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문제 정의
- 따라서 본 연구는 매실추출 혼합물의 in vitro 항균효과를 검정하고 이를 근거로 육계 사료에 위장관 환경조절제로서 매실추출물 및 유산 (lactic aicd) 그리고 항산화제로서 포도 씨앗 추출물을 혼합한 제제를 급여하여 성장 및 사료 효율, 혈액성상, 소장의 소화 효소 활성도 및 세균총에 미치는 작용에 대하여 조사하여 항생 제대체제로서의 가능성에 대한 연구를 실시하였다.
- 최근 천연자원을 이용한 항생제 대체 사료첨가제의 개발이 주목을 받고 있는바, 본 연구는 국내 식물자원인 매실과 장관내 환경조절물질인 유산 등을 이용하여 장내 유해 환경조절, 항산화 작용 등과 같은 효능을 보이는 천연소재를 이용하여 항생제 대체 효과를 지닌 사료 첨가제를 검색하고자 하였다. 그러나 국내외적으로 매실 또는 그 부산물을 이용하여 항생제 대체 사료첨가제로서 과학적으로 연구된 결과는 거의 없는 실정이다.
제안 방법
- 소장점막 세포 내 존재하는 단백질은 Bicinchoninic Acid(BCA) 방법(Pierce)을 이용하여 560 nm에서 ELISA로 측정하였으며 표준곡선은 BSA를 희석하여 사용하였다. Alkaline pho-sphatase(ALP)는 Sig ma Diagnostic Assay Kit을 이용하여 매 1분간 5회 연속적으로 405nm에서 ELISA(Molecular devices Co.)로서 kinetic을 측정하였다. Sucrase 및 maltase는 Dahlgvist(1968) 의 변형된 방법에 의해서 측정하였으며, 생성된 최종 분해산물인 glucose는 450nm에서 ELISA을 이용하였다.
- 대장균(E. coli ) 조사는 맹장 소화물 1g을 획득하여 계단식으로 연속 희석하여 37 에서 MacConkey agar(Difco)에 24시간 호기성 배양을 실시하여 colony forming units(CFU)을 측정하였다. 유산균(lactobacillus)은 위와 동일한 방법으로 MRS agar(Difco)을 이용하여CFU를 측정하였다.
- 5%(w/w) 수준으로 첨가하였다. 대조구 사료를 포함하여 모두 3종류의 시험 사료를 제조한 후 밀봉하여 저온(15 )에 보관하고 일정량 동물이 충분히 먹을 수 있는 양을 급여하여 자유 채식시켰다. 시험사료의 조성 및 화학적 성분은 Table 1에 나타난 바와 같다.
- 항생제첨가 구는 전기사료에 네오마이신(33 ppm) 과 옥시테트라사이클린(100 ppm)을 혼합하였으며 후기사료에는 colistin(10 ppm)을 투여하였다. 또한 매실혼합물첨가구(PRUN)는 in vitro 검정시험으로 확인된 매실함유 혼합제제(매실 추출물 25%유산 75%포도씨앗 추출물 10 ppm)를 0.5%(w/w) 수준으로 첨가하였다. 대조구 사료를 포함하여 모두 3종류의 시험 사료를 제조한 후 밀봉하여 저온(15 )에 보관하고 일정량 동물이 충분히 먹을 수 있는 양을 급여하여 자유 채식시켰다.
- 측정하였다. 또한 본 사양시험 동안 사료 섭취량을 조사하여 사료요구율을 계산하였다.
- 사용한 시험물질은 다음과 같다. 먼저 매실(청매실)은 시중에서 구입한 후 과육을 수거하여 완전히 동결 건조한 매실 분말을 메탄올 (1:1 비율)에 침지하여 5일 동안 정기적으로 흔들어 주어 매실의 유효 성분을 추출하였다. 추출 과정이 완료된 후, 그 여과액을 회전식 진공 증발장치(60 )에서 증발시켜 고농축 매실 조 추출물(crude extract)을 획득하였다.
