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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 성장촉진용 항생제대체제 개발 및 이를 이용한 무항생제 닭고기 생산을 목표로 인진쑥 및 녹차의 추출수율, 총 페놀화합물 함량, 항산화 활성, 항균 활성 및 면역 활성을 in vitro 실험을 통해 구명하는 한편, 이들 추출물을 육계에 음수 급여하여 육계 생산성, 조직의 상대적 중량, 장내 미생물 균총, 혈액 특성 및 비장 내 cytokines mRNA 발현량에 미치는 영향을 조사하였다.
- 본 연구는 무항생제 닭고기 생산을 위한 성장촉진용 항생제를 대체할 천연생리활성물질 개발을 목표로 실험 1에서는 인진쑥 및 녹차의 추출수율, 총 페놀화합물 함량, 항산화 활성, 항균 활성 및 면역 활성을 in vitro 실험을 통해 구명하는 한편, 실험 2에서는 이들 추출물을 육계에 음수 급여하여 생산성, 조직 및 소장의 변화, 장내 미생물 균총, 혈액 특성 및 비장 cytokines mRNA 발현량에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 맹장 내 미생물 균총의 변화를 조사하기 위해서 시험 종료시 처리구당 6수씩 희생시켜 맹장 내용물을 채취한 후 Salmonella spp., coliform bacteria 및 lactic acid bacteria의 수를 측정하였다. 양쪽 맹장의 내용물을 혼합하여 생리식염수로 10-9까지 계단 희석하였다.
- Muller-Hinton broth(Difco, USA)에 생균수가 1×106 CFU/mL이 되도록 접종한후 인진쑥 및 녹차 추출물 1 mL을 첨가하고 12시간 배양하였다. 12시간 배양한 후 이를 고체배지에 도말하여 균의 생육여부 및 균수를 측정하였다. 추출물 대신 증류수를 첨가한 대조구와 비교하여 성장 저해율을 %로 나타내었다.
- DNA marker와 전기영동 후 DNA band를 비교하여 target gene임을 확인한 후, image analyzer(Bio-capt ver. 99.4, Vilber Loumat, France)를 사용하여 β-actin의 DNA band의 OD(optical density)값과 IL-2 및 IL-6의 OD값을 측정하였으며, β-actin의 DNA band의 OD값으로 각각의 IL-2 및 IL-6 OD값을 나누어 상대적 비율을 구하여 비교 분석하였다.
- 양쪽 맹장의 내용물을 혼합하여 생리식염수로 10-9까지 계단 희석하였다. 단계적으로 희석된 내용물을 SS agar(Salmonella spp.), MacConkey agar (coliform bacteria) 및 Rogosa agar(lactic acid bacteria) 평판배지에 각각 접종하였다. Lactic acid bacteria는 혐기적으로 나머지는 호기적 조건에서 24시간 배양한 후 균수를 측정하여 맹장 내용물 1g당 CFU(colony forming unit)로 계산한 후 log10으로 환산 표기하였다.
- 닭의 비장에서 분리한 lymphocyte를 배양하여 각 well당 3×105씩 되도록 하고 추출물을 농도별로 처리한 후 배양하였다.
- 사양 실험 전 기간 동안 평사에서 사육하였으며 사료 급이기 및 급수기의 개수는 반복구별 동일하게 배치하였다. 사료와 물은 자유 채식 및 자유 음수 시켰으며, 입추 후 3일간 24시간 종일 점등을 실시하였고 이후 시험 종료시까지 23시간 점등을 실시하였다.
- 생체중의 평균 범위에 해당하는 개체를 처리구별로 12수씩 희생시킨 후 도체율을 구하고, 간, 비장, 복강지방, 췌장 및 담낭을 채취하여 중량을 측정하였으며 채취한 조직들은 생체중 100 g당 상대적 중량으로 환산 표기하였다.
- 소장의 변화를 관찰하기 위해 십이지장, 공장 및 회장으로 구분하여 장 내용물을 완전히 제거한 후 중량 및 길이를 측정하였으며 생체중 100 g당 상대적 중량 및 길이로 환산 표기하였다.
