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문제 정의
- 이는 인체에 무해하고 효능 성분을 보다 쉽게 인체에 적용이 가능하다는 장점을 가지고 있어 소비자들에게 기능성 화장품에 대한 관심은 나날이 증가하는 추세이다[10]. 따라서 본 연구에서는 후박 추출물에 대한 것으로, 지방세포 내의 지방 축적을 감소시켜 세포의 크기를 줄이거나 지방세포에 분화에 관여하는 인자를 통해 지방 형성을 감소시키는 효능에 대하여 확인하고, 이를 통해 보다 안전하고 적은 비용으로 소비자에게 쉽게 접근이 가능한 천연물을 찾고자 하였다.
제안 방법
- 3T3-L1 cell을 회수하여 1 % Triton X-100 이 함유된 PBS를 넣어 용해시켜 준비하고 TG의 농도는 GPO-tinder를 이용한 serum triglyceride detection kit를 이용하여 측정 하였다. 우선 TG reagent에 10 mL의 증류수를 넣고, free glycerol reagent에 40 mL의 증류수를 각각 넣어주어 reconstitute reagents를 만든 후 0.
- 3T3-L1의 지방세포로의 분화는 100 µM 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, 250 nM dexamethasone, 3.3 µM D-biotin, 1 % bovine serum albumin (BSA), 10 µg/mL insulin solution from bovine pancreas (MDI)와 10 % FBS를 함유한 배지로 유도하였으며, 10 % FBS와 10 µg/mL insulin을 함유한 DMEM 배지로 교체하여 주면서 분화 정도를 관찰하였다.
- HaCaT세포와 3T3-L1 세포에 후박 추출물을 농도별로 처리한 후, 농도 증가에 따른 세포 생존율에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 HaCaT 세포의 경우에는 최고 시료 처리 농도인 200 µg/mL에서 약 75 %의 세포 생존율은 보였으며, 3T3-L1 세포의 경우에는 최고 시료 처리 농도인 200 µg/mL에서도 92.
- MTT 정량은 Mosmann[11]의 방법을 변형하여 실시하였다. 실험에 사용된 세포로는 HaCaT 세포와 지방 전구세포인 3T3-L1을 이용하였다.
- 5 mg/mL standard), 10 µL sample을 넣고 37 ℃에서 5 min 동안 반응시키고 540 nm에서 최종 흡광(FA)을 측정하였다. TG의 양을 glycerol 정량 곡선을 이용하여 계산하였다.
- 실험에 사용한 primer는 lipoprotein lipase (LPL), PPAR-α, PPAR-γ, leptin으로 Genotech (Korea)에서 구입하였다. Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit (Roche, Germany)와 High Fidelity PCR Master (Roche, Germany)를 사용하여 유전자 발현 정도를 확인하였으며, TG accumulation rate를 측정하기 위하여 UV/vis-spectrophotometer(SHANGHAI instruments Inc., UNICO, China)와 EILSA reader (PerkinElmer, VICTOR3, USA)를 사용하였다.
- RNA의 추출은 acid guanidinium-phenolchloroform (AGPC) 법에 의한 total RNA 추출시약(RNAiso Plus, TaKaRa, Japan)을 사용하였다. cDNA 합성은 Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, High Fidelity PCR Master와 제작된 primer를 사용하여 PCR을 수행하였다. cDNA 합성은 1 µg의 total RNA로 50 ℃에서 1 h, 85 ℃에서 5 min 동안 가열시킴으로써 반응을 중지시켰다.
- 상층액을 회수하여 1 µm 크기의 여과지를 이용하여 감압 여과 하였다.
- 건조된 각 well에 Oil-red-O working solution을 1 mL씩 넣고 1 h 동안 염색한 후, 증류수로 4회 반복하여 세척하였다. 세척한 well이 완전히 마른 후에 100 % isopropanol을 2 mL씩 넣어 염색된 시약을 용출시켜 500 nm에서 흡광을 측정하여 지방 축적 정도를 평가하였다.
- 지방 세포로 분화가 유도된 3T3-L1 세포에서 지방 분화 촉진에 관여하는 요인으로 PPAR-γ와 HSL, C/EBPα 등을 들 수 있다. 세포 내 TG contents의 감소와 지방 축적 억제 효능 평가 결과로 후박 열수 추출물은 세포 내지방 생성을 억제하거나, 지방 세포로의 분화를 억제할 것으로 사료되어 관련된 단백질 발현과의 연관성을 확인 하였다. 후박 열수 추출물을 농도별로 처리하여 PPARγ와 HSL의 단백질 발현을 확인한 결과, 후박 추출물의 농도가 증가함에 따라 HSL의 단백질 발현이 control과 대비하여 8배 증가하였으며, PPAR-γ의 경우에는, 후박 열수 추출물을 100 µg/mL 처리한 세포에서 PPAR-γ 단백질의 발현이 89 % 감소되는 결과를 나타냈다(Figure 4).
