붉은사슴과 엘크에서 SRY와 ZFX-ZFY 유전자의 Duplex PCR기법을 이용한 성 판별 A Molecular Sex Identification Using Duplex PCR Method for SRY and ZFX-ZFY Genes in Red Deer and Elk원문보기
두 가지 primer 쌍을 동시에 이용한 duplexPCR 기법으로 붉은사슴과 엘크의 유전자 성 판별에 대한 이용가능성을 확인하기 위해 본 연구를 수행하였다. 근본적으로 포유동물의 성 분화는 Y-염색체 상에 암호화되어 있으며 웅성발생에 지배적인 역할을 수행하는 SRY 유전자의 존재 여부에 따라 결정되게 된다. X-, Y- 염색체에 상동인 유전자들 중 하나인 ZFX-ZFY 유전자는 X-, Y- 염색체 상에서 각각 발견된다. 유전자 성 판별에 앞서 붉은사슴의 ZFX-ZFY 유전자의 인트론 9를 포함하는 절편에 대한 염기서열의 특성을 확인하였다. 인트론 9의 길이는 ZFX와 ZFY에서 각각 529, 665-bp로 확인되었다. ZFY 인트론 9에서 전위인자의 일종인 bovine SINE element와 유사한 서열이 관찰되었다. SRY와 ZFX-ZFY 유전자들을 동시에 증폭하는 duplex PCR을 통해 유전자 성 판별을 수행하였고, 암수가 서로 구분되는 증폭 양상을 나타내었다: 암컷에서는 ZFX에서 증폭된 공통의 증폭 산물 하나만이 관찰되었고 수컷은 세 개의 밴드가 관찰되었다(ZFX에 해당하는 공통의 밴드와 ZFY와 SRY에서 증폭된 두 개의 수컷 특이 밴드). 두 가지 유전자에 대한 독립적인 PCR 시험에서 얻은 결과는 duplex PCR에 의해 얻은 결과와 동일한 양상을 나타내었다. 또한 유전자 성 판별의 결과들은 각각의 개체에 대한 표현형적 성판별 자료와 정확히 일치하였다. Y 염색체 특이적인 SRY와 X-, Y- 상동이면서 성적 이형성을 나타내는 ZFX-ZFY 유전자들에 대한 duplex PCR 방법은 붉은사슴과 엘크의 성 판별에 있어 여타 다른 대조시험을 요구하지 않으면서 없이 신속하고 정확한 정보를 제공하는 분석법이 될 것으로 기대된다.
두 가지 primer 쌍을 동시에 이용한 duplex PCR 기법으로 붉은사슴과 엘크의 유전자 성 판별에 대한 이용가능성을 확인하기 위해 본 연구를 수행하였다. 근본적으로 포유동물의 성 분화는 Y-염색체 상에 암호화되어 있으며 웅성발생에 지배적인 역할을 수행하는 SRY 유전자의 존재 여부에 따라 결정되게 된다. X-, Y- 염색체에 상동인 유전자들 중 하나인 ZFX-ZFY 유전자는 X-, Y- 염색체 상에서 각각 발견된다. 유전자 성 판별에 앞서 붉은사슴의 ZFX-ZFY 유전자의 인트론 9를 포함하는 절편에 대한 염기서열의 특성을 확인하였다. 인트론 9의 길이는 ZFX와 ZFY에서 각각 529, 665-bp로 확인되었다. ZFY 인트론 9에서 전위인자의 일종인 bovine SINE element와 유사한 서열이 관찰되었다. SRY와 ZFX-ZFY 유전자들을 동시에 증폭하는 duplex PCR을 통해 유전자 성 판별을 수행하였고, 암수가 서로 구분되는 증폭 양상을 나타내었다: 암컷에서는 ZFX에서 증폭된 공통의 증폭 산물 하나만이 관찰되었고 수컷은 세 개의 밴드가 관찰되었다(ZFX에 해당하는 공통의 밴드와 ZFY와 SRY에서 증폭된 두 개의 수컷 특이 밴드). 두 가지 유전자에 대한 독립적인 PCR 시험에서 얻은 결과는 duplex PCR에 의해 얻은 결과와 동일한 양상을 나타내었다. 또한 유전자 성 판별의 결과들은 각각의 개체에 대한 표현형적 성판별 자료와 정확히 일치하였다. Y 염색체 특이적인 SRY와 X-, Y- 상동이면서 성적 이형성을 나타내는 ZFX-ZFY 유전자들에 대한 duplex PCR 방법은 붉은사슴과 엘크의 성 판별에 있어 여타 다른 대조시험을 요구하지 않으면서 없이 신속하고 정확한 정보를 제공하는 분석법이 될 것으로 기대된다.