- 앞서 제조된 각 성분의 특정 농도의 희석액 20 를 디스크(disk, 6mm)에 주입한 후건 조 시켜 패트리 접시에 일정한 간격으로 배열하고 37 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 클린 존(미생물 성장이 억제된 반경)을 측정하여 항균력의 범위로 간주하였다.
- 사양시험이 종료되는 35일령에 체중을 측정한 후, 각 처리구당 평균 체중에 가까운 8수씩 모두 24수를 선발하여 도살 전 6시간 동안 절식을 실시하고 경정맥을 절단하여 혈액을 채취하여 혈장을 분리하였다. 이어서 복강을 가위로 절개하고 췌장 및 소장을 획득하여 무게를 측정하였으며, 장 미생물 분석을 위해 맹장 부위의 소화물을 채취하였다.
-
(2) 시험사료 및 시험설계
시험사료는 육계전기(3~21일령) 및 육계후기 (22~35일령) 등 2 종류 무항제 사료를 제조하였으며 실험설계에 따라 무항생제구(대조구, CON), 항생제첨가구(ANTI) 및 매실 혼합물첨가 구(PRUN) 등 3개의 처리구로 설정하였다. 항생제첨가 구는 전기사료에 네오마이신(33 ppm) 과 옥시테트라사이클린(100 ppm)을 혼합하였으며 후기사료에는 colistin(10 ppm)을 투여하였다.
- 소장 점막 세포를 분리하기 위해 냉각된 생리식염수로서 소장 내부를 세척하고 소화물을 제거한 후 가위로 장간막 부위를 절개하여 생리식염수에 3차례 연속적으로 세척하였다. 여분의 수분을 제거하기 위하여 손으로 일정한 압력으로 압착한 후 소장 전체 무게를 측정하였다. 이어서 얼음으로 냉각된 알루미늄판위에서 절개된 소장을 펴서 glass slide를 이용하여 점막세포를 채취하여 무게를 측정하였다.
- coli ) 조사는 맹장 소화물 1g을 획득하여 계단식으로 연속 희석하여 37 에서 MacConkey agar(Difco)에 24시간 호기성 배양을 실시하여 colony forming units(CFU)을 측정하였다. 유산균(lactobacillus)은 위와 동일한 방법으로 MRS agar(Difco)을 이용하여CFU를 측정하였다.
- 혈장을 분리하였다. 이어서 복강을 가위로 절개하고 췌장 및 소장을 획득하여 무게를 측정하였으며, 장 미생물 분석을 위해 맹장 부위의 소화물을 채취하였다. 소장 점막 세포를 분리하기 위해 냉각된 생리식염수로서 소장 내부를 세척하고 소화물을 제거한 후 가위로 장간막 부위를 절개하여 생리식염수에 3차례 연속적으로 세척하였다.
- 여분의 수분을 제거하기 위하여 손으로 일정한 압력으로 압착한 후 소장 전체 무게를 측정하였다. 이어서 얼음으로 냉각된 알루미늄판위에서 절개된 소장을 펴서 glass slide를 이용하여 점막세포를 채취하여 무게를 측정하였다. 무게를 채취한 모든 조직은 액체질소에 냉동하여 70 에 보관하여 분석에 사용하였다.
- 체중 측정은 시험 개시(3일령), 21일령 및 시험종료(35일령)에 정해진 시간에 일정하게 체중을 측정하였다. 또한 본 사양시험 동안 사료 섭취량을 조사하여 사료요구율을 계산하였다.
- 일반사양관리는 온도 및 명암조절을 갖춘 사육시설에서 본 대학의 사육 관리 지침에 따라 실시되었다. 체중은 시험개시, 21일령 및 35일령에 각각 측정하여 증체량을 측정하고 21일령 및 35일령에 사료섭취량을 측정하여 사료 요구율을 계산하였다.