- PCR 증폭은 94 ℃에서 50 s 동안 denaturation 시키고 55 ℃, 50 s 동안 annealing, 72 ℃에서 50 s 동안 extension시켰다. 이를 30회 반복 하였으며 final extension은 72 ℃, 5 min 동안 수행하였으며 증폭된 결과물은 2 % agarose gel에서 전기영동 하여 유전자 발현을 chemiluminescent detection system (ChemiDoc XRS system, Bio-Rad Laboratories, USA)로 확인하였다. Leptin, PPAR-α, lipoprotein lipase (LPL)의 oligonucleotide 서열은 leptin: sense;5'-GGAATTCAGAAAATGTGCTGGAG-3', antisense;5'-GGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAAC-3', PPARα: sense; 5'-CCTGTCTGTCGGGATGTCACACAATGC-3', antisense; 5'-GCAACTTCTCAATGTAGCCTATGTTT-3', LPL: sense; 5'-GGCCGCAGCAGACGCAGGAAGAG ATTT-3', antisense; 5'-AAGAAGGAGTAGGT TTT ATTTGTGGAA-3' GAPDH: sense; 5'-AAATTCA ACGGCACAGTCAA-3', antisense; 5'-GTCTTCTGG GTGG CAGTGAT-3'이다.
- 이를 5 % skim milk가 함유된 Tris 완충용액에서 PPAR-γ(sc-7273), HSL (sc-74489), β-actin (sc-1615) 항체와 각각 반응시킨 후 2차 HRP-항체를 가하고 WEST-ZOL Western blotting detection system (chemiluminescence reagernt, Intron. Korea)을 사용하여 Kodak X-ray film에 감광시킨 후 현상하였다.
- 지방 전구 세포에 MDI를 처리하여 분화를 유도하여 지방세포로 전환된 3T3-L1에 후박 열수 추출물을 농도 별로 처리한 후 세포 내에 형성된 lipid droplet의 양을 간접적으로 측정하였다. Oil-Red-O 시약은 fat-soluble dye로, 지방 세포로 분화된 3T3-L1 세포에 세포의 생존율에 거의 영향을 미치지 않는 농도인 50, 100 µg/mL을 처리 하여 세포 내에 형성된 lipids와 neutral TG를 Oil-Red-O 시약으로 염색하고 isopropanol로 회수한 후 흡광으로 확인한 결과, 후박 추출물 50 µg/mL에서 76 %, 100 µg/mL 에서 78 %의 세포 내 지방 축적 억제 효능을 나타내었다 (Figure 2).
- 후박 열수 추출물이 지방세포 분화에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 실험 결과 지방 세포로의 분화에 관여하는 유전자인 PPAR-α와 leptin, LPL의 발현이 분화 전의 지방 전구세포에 대비하여 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, 후박 열수 추출물을 100 µg/mL로 처리한 세포에서는 분화 전의 지방 전구세포에서의 발현과 유사한 수준으로 나타나, 후박 열수 추출물을 처리하면 지방세포로의 분화와 관여된 유전자의 발현이 억제되어 지방 생성이 감소하는 것으로 사료된다(Figure 5).
대상 데이터
- Hormone sensitive lipase (HSL), peroxisome proliferator-ctivated receptor-γ (PPAR-γ), β-actin에 대한 항체 및 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용하였다.
- RNA의 추출은 acid guanidinium-phenolchloroform (AGPC) 법에 의한 total RNA 추출시약(RNAiso Plus, TaKaRa, Japan)을 사용하였다. cDNA 합성은 Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, High Fidelity PCR Master와 제작된 primer를 사용하여 PCR을 수행하였다.
- 세포 배양을 위해 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS), antibiotics (penicillin 100 units/mL, streptomycin 100 units/mL)은 HyClone (Thermo, USA)제품을 구입하여 실험에 사용하였다.