This study was focused on discriminating the molecular sexes of red deer and elk by duplex polymerase chain reaction(PCR) using two primer sets. Sex differentiation of mammals is primarily dependent on the presence or absence of sex determining region Y(SRY) gene encoded on Y chromosome which plays ...
This study was focused on discriminating the molecular sexes of red deer and elk by duplex polymerase chain reaction(PCR) using two primer sets. Sex differentiation of mammals is primarily dependent on the presence or absence of sex determining region Y(SRY) gene encoded on Y chromosome which plays a key role for male development. Zinc finger X-Y(ZFX-ZFY) gene, one of X-Y homology gene group was found on X- and Y- chromosomes, respectively. At first, the nucleotide sequences were characterized for the intron 9 flanking region of ZFX-ZFY genes. The intron 9 of ZFX and ZFY is 529-bp and 665-bp in length, respectively. A transposable element sequence similar to bovine SINE element Bov-tA was detected only in ZFY gene of Cervidae. Sexing analysis was conducted by duplex PCR assay for amplification of SRY and ZFX-ZFY genes. Two differentially amplified patterns were found: one for females has a common band amplified only from ZFX as a template, and another for males had three bands(a common ZFX and two male-specific ZFY and SRY). On the separate tests using each gene, the results was identical to those from duplex PCR assay. Moreover, the results from PCR assays provide also identical information to phenotypic investigation of individuals of red deer, elk as well as their hybridized progenies collected from two isolated farms. These results suggest that it may be a rapid and precise method for determining the sexes by duplex PCR amplification using Y-chromosome specific SRY and X- and Y- homologous ZFX-ZFY genes showing sexual dimorphism in red deer and elk without any other controls.
This study was focused on discriminating the molecular sexes of red deer and elk by duplex polymerase chain reaction(PCR) using two primer sets. Sex differentiation of mammals is primarily dependent on the presence or absence of sex determining region Y(SRY) gene encoded on Y chromosome which plays a key role for male development. Zinc finger X-Y(ZFX-ZFY) gene, one of X-Y homology gene group was found on X- and Y- chromosomes, respectively. At first, the nucleotide sequences were characterized for the intron 9 flanking region of ZFX-ZFY genes. The intron 9 of ZFX and ZFY is 529-bp and 665-bp in length, respectively. A transposable element sequence similar to bovine SINE element Bov-tA was detected only in ZFY gene of Cervidae. Sexing analysis was conducted by duplex PCR assay for amplification of SRY and ZFX-ZFY genes. Two differentially amplified patterns were found: one for females has a common band amplified only from ZFX as a template, and another for males had three bands(a common ZFX and two male-specific ZFY and SRY). On the separate tests using each gene, the results was identical to those from duplex PCR assay. Moreover, the results from PCR assays provide also identical information to phenotypic investigation of individuals of red deer, elk as well as their hybridized progenies collected from two isolated farms. These results suggest that it may be a rapid and precise method for determining the sexes by duplex PCR amplification using Y-chromosome specific SRY and X- and Y- homologous ZFX-ZFY genes showing sexual dimorphism in red deer and elk without any other controls.
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문제 정의
두 가지 primer 쌍을 동시에 이용한 duplex PCR 기법으로 붉은사슴과 엘크의 유전자 성 판별에 대한 이용가능성을 확인하기 위해 본연구를 수행하였다. 근본적으로 포유동물의 성 분화는 Y-염색체 상에 암호화되어 있으며 웅성 발생에 지배적인 역할을 수행하는 SRY 유전자의 존재 여부에 따라 결정되게 된다.
본 연구는 우리나라에서 사육 중인 사슴류 중에서 경제성이 높은 축종인 붉은사슴과 엘크에 대해 수컷 특이 유전자인 SRY와 X-, Y-염색체 상동인 ZFX-ZFY 유전자들을 동시에 분석할 수 있는 duplex PCR 기법을 이용하여 신속하면서도 정확한 분자 성판별 기법으로써의 이용을 검토해보고자 하였다.
유전자 전사에서 중요한 조절 단백질 중 하나인 ZF 유전자들 중 X, Y 염색체에 상동으로 알려진 ZFX-ZFY 는 전사조절의 분자생물학적 기능뿐만 아니라, 인트론의 염기서열 상에서 비대칭적 전위인자의 진화에 따른 길이의 차이를 나타내는 것으로도 알려져 있다. 본 연구에서는 이들 SRy와 ZFX-ZFY 유전자에 대한 duplex PCR 방법을 통해 붉은사슴과 엘크, 두 종간 교잡 Fi 에 대한유전자 성판별에 대한 이용가능성을 확인하고자 하였다.
