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문제 정의
- 본 연구에서는 Y 염색체 특이적인 SRY 유전자와 X, Y 염색체 상동유전자인 ZF 유전자의 이형성을 바탕으로 돼지의 성 판별을 시도하였다. SRY의 경우 수컷에서만 PCR 산물이 출현하고 ZF는 암수에 따라 서로 다른 증폭 양상을 나타내게 된다.
- 구체적으로 마련되어 있지 않다. 본 연구에서는 여러 품종의 돼지의 다양한 조직에서부터 丫 염색체 특이적인 유전자인 SRY 유전자와 X, Y 염색체에서 공통으로 암호화되어 있으면서 유전자 길이의 이형성(dimorphism)이 보고된 ZFX-ZFY 유전자에 대한 PCR 분석을 통해 정확하면서도 신속한 분자적 성 판별 기법을 개발하고자 하였다.
- 웅성발현에 핵심적인 SRP 유전자의 증폭에서 암수에 대한 정보를 알고 있는 개체들과 함께 암수를 모르는 시료들에 대한 시험을 수행하였다. Fig.
제안 방법
- 혈액, 피부, 근육에서 추출한 10-100ng, 정자시료에서는 l~2ng, 1 개의 모근으로부터 추출한 DNA 전체를 PCR 주형으로 이용하였다. PCR 증폭은 PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 Han 등(2004)의 방법을 변형하여 수행하였다. 반응 시 primer의 annealing 온도는 각각의 primer의 7#에 근거하여 설정하였다.
- 또한 ZF 유전자에 대한 분석을 위해서 X, Y 염색체간 길이 차이를 나타내는 intron 7을 포함한 단편을 얻기 위해 기존에 보고된 인간, 소의 서열 중 exon 7과 exon 8의 서열을 비교하여 상동성이 높은 부분에서 primer를 제작하였다. Primer 제작은 Primer 3 web program을 이용하였으며, 증폭과정에서 mis- priming을 최소화하기 위해 Rodent and Simple library option을 이용하였다. 본 연구에서 이용한 primer의 염기서열은 Table 1에 제시하였다.
- 주줄한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 Megabase 500(Amersham Parmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들을 근거로 exon-intron 경계를 확인하였고, CLUSTAL W(Thompson 등, 1994) program으로 다중염기정렬을 수행하여 염기변이를 확인하였다
- 수행하였다. 또한 Duroc, Landrace, Large White 품종 각 10 두의 수컷에서 채취한 정액에서도 DNA를 추출하여 분석에 이용하였다. 조직에서 DNA 추출은 sucrose-proteinase K 방법 (Birren 등, 1997)을 일부 변형하여 수행하였으며, 1 개의 모근과 소량의 정액에서 DNA 추출은 Chelex 100 resin(Bio-Rad, USA)을 이용하였다.
- Y 염색체 상에 특이적으로 암호화된 SRY 유전자의 경우 기존에 보고된 돼지 SRY 유전자 서열(U49860)로부터 primer를 제작하였다. 또한 ZF 유전자에 대한 분석을 위해서 X, Y 염색체간 길이 차이를 나타내는 intron 7을 포함한 단편을 얻기 위해 기존에 보고된 인간, 소의 서열 중 exon 7과 exon 8의 서열을 비교하여 상동성이 높은 부분에서 primer를 제작하였다. Primer 제작은 Primer 3 web program을 이용하였으며, 증폭과정에서 mis- priming을 최소화하기 위해 Rodent and Simple library option을 이용하였다.
- 유전자 증폭산물에 대한 염기서열 결정을 위하여 DNA sequencing을 수행하였다. 정제된 PCR 산물은 TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen, USA)으로 재조합한 후, Wizard Plus SV MiniPreps (Promega, USA)으로 plasmid DNA를 추출하였다.
- DNA sequencing을 수행하였다. 정제된 PCR 산물은 TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen, USA)으로 재조합한 후, Wizard Plus SV MiniPreps (Promega, USA)으로 plasmid DNA를 추출하였다. 주줄한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 Megabase 500(Amersham Parmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다.
- 또한 Duroc, Landrace, Large White 품종 각 10 두의 수컷에서 채취한 정액에서도 DNA를 추출하여 분석에 이용하였다. 조직에서 DNA 추출은 sucrose-proteinase K 방법 (Birren 등, 1997)을 일부 변형하여 수행하였으며, 1 개의 모근과 소량의 정액에서 DNA 추출은 Chelex 100 resin(Bio-Rad, USA)을 이용하였다. 각각의 정액 시료와 모근 1 개를 DNA 추출완충액(5 % Chelex /1 % SDS / 10mM Tris/1 mM EDTA)이 들어있는 tube에 넣고 10 분간 끓인 후 용액부분에 isopropanol 을 첨가하여 DNA를 침전시켰다.