- 세포 실험에 사용한 시약은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)와 Oil red-O, serum triglyceride detection kit, 3-isobutyl-1-methylxanthine, dexamethasone crystalline, insulin from bovine pancreas, DL-isoproterenol hydrochloride (Sigma, USA)를 사용하였고, 실험에 사용된 세포주는 3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast cell line)을 미국 세포주은행(American Type Culture Collection: ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 세포 배양을 위해 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS), antibiotics (penicillin 100 units/mL, streptomycin 100 units/mL)은 HyClone (Thermo, USA)제품을 구입하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 세포는 Human keratinocyte (HaCaT)과 지방 전구세포인 3T3-L1을 사용하였으며 HaCaT 세포의 경우에는 10 % FBS, penicillin (100 units/mL), stryptomycin (100 units/mL)이 첨가된 DMEM 배지로 5 % CO2, 37 ℃에서 배양하였으며 3T3-L1 세포는 10 % bovine calf serum, penicillin (100 units/mL), streptomycin (100 units/mL)이 첨가된 DMEM으로 5 % CO2, 37 ℃에서 배양하였다. 3T3-L1의 지방세포로의 분화는 100 µM 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, 250 nM dexamethasone, 3.
- MTT 정량은 Mosmann[11]의 방법을 변형하여 실시하였다. 실험에 사용된 세포로는 HaCaT 세포와 지방 전구세포인 3T3-L1을 이용하였다. HaCaT 세포와 3T3-L1을 1 × 104 cells/well의 농도로 준비한 96-well plates에 후박 추출물을 농도별로 투여하여 CO2배양기에서 24 h 동안 배양하였다.
- 실험에 사용한 primer는 lipoprotein lipase (LPL), PPAR-α, PPAR-γ, leptin으로 Genotech (Korea)에서 구입하였다.
이론/모형
- 세포 내에 형성되는 지방의 축적 정도를 평가하는 방법으로 Oil-red-O 염색을 수행하였다. 3T3-L1을 1 × 105 cells/well의 농도로 준비하여 농도 별로 후박 추출물을 처리하고 24 h 동안 배양하였다.
성능/효과
- HaCaT 세포와 3T3-L1 세포에 10 ~ 100µg/mL의 시료를 처리하였을 때, 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다(Figure 1).
- 그 결과 HaCaT 세포의 경우에는 최고 시료 처리 농도인 200 µg/mL에서 약 75 %의 세포 생존율은 보였으며, 3T3-L1 세포의 경우에는 최고 시료 처리 농도인 200 µg/mL에서도 92.2 %의 세포 생존율을 나타내었다.
- 분해된 glycerol 을 glycerol kinase (GK)와 glycerol phosphate oxidase (GPO), peroxidase 등의 효소 반응에 의해 최종적으로 생성된 quinoneimine dye를 흡광으로 확인하는 방법으로 후박 열수 추출물을 농도별로 처리하여 세포 내에 형성된 TG contents를 측정한 결과, 후박 열수 추출물의 농도가 증가함에 따라 세포 내의 TG contents 수준이 감소하는 양상을 보였으며, 최고 시료 처리 농도인 100µg/mL에서 control 대비 약 35 %의 TG contents 감소를 나타내었다(Figure 3).
- 실험 결과 지방 세포로의 분화에 관여하는 유전자인 PPAR-α와 leptin, LPL의 발현이 분화 전의 지방 전구세포에 대비하여 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, 후박 열수 추출물을 100 µg/mL로 처리한 세포에서는 분화 전의 지방 전구세포에서의 발현과 유사한 수준으로 나타나, 후박 열수 추출물을 처리하면 지방세포로의 분화와 관여된 유전자의 발현이 억제되어 지방 생성이 감소하는 것으로 사료된다(Figure 5).
- 이와 같은 결과에서 후박 추출물의 3T3-L1 세포에 대한 효능은 지방 세포로의 분화에 관여된 유전자의 발현을 억제하여 분화를 억제하며, 분화가 일어나 세포 내에 생성되는 지방을 HSL 발현의 증가를 가져와 지방의 분해를 촉진하는 효능을 나타내는 것으로 판단된다. 따라서 후박 추출물의 지방 생성 억제 효능을 이용하여 새로운 천연 소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 후박 열수 추출물을 농도별로 처리하여 PPARγ와 HSL의 단백질 발현을 확인한 결과, 후박 추출물의 농도가 증가함에 따라 HSL의 단백질 발현이 control과 대비하여 8배 증가하였으며, PPAR-γ의 경우에는, 후박 열수 추출물을 100 µg/mL 처리한 세포에서 PPAR-γ 단백질의 발현이 89 % 감소되는 결과를 나타냈다(Figure 4).
후속연구
- 이와 같은 결과에서 후박 추출물의 3T3-L1 세포에 대한 효능은 지방 세포로의 분화에 관여된 유전자의 발현을 억제하여 분화를 억제하며, 분화가 일어나 세포 내에 생성되는 지방을 HSL 발현의 증가를 가져와 지방의 분해를 촉진하는 효능을 나타내는 것으로 판단된다. 따라서 후박 추출물의 지방 생성 억제 효능을 이용하여 새로운 천연 소재로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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