- 먼저 매실(청매실)은 시중에서 구입한 후 과육을 수거하여 완전히 동결 건조한 매실 분말을 메탄올 (1:1 비율)에 침지하여 5일 동안 정기적으로 흔들어 주어 매실의 유효 성분을 추출하였다. 추출 과정이 완료된 후, 그 여과액을 회전식 진공 증발장치(60 )에서 증발시켜 고농축 매실 조 추출물(crude extract)을 획득하였다. 유기산 제제로서 사용한 유산(lactic acid)은 순도 50%로서 올더베스트(주) 제품을 사용하였다.
- 4)에서 tissue grinder로서 균질화 한 후 3, 000 rpm에서 10분간 분리하여 상등액을 취하였다. 췌장 a -amylase는 1% 전분 기질을 분해 할 수 있는 효소량을 dinitrosalicyclic 발색용액으로 발색시켜 540nm 파장에서 spec-trophotometer(Uvikon)를 이용하여 측정하였다. 표준 용액으로서는 maltose를 이용하여 표준 곡선을 측정하였다(Bernfeld, 1955).
- 표준 용액으로서는 maltose를 이용하여 표준 곡선을 측정하였다(Bernfeld, 1955). 췌장 trypsin 은 균질액에 0.1U enterokinase를 넣어 trypsinogen을 활성화시켜 benzoyl-L-arginine ethyl ester를 기질로 사용하여 spectrophotometer로 253nm에서 5분 동안 매 1분 간격으로 kinetics 조사하여 활성도를 측정하였다(Geiger 및 Fritz, 1986). 효소의 특이적 활성도(specific activity) 는전체 활성도에서 단백질 mg당 농도로 나누어 표시하였다.
- 항생제첨가 구는 전기사료에 네오마이신(33 ppm) 과 옥시테트라사이클린(100 ppm)을 혼합하였으며 후기사료에는 colistin(10 ppm)을 투여하였다. 또한 매실혼합물첨가구(PRUN)는 in vitro 검정시험으로 확인된 매실함유 혼합제제(매실 추출물 25%유산 75%포도씨앗 추출물 10 ppm)를 0.
- 혈장 AST(aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), glucose, triglyceride, cholesterol, creatinine 분석은 자동생화학분석기 (Hitachi 747, Japan)를 사용하여 실시되었다.
대상 데이터
- 본 시험에 공시된 시험동물은 육계 수컷 Ross종 96수로서 (주)올품에서 구입하였다. 구입 후 스트레스로 인한 부작용을 줄이기 위하여 2일간 적응기간을 거친 3일령(49.
- 산화작용이 있는 것으로 알려진 포도 씨앗 추출물(SUSA International Inc, USA)을 시중에서 구입하여 사용하였다.
- 추출 과정이 완료된 후, 그 여과액을 회전식 진공 증발장치(60 )에서 증발시켜 고농축 매실 조 추출물(crude extract)을 획득하였다. 유기산 제제로서 사용한 유산(lactic acid)은 순도 50%로서 올더베스트(주) 제품을 사용하였다. 또한 항
데이터처리
- 사료처리에 따른 육계의 사양성적 등을 비롯한 각종 data는 Proc-GLM(SAS, 1989)에 의한 분산분석을 실시하였으며, 처리 간 비교는 Duncan 방법(Duncan, 1955)에 의해 P<0.05 수준에서 유의성 검정이 실시되었다.
이론/모형
- Sucrase 및 maltase는 Dahlgvist(1968) 의 변형된 방법에 의해서 측정하였으며, 생성된 최종 분해산물인 glucose는 450nm에서 ELISA을 이용하였다. Leucine aminopeptidase 활성도는 Rybina 등(1997)의 변형된 방법에 의해 Leucine p-nitroaniline를 기질로 사용하여 96 well plate (Nunc)에서 반응시켜 ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 췌장 효소분석을 위해 전체 췌장을 Tris buffer 용액(pH; 7.