- 조직으로부터 분리한 DNA를 주형으로 한 PCR 반응은 10 # 반응 왼충액, 20 mM dNTP, 각각 200 mM primer, 1.5 units Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈 이온수를 첨가호# 25/21 용량으로 반응하였다. 혈액, 피부, 근육에서 추출한 10-100ng, 정자시료에서는 l~2ng, 1 개의 모근으로부터 추출한 DNA 전체를 PCR 주형으로 이용하였다.
- 정제된 PCR 산물은 TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen, USA)으로 재조합한 후, Wizard Plus SV MiniPreps (Promega, USA)으로 plasmid DNA를 추출하였다. 주줄한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 Megabase 500(Amersham Parmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들을 근거로 exon-intron 경계를 확인하였고, CLUSTAL W(Thompson 등, 1994) program으로 다중염기정렬을 수행하여 염기변이를 확인하였다
- 반응 시 primer의 annealing 온도는 각각의 primer의 7#에 근거하여 설정하였다. 증폭 산물은 ethidium bromide가함유된 1.5% agarose 겔 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 확인하고 사진촬영 하였다.
- 각각의 정액 시료와 모근 1 개를 DNA 추출완충액(5 % Chelex /1 % SDS / 10mM Tris/1 mM EDTA)이 들어있는 tube에 넣고 10 분간 끓인 후 용액부분에 isopropanol 을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 추출한 모든 DNA는 RNase(Sigma, USA) 처리 후 phenol 추줄법과 ethanol 침전으로 다시 회수하고 TE buffer에 용해하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
- 현재 우리나라에서 사육되고 있는 돼지 5 품종(Berkshire, Duroc, Hampshire, Landrace, Large White) 각 30 두와 제주재래돼지 20 두, 한반도 재래돼지 20 두를 대상으로 전혈, 근육, 피부, 모근 등에서 추출한 DNA를 대상으로 유전 자성 판별을 위한 PCR 증폭 실험을 수행하였다. 또한 Duroc, Landrace, Large White 품종 각 10 두의 수컷에서 채취한 정액에서도 DNA를 추출하여 분석에 이용하였다.
- 5 units Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈 이온수를 첨가호# 25/21 용량으로 반응하였다. 혈액, 피부, 근육에서 추출한 10-100ng, 정자시료에서는 l~2ng, 1 개의 모근으로부터 추출한 DNA 전체를 PCR 주형으로 이용하였다. PCR 증폭은 PTC-200(MJ Research, USA)을 이용하여 Han 등(2004)의 방법을 변형하여 수행하였다.
- 혈액이나 근육, 피부에서 추출한 DNA 외에도 모근 각 1 개와 소량의 정자에서 추출한 DNA에 대한 분석 역시 정확한 결과를 나타내었다. 혈액과 근육, 모근에 대한 SRY 분석결과는 수집한 개체의 성에 따라 수컷에서만 PCR 산물이 특이적으로 관찰되었고, 정액에서 추출한 DNA에서도 PCR 산물이 관찰되었다 돼지 품종 간특이적 염기서열의 유무를 확인하기 위해 DNA sequencing을 수행하였고, GenBank aatabase에 등록하였다(Acc. No. AJ842527-AJ842531, AJ842536 - AJ842540, AJ842547 - AJ842550). 다중염기 정렬을 수행한 결과 전체 5 지점에서 단일염기변이(SNP)가 확인되었으며, SNP는 품종 특이적인 양상을 보였다(data not shown).
대상 데이터
- 직접 고안하였다. Y 염색체 상에 특이적으로 암호화된 SRY 유전자의 경우 기존에 보고된 돼지 SRY 유전자 서열(U49860)로부터 primer를 제작하였다. 또한 ZF 유전자에 대한 분석을 위해서 X, Y 염색체간 길이 차이를 나타내는 intron 7을 포함한 단편을 얻기 위해 기존에 보고된 인간, 소의 서열 중 exon 7과 exon 8의 서열을 비교하여 상동성이 높은 부분에서 primer를 제작하였다.
성능/효과
- AJ842527-AJ842531, AJ842536 - AJ842540, AJ842547 - AJ842550). 다중염기 정렬을 수행한 결과 전체 5 지점에서 단일염기변이(SNP)가 확인되었으며, SNP는 품종 특이적인 양상을 보였다(data not shown). Berkshire, Duroc, Hampshire, Landrace 품종에서는 품종별로 SRY 서열이 모두 동일하였으나, 제주도와 한반도 재래돼지와 Large White의 경우는 두 가지 이상의 서열을 나타내었다.
- Berkshire, Duroc, Hampshire, Landrace 품종에서는 품종별로 SRY 서열이 모두 동일하였으나, 제주도와 한반도 재래돼지와 Large White의 경우는 두 가지 이상의 서열을 나타내었다. 또한 Berkshire, Hampshire, Lmdrace에서 조사된 서열들과 Large White, 제주 재래돼지, 한반도 재래돼지의 일부는 전체 염기서열이 동일하게 나타났다. 유전자 서열의 유사도가 대단히 높아(99.