붉은사슴과 엘크의 분자 성 판별을 위하여본 연구에서는 SRY와 ZFX-ZFY 인트론 9에 대한 duplex PCR 분석법을 고안하였다. Fig.
가설 설정
1) nucleotide sequences are displayed from 5' to 3';.
제안 방법
성 판별을 위한 PCR 증폭용 primer들은 기존에 보고된 서열정보들을 이용하여 직접 고안하였다(Table 1). Duplex PCR에서는 상기된 PCR 반응액 조성 중에서 길이가 짧은 SRY primer는 각각 100mM, ZFX-ZFY primer는 각각 200 mM, Taq DNA polymerase는 2 units로 변경하여 반응에 이용하였다. 각각의 PCR 반응을 위한 annealing 온도는 gradient PCR 분석을 통해 최적 온도를 결정하였고, PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 증폭하였다.
Duplex PCR에서는 상기된 PCR 반응액 조성 중에서 길이가 짧은 SRY primer는 각각 100mM, ZFX-ZFY primer는 각각 200 mM, Taq DNA polymerase는 2 units로 변경하여 반응에 이용하였다. 각각의 PCR 반응을 위한 annealing 온도는 gradient PCR 분석을 통해 최적 온도를 결정하였고, PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 증폭하였다. 유전자 증폭은 94℃ 2분 열변성 후 94 ℃-45초, annealing 온도-1분, 720T 분으로 이어지는 증폭반응을 30회 반복한 후 72℃T0분간 최종 신장하고, 이후 4℃에서 보관하였다.
DQ415948, DQ415950, EF104262-63). 또한 ZFX-ZFY 인트론 9 서열상에서 repetitive DNA 의 존재 여부는 CENSOR web program(http:〃www.girinst.org/censor/) 을 이용하여 확인하였다.
전혈과 근육, 피부에서 DNA 추출은 sucrose-proteinase K lysis buffer(Birren 등, 1997)를 이용하였으며, 추출 과정은 일부 변형하여 수행하였다. 모근 DNA 추출은 Chelex 100 resin(Bio-Rad, USA)을 이용하여 1000에서 10분간 가열한 후 DNA 현탁액을 회수하였다. DNA 용출용액은 phenol 추출법과 ethanol 침전으로 다시 회수하고 TE buffer 에 용해하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
Poloumienko(2004)는 ZFX-ZFY 유전자 인트론 7, 8, 9 상에서 전위인자의 유무에 따른 성별 이형성을 인간, 소, 말, 돼지에서 보고하였고, 조 등(2005)은 ZFX-ZFYe 인트론 7의 전위인자 삽입양상에 따라 돼지의 유전 자성판별이 가능함을 보고하였다. 본 연구 결정한 붉은사슴과 엘크의 ZFX, ZFY의 인트론 9 서열상에서 반복서열의 존재를 확인하기 위해 CENSOR program으로 탐색하였다. 그 결과 소 (cattle) 유전체에서 많은 사본이 존재하는 것으로 보고된 RNA 매개성 역전위인자(retroelement) 의 일종인 short interspersed nuclear element (SINE) Bov-tA와 매우 유사한 서열이 붉은사슴과 엘크의 ZFY 인트론에서 관찰되었고, ZFX] 서는 발견되지 않았다.
사슴과 엘크, 교잡 Fi 의 DNA 시료를 대상으로 ZFX-ZFY 유전자의 인트론 9를 포함한 영역을 PCR로 증폭하여 성 판별을 수행하였다. 전기영동 겔 상에서 암컷의 경우 단일밴드로 관찰되었고, 수컷에서는 ZFX와 ZFY에서 유래된 두 개의 PCR 산물이 heteroduplex 형태로 관찰되었다(Fig.
수컷 특이적인 SRY 유전자 서열을 결정하기 위하여 PCR 증폭산물에 대한 cloning과 DNA sequencing을 수행하였다. 염기서열의 길이는 primer 제작에 이용한 소와 꽃사슴의 SRY 유전자 서열 (GenBank accession no.
X-, Y- 염색체에 상동인 유전자들 중 하나인 ZFX-ZFY 유전자는 X-, Y- 염색체 상에서 각각 발견된다. 유전자 성 판별에 앞서 붉은사슴의 ZFX-ZFY 유전자의 인트론 9를 포함하는 절편에 대한 염기서열의 특성을 확인하였다. 인트론 9의 길이는 ZFX와 ZFY에서 각각 529, 665-bp로 확인되었다.