- 시험 종료시 처리당 12수씩을 선발하여 익하정맥에서 혈액을 채취하고 원심분리(4℃, 1,000 g×10 min)를 통해 혈청을 분리하여 분석에 이용하였다.
- 시험 종료시 체중을 측정하여 개체별 증체량을 산출하였으며, 사료섭취량은 전기(0-3주), 후기(3-5주) 반복별로 사료잔량을 측정하여 섭취량을 구하였다. 조사된 사료섭취량과 증체량을 통해 사료요구율을 산출하였다.
- 시험사료는 NRC(1994)에 근거하여 단백질과 에너지 함량을 동일하게 배합하였으며, 육계전기(0-3주)와 육계후기(3-5주) 사료로 나누어 공급하였다. 시험사료의 배합비 및 영양소 조성은 Table 1에 나타내었다.
- 인진쑥 및 녹차 추출물의 음수 내 첨가 급여가 육계 생산성, 조직 중량, 장내 미생물 균총, 혈액 특성 및 비장 내 cytokines mRNA 발현량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1일령 육계 수평아리(Ross 308) 480수를 공시하여 4처리, 4반복, 반복당 30수씩 배치하여 5주간 사양 시험을 실시하였다. 시험처리는 항생제 무첨가구(NC), 항생제 첨가구(PC) 대조구로 하였으며, 음수 내 인진쑥 추출물 100 ppm 첨가구(AC) 및 음수 내 녹차 추출물 100 ppm 첨가구(CS)로 하였다.
- , coliform bacteria 및 lactic acid bacteria의 수를 측정하였다. 양쪽 맹장의 내용물을 혼합하여 생리식염수로 10-9까지 계단 희석하였다. 단계적으로 희석된 내용물을 SS agar(Salmonella spp.
- 역전사 반응은 2.0 µL의 RNA template와 2.0 µL의 oligo(dT)18 primer(Bioneer, Korea)를 총 부피 50 µL로 cDNA 합성과정(42℃, 60분)과 역전사효소 불활성과정(94℃, 5 min)으로 수행되었다.
- 위 과정을 통해 얻어진 cDNA로 Accupower PCR-PreMix(Bioneer, Korea)를 사용하여 interleukin-2(IL2) 및 interleukin-6(IL-6) mRNA에 대한 primer와 β-actin mRNA에 대한 primer를 사용한 정량적 polymerase chain reaction(PCR)을 통해 DNA를 증폭하고 1.7% agarose gel (Takara, Japan)에서 전기영동을 수행하였다.
- 인진쑥 및 녹차 추출물의 음수 내 첨가 급여가 육계 생산성, 조직 중량, 장내 미생물 균총, 혈액 특성 및 비장 내 cytokines mRNA 발현량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1일령 육계 수평아리(Ross 308) 480수를 공시하여 4처리, 4반복, 반복당 30수씩 배치하여 5주간 사양 시험을 실시하였다. 시험처리는 항생제 무첨가구(NC), 항생제 첨가구(PC) 대조구로 하였으며, 음수 내 인진쑥 추출물 100 ppm 첨가구(AC) 및 음수 내 녹차 추출물 100 ppm 첨가구(CS)로 하였다.
- 시험 종료시 체중을 측정하여 개체별 증체량을 산출하였으며, 사료섭취량은 전기(0-3주), 후기(3-5주) 반복별로 사료잔량을 측정하여 섭취량을 구하였다. 조사된 사료섭취량과 증체량을 통해 사료요구율을 산출하였다.
- 추출수율은 인진쑥 및 녹차 추출물을 110℃ 송풍건조기 (J-300S, JISICO, Korea)에서 건조시켜 고형분 중량을 측정하고, 이를 추출 전 사용한 인진쑥 및 녹차의 중량으로 나누어 추출 전 시료 중량에 대한 각 추출물의 건조 중량 백분율로 나타내었다.