- 입 이외에도 가X에서 2-bp, 4-bp 결실돌연변이가 각각 하나씩, ZFY 상에서도 하나의 4-bp 결실돌연변이가 추가로 줄현하기 때문이다(data not shown). 본 연구에서 ZFX-ZFY 유전자 증폭에 이용한 primer는 Poloumienko(2004)°l] 의해 ZFX-ZFY 유전자상에서 이형성을 나타내는 intron 7의 양쪽에 위치한 exon 7과 exon 8에서 고안함으로써 intron 부위의 증폭과정에서 주형 DNA-primer annealing 과정에 높은 상보성을 부여할 수 있었기 때문에 반복수행에 결과 재현성을 높게 나타났고, 표현형 에 따른 성 판별 결과 및 SRY 분석 결과와 정확히 일치하였다.
- 2). 염기서열에 대한 분석 결과 X 염색체 유래인 ZFX의 intron 7은 221-bp, Y 염색체 유래인 ZY에서는 318-bp로 기존의 보고와 동일한 길이를 나타내었다 본 연구에서 고안한 exon 7과 exon 8의 일부가 포함된 전체 PCR 산물의 길이는 각각 ZFX 379-bp, ZFY 476-bp로 확인되었다. 돼지 ZX와 ZFY intron 7 서 열간 유사도는 약 50 %로 매우 낮은 수치를 보였고, 이는 ZFY intron 7의 전반부에서 95-bp SINE-like element의 줄현에 따른 결과이다(Erlandsson 등, 2000; Poloumienko, 2004).
- 나타내었다. 조직이 유래된 개체의 표현형에 따라 혈액, 근육, 피부, 모근에서는 단일밴드인 ZFX만을 나타내는 암컷과 ZFX와 ZFY 유래의 두 밴드들을 모두 갖는 수컷으로 구분되었고, 정액 유래의 DNA에서는 ZFX와가# 증폭산물이 모두 관찰되었다(Fig. 2). 염기서열에 대한 분석 결과 X 염색체 유래인 ZFX의 intron 7은 221-bp, Y 염색체 유래인 ZY에서는 318-bp로 기존의 보고와 동일한 길이를 나타내었다 본 연구에서 고안한 exon 7과 exon 8의 일부가 포함된 전체 PCR 산물의 길이는 각각 ZFX 379-bp, ZFY 476-bp로 확인되었다.
후속연구
- SRY의 경우 수컷에서만 PCR 산물이 출현하고 ZF는 암수에 따라 서로 다른 증폭 양상을 나타내게 된다. PCR 증폭 후 전기영동만으로 신속하고 경제적으로 암수판별이 가능하며, ZFXZFK와 SRY 두 유전자에 대한 분석을 동시에 수행함으로써 고도의 정확성을 마련하고 개개의 유전자에 대한 단일 분석결과의 오류를 보완할 수 있는 실험체계라 하겠다. 아울러 현재 DNA 추출 후 시험에 적용하고 있는 실험기법의 민감도를 높여 단일세포 수준에서 판별할 수 있는 범위로 확대해 간다면 돼지뿐만 아니라 소, 말 등 모든 가축에 대하여 적용범위를 확대할 수 있을 것이고, 특히 집단 내에서 암컷의 비율이 돼지를 비롯한 대부분의 축종에서 농가의 수입과 직결된다는 면에서 본 연구 결과는 지대한 파급효과를 나타낼 것으로 사료된다.
- PCR 증폭 후 전기영동만으로 신속하고 경제적으로 암수판별이 가능하며, ZFXZFK와 SRY 두 유전자에 대한 분석을 동시에 수행함으로써 고도의 정확성을 마련하고 개개의 유전자에 대한 단일 분석결과의 오류를 보완할 수 있는 실험체계라 하겠다. 아울러 현재 DNA 추출 후 시험에 적용하고 있는 실험기법의 민감도를 높여 단일세포 수준에서 판별할 수 있는 범위로 확대해 간다면 돼지뿐만 아니라 소, 말 등 모든 가축에 대하여 적용범위를 확대할 수 있을 것이고, 특히 집단 내에서 암컷의 비율이 돼지를 비롯한 대부분의 축종에서 농가의 수입과 직결된다는 면에서 본 연구 결과는 지대한 파급효과를 나타낼 것으로 사료된다.
- 또한 Berkshire, Hampshire, Lmdrace에서 조사된 서열들과 Large White, 제주 재래돼지, 한반도 재래돼지의 일부는 전체 염기서열이 동일하게 나타났다. 유전자 서열의 유사도가 대단히 높아(99.64 ~ 100%) 계통 유연관계를 확인하기에는 어려움이 있었으나, 이들 중 SNP 를 보이는 품종들은 SNP 부분만을 확인할 수 있는 정밀한 실험기법이 개발된다면 부계 기원을 확인하는 표지자로도 유용할 것으로 사료된다.
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