg/plate~800 μg/plate로 실험하였고, S9 혼합물 부재 시 600 pig/plate를 최고용량으로 하여 공비 2로 5 단계를 설정하여, 37.5 jig/plate~600 Mi/plate로 실험하였다. Table 2에 정리한 것 같이, S9 혼합물 부재 시 후박 열수 추출물 시험군은 모든 용량에서 염색체이상의 유의적인 증가 및 용량의존성을 나타내지는 않았다.
- 한 농도시험 당 100개의 세포분열 중 기상을 현미경하(L000X)에서 염색체이상을 유무를 관찰하였다. 염색체이상은 크게 구조이상(structural aberration)^ 수적이상(numerical aberration)으로 분류하였고, 구조이상은 gap(chromatid and chromosome gap), ctb(chromatid break), cte(chromatied exchange), csb (chromosome break), cse(chromosome exchange)으로 구분하여 기록하였다. 구조이상의 종류를 1개 이상 갖는 세포를 양성세포 1개로 계수하고 그 종류를 각각 기록하였다.
- 구조이상의 종류를 1개 이상 갖는 세포를 양성세포 1개로 계수하고 그 종류를 각각 기록하였다. 염색체이상의 수가 통계학적으로 유의성 있게 용량 의존적으로 증가하거나 하나이상의 용량단계에서 제현성 있게 양성반응을 나타낼 경우를 양성으로 하였다.
- 예비 독성시험에서 결정된 50% 세포독성농도를 최고 농도로 하고, 공비 2로 3단계의 농도를 시험농도로 하였다. 대사활성 존재하의 시험은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 Petri dish에서 3일간 배양 후 시험물질(50)ig/plate~ 800 μg/plate) 및 양성대조물질(Benzo(a)pyrene, 20 pig/ml) 함유 배양액에 S-9 혼합액(배양액의 20%)을 첨가하여 6시간 배양하고 보통배양액으로 교환하여 18시간 이상 더 배양하였고 세포 수거 2시간 전에 colcemid(Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA))를' 처리한 후, 0.
- 시험물질의 농도 설정을 위한 예비독성시험은 TA 100 균주를 사용하였으며, 5 mg/plate* 최고농도로 하고 공비 2로 5단계 농도를 취하여 균주에 처리하였으며 직접법과 S-9 혼합액을 이용한 대사 활성법을 수행하였다. 예비독성시험 결과 5,000, 2, 500, 1, 250, 625, 313 μg/plate의 농도에서 시험물질에 의한 세포독성이 보이지 않아 본시험에서도 동일한 5,000, 2, 500, 1, 250, 625, 313 pig/plate5] 농도를 사용하였다. 각 균주는 행동시켜 nutrient broth(Becton Dickinson)에 접종한 후 37℃에서 10시간 동안 180회/분의 속도로 진탕 배양 하였다.
- 양성대조물질인 mitomycin C(MMC}은 멸균 증류수에 그리고 Benzo(a)pyrene (B(a)l가은 DIMS에 용해하여 각각 1과 20)ig/ml의 농도로 사용하였다. 음성대조물질은 각각의 용매를 사용하였고, 모든 시험은 2회 반복하여 수행하였다.
- 수컷 ICR mice는 군당 5마리로 후박열수추출물을희 복강 투여 후 48시간이 경과하였을 때 골수를 채취하여 표본을 제작하였다. 제작된 표본 도말면의 세포밀도를 현미경으로 관찰하였고, 골수내 미성숙 적혈구에 대한 다염성적혈구의 비와 소핵을 지니는 다염성적혈구의 출현 빈도를 용매대조군에 대해 통계처리 하였다. 통계처리 결과, 후박열수추출물은 유의성 있는 소핵 유발 능은 나타내지 않았다.
- 포유동물세포인 Chinese hamster ovary(CHO) cells을 5% CO2 배양기에서 37℃ 온도로 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco-lnvitrogen Corporation Inc. of Grand Island, NY, USA)과 의 penicillin과 10pig/ml의 streptomycin0] 포함된 Eagle's minimum essential medium(EMEM, Gibco-lnvitrogen Corporation Inc. of Grand Island, NY, USA)에 단층 배양하였다.
- of Grand Island, NY, USA) 용액으로 염색하고 현미경으로 관찰하였다. 한 농도시험 당 100개의 세포분열 중 기상을 현미경하(L000X)에서 염색체이상을 유무를 관찰하였다. 염색체이상은 크게 구조이상(structural aberration)^ 수적이상(numerical aberration)으로 분류하였고, 구조이상은 gap(chromatid and chromosome gap), ctb(chromatid break), cte(chromatied exchange), csb (chromosome break), cse(chromosome exchange)으로 구분하여 기록하였다.