- )로서 kinetic을 측정하였다. Sucrase 및 maltase는 Dahlgvist(1968) 의 변형된 방법에 의해서 측정하였으며, 생성된 최종 분해산물인 glucose는 450nm에서 ELISA을 이용하였다. Leucine aminopeptidase 활성도는 Rybina 등(1997)의 변형된 방법에 의해 Leucine p-nitroaniline를 기질로 사용하여 96 well plate (Nunc)에서 반응시켜 ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 매실추출물, 유산 및 포도씨앗추출물과 이들 3종류 혼합물을 농도별로 조합하여 paper disc agar diffusion 법에 따라 항균력을 조사하였다. 각 성분을 농도별로 조합하여 항균력을 관찰한 결과 유산 50% 이상 및 매실추출물 12.
- 소장점막 세포 내 존재하는 단백질은 Bicinchoninic Acid(BCA) 방법(Pierce)을 이용하여 560 nm에서 ELISA로 측정하였으며 표준곡선은 BSA를 희석하여 사용하였다. Alkaline pho-sphatase(ALP)는 Sig ma Diagnostic Assay Kit을 이용하여 매 1분간 5회 연속적으로 405nm에서 ELISA(Molecular devices Co.
- 위에서 언급한 매실 추출물, 유산 및 포도 씨앗 추출물과 이들의 혼합물의 항균력 조사는 paper disc agar diffusion법(Collins 및 Lyne, 1989)에 따라 분석하였다. 분석방법을 간단히 기술하면 먼저 E.
- 32g) 병아리를 3개 처리구에 케이지 당 4수씩 각각 8반복으로 모두 96수를 완전임의 배치하였다. 일반사양관리는 온도 및 명암조절을 갖춘 사육시설에서 본 대학의 사육 관리 지침에 따라 실시되었다. 체중은 시험개시, 21일령 및 35일령에 각각 측정하여 증체량을 측정하고 21일령 및 35일령에 사료섭취량을 측정하여 사료 요구율을 계산하였다.
성능/효과
- 조사하였다. 각 성분을 농도별로 조합하여 항균력을 관찰한 결과 유산 50% 이상 및 매실추출물 12.5% 이상에서 비교적 높은 항균력이 나타났다(자료 미제시). 최종적으로 항균 효과 및 경제성을 고려하여 육계사양시험에 필요한 최종 매실 추출혼합물은 매실추출물 25% 유산 75% 포도 씨앗 추출물 10 ppm으로 조성하였으며, 매실 추출혼합물의 Fig.
- 05) 다소 감소하는 결과를 나타내었다. 대조구와도 비교시 전체 증체량, 사료 섭취량 및 사료 요구율에서 유의적 차이 없이 약간 증가되는 경향이 나타났다. 그러나 대조구는 항생제첨가구에 비해 유의적으로 낮은(P<0.
- 본 시험에서도 매실추출혼합물 급여시다른 처리구에 비해 췌장 amylase 및 trypsin 활성도가 증가되는 경향을 보였다. 따라서 구연산 등이 다량 함유된 매실, 유산과 같은 유기산은 가축사료 첨가제로 급여시 위와 장내 pH 저하, 소화효소 활성, 대장균 증식 억제, 영양소 소화 증진, 설사억제, 유산균의 성장촉진을 통한 유해균 억제 등과 같은 다양한 기전으로 가축에 유익한 것으로 사료된다. 그 외 매실 및 포도씨앗추출물은 천연 항산화제로서 세포의 항산화력 방어 작용이 기대되는 것으로 여러 연구에서 발표되고 있다(한 등, 2001; 장 등, 2007).
- 매실의 주요성분인 구연산을 쇠고기의 표면에 분무시에, 대장균 및 살모렐라와 같은 병원성균을 효과적으로 감소시킬 수 있다고 알려지고 있다(Castillo 등, 1999). 따라서 장내 유산균이 활발하게 증식될 경우, 장내 pH가 저하되어 장내 유해미생물 균의 번식이 억제되어 결과적으로 동물자체의 독성물질 생성 방지, 면역력 증강 등과 같은 효과 등이 나타날 수 있다. 특히, 장내 유해 병원성 세균은 대부분 그람 음성균(E.