유전자 증폭산물에 대한 염기서열 결정을 위하여 DNA sequencing을 수행하였다. 정제된 SRY와 ZFX, ZFY에 대한 PCR 산물들은 TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen, USA) 의 pCR2.
총 64 두를 대상으로 전혈 또는 근육, 피부에서 DNA를 추출하여 유전자 성판별에 이용하였다. 전혈과 근육, 피부에서 DNA 추출은 sucrose-proteinase K lysis buffer(Birren 등, 1997)를 이용하였으며, 추출 과정은 일부 변형하여 수행하였다. 모근 DNA 추출은 Chelex 100 resin(Bio-Rad, USA)을 이용하여 1000에서 10분간 가열한 후 DNA 현탁액을 회수하였다.
정제된 SRY와 ZFX, ZFY에 대한 PCR 산물들은 TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen, USA) 의 pCR2.0 vector 에 연결한 후 대장균 OneShot Top10F' competent 세포에 형질 전환하였고, 재조합 plasmid는 Wizard Plus SV Minipreps(Promega, USA)로 회수하였다. 주출한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 MegaBase 500 (Amersham Pamacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다.
조직으로부터 분리한 DNA를 주형으로, 10 X PCR 반응 완충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM primer, 1.5 units Taq DNA polymerase(TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈이 온수를 첨가하여 25 μl 용량으로 PCR 반응을 수행하였다. 성 판별을 위한 PCR 증폭용 primer들은 기존에 보고된 서열정보들을 이용하여 직접 고안하였다(Table 1).
0 vector 에 연결한 후 대장균 OneShot Top10F' competent 세포에 형질 전환하였고, 재조합 plasmid는 Wizard Plus SV Minipreps(Promega, USA)로 회수하였다. 주출한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 MegaBase 500 (Amersham Pamacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들을 기준으로 액손-인트론 경계를 확인하였고, 염기서열간 비교를 위한 다중정렬은 CLUSTAL W program(Thompson 등, 1994)으로 확인하였다.
유전자 증폭은 94℃ 2분 열변성 후 94 ℃-45초, annealing 온도-1분, 720T 분으로 이어지는 증폭반응을 30회 반복한 후 72℃T0분간 최종 신장하고, 이후 4℃에서 보관하였다. 증폭 산물은 ethidium bromide 가 함유된 2.0% agarose 겔 상에서 전기영동한 후 UV 하에서 확인하고 사진촬영 하였다.
대상 데이터
경상남도와 제주도의 농장에서 붉은사슴과 엘크, 이들 간의 교잡 F1 을 각각 암컷 22 두, 수컷 30 두, 교잡 F1 12 두를 제공받아 시험하였다(Table 2). 교잡 F1 의 경우 암수에 대한 기록 없이 제공받았으며, PCR 시험 후 표현형 자료와 차후 대조하였다.
결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들을 기준으로 액손-인트론 경계를 확인하였고, 염기서열간 비교를 위한 다중정렬은 CLUSTAL W program(Thompson 등, 1994)으로 확인하였다. 본 연구에서 새롭게 결정된 붉은사슴과 엘크의 ZFX-ZFY 서열들은 GenBank database에 등록하였다(GenBank accession no. DQ415948, DQ415950, EF104262-63). 또한 ZFX-ZFY 인트론 9 서열상에서 repetitive DNA 의 존재 여부는 CENSOR web program(http:〃www.
교잡 F1 의 경우 암수에 대한 기록 없이 제공받았으며, PCR 시험 후 표현형 자료와 차후 대조하였다. 총 64 두를 대상으로 전혈 또는 근육, 피부에서 DNA를 추출하여 유전자 성판별에 이용하였다. 전혈과 근육, 피부에서 DNA 추출은 sucrose-proteinase K lysis buffer(Birren 등, 1997)를 이용하였으며, 추출 과정은 일부 변형하여 수행하였다.
데이터처리
주출한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 MegaBase 500 (Amersham Pamacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들을 기준으로 액손-인트론 경계를 확인하였고, 염기서열간 비교를 위한 다중정렬은 CLUSTAL W program(Thompson 등, 1994)으로 확인하였다. 본 연구에서 새롭게 결정된 붉은사슴과 엘크의 ZFX-ZFY 서열들은 GenBank database에 등록하였다(GenBank accession no.