- 후박 열수추출물은 Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 그리고 TA 1535 균주에 처리되었고, 복귀돌연변이 활성은 대사활성계의 존재(+S9)와 부재하 (-S9)에서 실험하였다. 시험의 적용용량은 5,000 μg/plate를 최고용량으로 하여 공비 2로 5단계를 설정하여, 312eg/plate~ 5, 000 μg/plate로 실험하였고, 실험결과는 Table 1에 정리하였다.
- 후박에서 추출한 시험물질은 멸균증류수에 희석하였고 시험물질의 농도를 결정하기 위하여 예비독성시험을 실시하였다. 1X105 세포를 사용하였고, 6시간 동안 추출물을 농도별(공비 2로 5 단계의 농도)로 처리하고 0.
- 후박열수추출물은 대사활성계의 존재 (+S9}와 부재하(-S9)의 Chinese Hamster Ovary(CHO) cell line에 처리되었다. 이 실험에서 적용용량 결정은 MTT assay 변형 방법인 CCK-8 cell proliferation assay kit(Dojindo, Japan)을 이용하여 수행하였다.
대상 데이터
- 모든 화학물질은 분석용(Analytical grade 또는 highest grade) 시약을 사용하였고, S-9 혼합액은 MOLTOX Inc.(Molecular Toxicology Inc. of Boone NC 28607 USA)에서 11-01L RAT LIVER LS-9을 구입, 조제하여 사용하였다.
- 시험물질은 4(2에 보관하였으며, 시험당일에 증류수에 용해시켜 사용하였다. Eagle's minimum essential medium(EMEM), 0.25% trypsin-EDTA, trypan blue, colcemide, fetal bovine serum(FBS)t Invitro- gen(Gibco-lnvitrogen Corporation Inc. of Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 모든 화학물질은 분석용(Analytical grade 또는 highest grade) 시약을 사용하였고, S-9 혼합액은 MOLTOX Inc.
- 1 ml/plate가 되도록 제조하여 사용하였다. 각각의 균주에 대한 양성대조물질 sodium azide(SA), 2- aminoanthracene(2-AA)은 DMS에 용해하여 사용하였고 음성대조물질로 멸균증류수를 사용하였다.
- 실험기간 중의 실험동물은 격리용 마우스 커 이지([주]삼광, 충남 금산당 5마리씩 수용하였고, 사육실 환경조건은 실내온도 23 ± 3℃, 상대습도 55 ± 10%, 조명시간 12시간(오전 7시~오후 7시), 조도는 150~200 lux로 조절되었다. 멸균 정제수와 실험동물용 사료(삼양사료, 경기도 이천)를 자유로이 섭취하도록 하였다. 순화 기간을 거친 모든 동물의 체중을 측정, 20~30g의 범위에 드는 동물을 선별하여 무작위로 각 군에 5마리씩 배분하였다.
- 생후 5주된 수컷과 암컷 ICR 마우스를 (주) 중앙실험동물로부터 구입하여, 1주간 순화시키면서 일반증상을 관찰하고, 체중을 측정하여 건강한 것만을 선별하여 사용하였다. 실험기간 중의 실험동물은 격리용 마우스 커 이지([주]삼광, 충남 금산당 5마리씩 수용하였고, 사육실 환경조건은 실내온도 23 ± 3℃, 상대습도 55 ± 10%, 조명시간 12시간(오전 7시~오후 7시), 조도는 150~200 lux로 조절되었다.
- 사용하였다. 실험기간 중의 실험동물은 격리용 마우스 커 이지([주]삼광, 충남 금산당 5마리씩 수용하였고, 사육실 환경조건은 실내온도 23 ± 3℃, 상대습도 55 ± 10%, 조명시간 12시간(오전 7시~오후 7시), 조도는 150~200 lux로 조절되었다. 멸균 정제수와 실험동물용 사료(삼양사료, 경기도 이천)를 자유로이 섭취하도록 하였다.
- 4% trypan blue로 염색하여 염색 세포 수를 세어서 세포증식을 50% 억제하는 농도를 산출하고 본 시험의 최고농도로 하였다. 양성대조물질인 mitomycin C(MMC}은 멸균 증류수에 그리고 Benzo(a)pyrene (B(a)l가은 DIMS에 용해하여 각각 1과 20)ig/ml의 농도로 사용하였다. 음성대조물질은 각각의 용매를 사용하였고, 모든 시험은 2회 반복하여 수행하였다.
- 후박 추출물은 갈색 고형분말로 목련 나무 껍질의 열수추출물이며 충주대 식품공학과에서 제조하였다. 시험물질은 4(2에 보관하였으며, 시험당일에 증류수에 용해시켜 사용하였다.
데이터처리
- (1989)의 방법에 따라 3단계의 통계 처리법을 적용하여 결과를 분석하였다. 1, 2단계의 비교자료 활용에 의한 검정을 거쳐, 3단계에는 음성 대조군과 MNPCE의 출현 빈도에 관한 유의차는 Cochran Armitage 경향 검정법을, PCE의 출현빈도에 관한 유의차는 /-test를 행하였다.