- 맹장 부위의 소화물을 채취하여 대장균을 조사 결과 모든 처리구에서 대장균 수는 유의적 차이를 발견 할 수 없었다( Table 7). 한편 소화물에 존재하는 유산균은 매실혼합물 첨가 구에서 대조구에 비해 유의적으로(P<0.
- 최근에는 백리향이나 계피 등과 같은 천연 식물로부터 추출한 생리활성 오일이 항균작용, 항산화 작용 및 소화효소 활성화 작용이 보고되었다(Lee 및 Ahn, 1998; Jang 등, 2007). 본 시험에서 조사된 결과로서 유산을 함유한 매실 혼합물을 섭취한 육계에서 증체 등에서 항생제첨가 구에 비해 다소 낮았으나 유의적 차이는 없었으며, 오히려 장내 유산균이 증가하는 것으로 나타났다. 혈액 생화적 성분을 조사한 결과에서 항생제첨가구에 비해 혈중 triglycerides 수준이 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다.
- 5 이하에서 활발하므로 가축의 장내 pH를 저하시키는 사료첨가제를 개발하여 급여할 경우 유해 미생물의 번식을 억제하여 항생 효과를 나타낼 수 있다. 본 시험에서도 매실추출물이 in vitro 시험결과에서 항균작용이 입증되었으며, 육계를 이용한 in vivo 시험에서도 맹장내 유산균 증식에 유리한 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 본 시험에서도 매실추출혼합물 급여시다른 처리구에 비해 췌장 amylase 및 trypsin 활성도가 증가되는 경향을 보였다. 따라서 구연산 등이 다량 함유된 매실, 유산과 같은 유기산은 가축사료 첨가제로 급여시 위와 장내 pH 저하, 소화효소 활성, 대장균 증식 억제, 영양소 소화 증진, 설사억제, 유산균의 성장촉진을 통한 유해균 억제 등과 같은 다양한 기전으로 가축에 유익한 것으로 사료된다.
- 5). 소장 점막상피세포에 존재하는 ALP, leucine aminopeptidase 및 이당류 분해효소(maltase, sucrase)의 활성도를 조사한 결과에서도, 매실추출혼합물의 첨가가 소장 흡수세포막 효소(brush border membrane hydrolase) 에 존재하는 효소의 활성도에 변화를 미치지 않는 것으로 관찰되었다( Table 6).
- 같다. 시험 결과 소장의 길이는 매실 혼합물 첨가 구에서 대조구와 비교시 유의적으로 (P<0.05) 증가되었으며 항생제첨가구와는 차이가 나타나지 않았다. 소장 점막세포 및 췌장 무게는 모든 처리구에서 비슷한 것으로 관찰되었다.
- 시험 결과를 살펴보면 매실혼합물첨가구에서 체중 및 일당증체량은 항생제첨가구와 비교시 통계적 유의적인 차이 없으나(P>0.05) 다소 감소하는 결과를 나타내었다. 대조구와도 비교시 전체 증체량, 사료 섭취량 및 사료 요구율에서 유의적 차이 없이 약간 증가되는 경향이 나타났다.
- 육계에서 매실추출혼합물 급여에 따른 췌장 효소 활성도 및 소장 점막효소 활성도를 조사한 결과 단백질 및 전분의 분해 작용에 관여하는 췌장 amylase와 trypsin 활성도는 사료의 처리에 따른 유의적 변화가 없었으나 전반적으로 매실 혼합물 급여 구에서 활성도가 증가되는 수치를 보였다( Table 5). 소장 점막상피세포에 존재하는 ALP, leucine aminopeptidase 및 이당류 분해효소(maltase, sucrase)의 활성도를 조사한 결과에서도, 매실추출혼합물의 첨가가 소장 흡수세포막 효소(brush border membrane hydrolase) 에 존재하는 효소의 활성도에 변화를 미치지 않는 것으로 관찰되었다( Table 6).