성능/효과
1b). DNA 염기서열을 분석한 결과 증폭한 PCR 산물의 길이는 사슴에서 ZFX 606-bp, ZFY 742-bp, 엘크에서 ZFX 607-bp, ZFY 742-bp 로 확인되었다. Poloumienko(2004)는 ZFX-ZFY 유전자 인트론 7, 8, 9 상에서 전위인자의 유무에 따른 성별 이형성을 인간, 소, 말, 돼지에서 보고하였고, 조 등(2005)은 ZFX-ZFYe 인트론 7의 전위인자 삽입양상에 따라 돼지의 유전 자성판별이 가능함을 보고하였다.
3). SRY 증폭 결과만으로는 lane 7 시료가 암컷으로 판정되나, ZFX-ZFYe- duplex PCR의 결과를 종합하면, PCR 반응에 이용한 주형 DNA에 문제가 있어 해당 시료에 대한 성 판별이 불가능한 것으로 판단된다. 이상의 결과는 SRY 유전자에 대한 PCR 성 판별에서 나타날 수 있는 오류이며, 주형 DNA의 PCR 증폭 활성을 증명하기 위한 별도의 positive control test가 요구되는 이유가 된다.
본 연구 결정한 붉은사슴과 엘크의 ZFX, ZFY의 인트론 9 서열상에서 반복서열의 존재를 확인하기 위해 CENSOR program으로 탐색하였다. 그 결과 소 (cattle) 유전체에서 많은 사본이 존재하는 것으로 보고된 RNA 매개성 역전위인자(retroelement) 의 일종인 short interspersed nuclear element (SINE) Bov-tA와 매우 유사한 서열이 붉은사슴과 엘크의 ZFY 인트론에서 관찰되었고, ZFX] 서는 발견되지 않았다. Fig.
SRY와 ZFX-ZFY 유전자들을 동시에 증폭하는 duplex PCR을 통해 유전자 성 판별을 수행하였고, 암수가 서로 구분되는 증폭 양상을 나타내었다: 암컷에서는 ZFX에서 증폭된 공통의 증폭 산물 하나만이 관찰되었고 수컷은 세 개의 밴드가 관찰되었다(ZFX에 해당하는 공통의 밴드와 ZFY와 SRY 에서 증폭된 두 개의 수컷 특이 밴드). 두 가지 유전자에 대한 독립적인 PCR 시험에서 얻은 결과는 duplex PCR에 의해 얻은 결과와 동일한 양상을 나타내었다. 또한 유전자 성 판별의 결과들은 각각의 개체에 대한 표현 형적 성판별 자료와 정확히 일치하였다.
AB046700, AF148462) 들과같은 길이를 나타내었다(126-bp). 사슴 SRY 유전자의 증폭 결과는 수컷에서만 특이적인 단일밴드가 관찰되었고, 암컷에서는 PCR 산물이 출현하지 않았다 (Fig. 1a). 암수에 대한 정보가 기록되지 않은 시료에서도 PCR 밴드가 관찰된 경우 수컷으로 판정하였다.
후속연구
또한 유전자 성 판별의 결과들은 각각의 개체에 대한 표현 형적 성판별 자료와 정확히 일치하였다. Y 염색체 특이적인 SRY와 X-, Y- 상동이면서 성적 이형성을 나타내는 ZFX-ZFY 유전자들에 대한 duplex PCR 방법은 붉은사슴과 엘크의 성 판별에 있어 여타 다른 대조시험을 요구하지 않으면서 없이 신속하고 정확한 정보를 제공하는 분석법이 될 것으로 기대된다.
결론적으로, 본 연구에서 고안한 수컷-특이 (male-specific) 유전자와 성별-이형 유전자를 동시에 증폭하는 duplex PCR 분석기법은 암컷과 수컷에서 서로 명확한 차이를 나타내는 밴드 양상을 얻을 수 있고, ZFX 유전자 자체가 positive contr이이 되기 때문에 DNA 분리과정에서 발생할 수 있는 주형 DNA의 부재와 같은 오류를 제외하면 DNA 분자에 대한 성 판별에 있어 매우 신속하고 정확한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 비록 본 연구에서 이용한 시료들이 혈액이나 모근만을 대상으로 하였으나, 발생 중인 배아의 양수를 천자하거나, 기내 발생 중인 할구 등을 대상으로 분석이 수행된다면 붉은사슴이나 엘크의 번식에서 암수를 조기 판명할 수 있는 유용한 분석 기법으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
기대된다. 비록 본 연구에서 이용한 시료들이 혈액이나 모근만을 대상으로 하였으나, 발생 중인 배아의 양수를 천자하거나, 기내 발생 중인 할구 등을 대상으로 분석이 수행된다면 붉은사슴이나 엘크의 번식에서 암수를 조기 판명할 수 있는 유용한 분석 기법으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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