- 복귀돌연변이시험에서 음성 대조군과 각 용량군 사이의 유의성은 two-tailed f-test(p < 0.05}를 이용하여 검정하였다.
- 염색체 이상시험에서 음성대조군과 각 투여군간의 통계적 용량군 사이의 유의성은 Dunnnett0(p < 0.05)를 이용하여 검정하였다.
이론/모형
-
염색체 이상시험:
시험물질의 염색체 이상 여부를 판단하기 위하여 식품의약품안전청고시 제 1999-61 호의 "의약품 등의 독성시험기준"에 따라 실험하였다. 예비 독성시험에서 결정된 50% 세포독성농도를 최고 농도로 하고, 공비 2로 3단계의 농도를 시험농도로 하였다.
- 유전독성 여부를 평가하였다. 유전독성 평가는 식품의약품안전청고시 저]1999-61 호의 "의약품 등의 독성시험기준"에 따라 실시하였으며, Salmonella typhimurium을 이용한 복귀돌연변이시험과 포유동물 배양세 포를 이용한 염색체 시험, 그리고 소핵 시험을 수행하였다.
- Ames(Ames et al., 1975; Maronet at., 1983)에 의하여 확립된 방법을 사용하여 다음의 복귀 돌연변이시험을 수행하였다. 시험물질의 농도 설정을 위한 예비독성시험은 TA 100 균주를 사용하였으며, 5 mg/plate* 최고농도로 하고 공비 2로 5단계 농도를 취하여 균주에 처리하였으며 직접법과 S-9 혼합액을 이용한 대사 활성법을 수행하였다.
- 소핵 시험에서 통계분석eHayashi et al. (1989)의 방법에 따라 3단계의 통계 처리법을 적용하여 결과를 분석하였다. 1, 2단계의 비교자료 활용에 의한 검정을 거쳐, 3단계에는 음성 대조군과 MNPCE의 출현 빈도에 관한 유의차는 Cochran Armitage 경향 검정법을, PCE의 출현빈도에 관한 유의차는 /-test를 행하였다.
- 후박열수추출물은 대사활성계의 존재 (+S9}와 부재하(-S9)의 Chinese Hamster Ovary(CHO) cell line에 처리되었다. 이 실험에서 적용용량 결정은 MTT assay 변형 방법인 CCK-8 cell proliferation assay kit(Dojindo, Japan)을 이용하여 수행하였다. 최고농도는 세포의 성장을 50% 억제하는 농도 (IC사로 결정하였다.
성능/효과
- S9 혼합물 존재 시 또한, 후박열수추출물 시험군은 모든 용량에서 염색체이상의 유의적인 증가 및 용량의존성을 나타내지는 않았다. CHO cell을 이용하여 염색체 이상 시험 결과, 후박열수추출물은 이 실험 조건하에서 염색체 이상을 유발하지 않는 것으로 나타났다.
- 통계처리 결과, 후박열수추출물은 유의성 있는 소핵 유발 능은 나타내지 않았다. Salmonella typhimuriume: 이용한 복귀돌연변이시험, 포유류 배양세포를 이용한 염색체 이상시험 그리고 소핵시험을 통한 유전독성 실험 결과, 후박 열수 추출물은 복귀돌연변이와 염색체 이상을 일으키지 않고 또한, 소핵형성을 유발하지 않으므로 유전독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
- 최고농도는 세포의 성장을 50% 억제하는 농도 (IC사로 결정하였다. 그 결과 S9 혼합물 존재 시 최고농도는 800 μg/ mL으로, S9 혼합물 부재 시 최고농도는 600 μg/ml으로 결정되었다. 시험의 적용용량은 S9 혼합물 존재 시 800 μg/plate를 최고용량으로 하여 공비 2로 5단계를 설정하여 , 50 μg/plate~800 μg/plate로 실험하였고, S9 혼합물 부재 시 600 pig/plate를 최고용량으로 하여 공비 2로 5 단계를 설정하여, 37.
- 제작된 표본 도말면의 세포밀도를 현미경으로 관찰하였고, 골수내 미성숙 적혈구에 대한 다염성적혈구의 비와 소핵을 지니는 다염성적혈구의 출현 빈도를 용매대조군에 대해 통계처리 하였다. 통계처리 결과, 후박열수추출물은 유의성 있는 소핵 유발 능은 나타내지 않았다. Salmonella typhimuriume: 이용한 복귀돌연변이시험, 포유류 배양세포를 이용한 염색체 이상시험 그리고 소핵시험을 통한 유전독성 실험 결과, 후박 열수 추출물은 복귀돌연변이와 염색체 이상을 일으키지 않고 또한, 소핵형성을 유발하지 않으므로 유전독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
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