- 5% 이상에서 비교적 높은 항균력이 나타났다(자료 미제시). 최종적으로 항균 효과 및 경제성을 고려하여 육계사양시험에 필요한 최종 매실 추출혼합물은 매실추출물 25% 유산 75% 포도 씨앗 추출물 10 ppm으로 조성하였으며, 매실 추출혼합물의 Fig. 1에서 나타낸 바와 같이 우수한 in vitro 항균효과를 보였다.
- 따라서 매실혼합물 급여는 대조구 보다는 우수하고 항생제처리구 보다는 다소 낮은 중간 정도의 사육 성적을 나타내어 항생제 대체용 사료첨가제로서의 가능성이 있는 것으로 사료된다. 폐사율을 조사한 결과 대조구와 항생제첨가 구에서만 각각 한 마리가 폐사되었으며, 매실혼합물급여구에서는 폐사가 발생되지않았다.
- 혈중 생화학적인 성분에서 간 독성지표로 알려진 AST, ALT 등에는 사료첨가제 급여에 따른 어떠한 차이도 발견 할 수 없어 육계의 사료첨가 보조제로서 매실 혼합물이 체내에 독성 작용 없이 사용될 수 있음이 나타났다. 한편 glucose, cholesterol 등의 함량에서 처리 간 어떠한 변화가 관찰되지 않았으나, triglycerides 함량에서는 매실혼합물첨가구에서 항생제첨가 구에 비해 유의적으로(P<0.05) 감소되었다.
- 발견 할 수 없었다( Table 7). 한편 소화물에 존재하는 유산균은 매실혼합물 첨가 구에서 대조구에 비해 유의적으로(P<0.05) 증가되어 본 매실추출물 급여가 장내 유익균의 정착에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 본 시험에서 조사된 결과로서 유산을 함유한 매실 혼합물을 섭취한 육계에서 증체 등에서 항생제첨가 구에 비해 다소 낮았으나 유의적 차이는 없었으며, 오히려 장내 유산균이 증가하는 것으로 나타났다. 혈액 생화적 성분을 조사한 결과에서 항생제첨가구에 비해 혈중 triglycerides 수준이 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다. 또한 췌장에서 분비되는 amylase와 trypsin, 소장 미세융모에 존재하는 효소 활성도 역시 대조구와 항생제첨가구에 비해 감소되지않았다.
- 나타내었다. 혈중 생화학적인 성분에서 간 독성지표로 알려진 AST, ALT 등에는 사료첨가제 급여에 따른 어떠한 차이도 발견 할 수 없어 육계의 사료첨가 보조제로서 매실 혼합물이 체내에 독성 작용 없이 사용될 수 있음이 나타났다. 한편 glucose, cholesterol 등의 함량에서 처리 간 어떠한 변화가 관찰되지 않았으나, triglycerides 함량에서는 매실혼합물첨가구에서 항생제첨가 구에 비해 유의적으로(P<0.
후속연구
- 오히려 췌장 분비 효소들은 다른 구에 비해 증가되는 경향을 보였다. 이상의 결과와 고찰에서 매실추출물 등과 같은 천연 식물자원은 적절한 사양 조건하에서 가축사료 첨가제로서 일부분 항생제를 대체할 수 있는 효과가 있을 것으로 사료되며 이에 대한 효능연구는 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 스웨덴, 덴마크 등과 같은 유럽 국가들을 중심으로 가축 사료 첨가제로서 항생제 사용이 금지 또는 극도로 제한되고 있다. 최근 이와 같은 시대적 흐름에 따라 사료에 첨가되는 항생제를 53종에서 25종으로 대폭 축소하고, 2012년 농장에 대한 HACCP 제도를 도입하는 등 사료 위생관리를 엄격히 관리하는 단계로 접어들면서, 항생제를 대치 할 수 있는 대체제제에 대한 연구가 절실히 요구된다. 따라서 축산식품 소비자는 물론 생산자를 위해서도 사료에 첨가되는 항생제를 대체할 수 있는 안전성이 확보된 후보 물질의 연구 개발 및 효능 연구는 미래 지속가능한 동물산업을 위해 필연적으로 해결해야만 하는 향후의 숙제이다.
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