- 시험 종료시 처리당 12수씩을 선발하여 익하정맥에서 혈액을 채취하고 원심분리(4℃, 1,000 g×10 min)를 통해 혈청을 분리하여 분석에 이용하였다. 혈액 생화학 조성은 자동 혈액 분석기(COBAS MIRA plus, ROCHE diagnostics)를 이용하여 콜레스테롤, 중성지방, blood urea nitrogen (BUN), aspartate aminotransferase(AST) 및 alanine aminotransferase(ALT)를 측정하였다.
대상 데이터
- 국내산 인진쑥 및 녹차를 한약 건재상에서 건조, 세절된 상태로 구입하여 제분기로 3 mm 이하로 분쇄한 후 사용하였다. 분쇄된 인진쑥 및 녹차 분말과 증류수를 1:10 (w/v) 비율로 혼합하여 90℃ 항온수조에서 4시간 동안 중탕 가열한 후 원심분리기를 이용하여 분리하고 상층액을 2회 여과하여 추출물을 얻었다.
- 항균 활성은 액체 배지 희석법을 이용하여 조사하였으며, 한국농업 미생물자원센터 및 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 Escherichia coli KACC 10115, Staphylococcus aureus KACC 10196, Salmonella Typhimurium KCTC 1925를 분양 받아 사용하였다. Muller-Hinton broth(Difco, USA)에 생균수가 1×106 CFU/mL이 되도록 접종한후 인진쑥 및 녹차 추출물 1 mL을 첨가하고 12시간 배양하였다.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 모든 자료들의 통계분석은 Statistical Analysis System(SAS release ver 9.1, 2002)의 General Linear Model procedure를 이용하여 분산분석을 실시하였고, 처리구간에 유의성은 Duncan's multiple range-test(Duncan, 1955)를 이용하여 신뢰구간 95% 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- 시험종료시 처리당 6수씩 희생시킨 후 비장을 채취하여 diethyl pyrocarbonate(DEPC, SIGMA Aldrich, USA) 처리한 생리식염수로 세척하고 액체질소를 이용하여 급속 냉동시켜 분석에 이용하기 전까지 -76℃에서 보관하였다. Chomczynski와 Sacchi(1987)의 acid/guanidium/phenol/chloroform법(TRizol reagent, InvitrogenTM, USA)을 사용하여 비장 조직으로부터 total RNA을 추출하였으며, 추출한 total RNA는 Accupower RT-PreMix(Bioneer, Korea)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)로 합성하였다. 역전사 반응은 2.
- 수분 함량은 105℃ 상압가열 건조법, 조단백질 함량은 Kjeldahl 법으로 측정된 질소량에 질소계수 6.25를 곱하여 산출하였으며, 조지방 함량은 soxhlet 추출법, 조섬유 함량은 H2SO4-NaOH 분해법, 조회분 함량은 직접 회화법으로 측정하였다.
- 인진쑥 및 녹차 추출물의 splenocyte에 대한 증식도는 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyl tetrazolium bromide)법을 이용하여 측정하였다. 닭의 비장에서 분리한 lymphocyte를 배양하여 각 well당 3×105씩 되도록 하고 추출물을 농도별로 처리한 후 배양하였다.
- 인진쑥 및 녹차의 일반성분은 AOAC 방법(2007)을 기초로 하여 분석하였다. 수분 함량은 105℃ 상압가열 건조법, 조단백질 함량은 Kjeldahl 법으로 측정된 질소량에 질소계수 6.
- 총 페놀화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 방법(Singleton and Rossi, 1965)을 기초로 하여 분석하였다. 인진쑥 및 녹차추출물에 2 N Folin-Ciolcateu phenol regent(Sigma, USA)를 첨가하고 실온에서 2분 동안 방치한 후 7.
- 항산화 활성을 조사하기 위해서 Blois(1958)의 방법을 기초로 하여 free radical 형태로 존재하는 DPPH(1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 전자공여능을 측정하였다. 2.
성능/효과
- 1)Vitamin-mineral mixture provided following nutrients per kg of diet: vitamin A, 15,000IU; vitamin D3, 1,500IU; vitamin E, 20.0 mg; vitamin K3, 0.70 mg; vitamin B12, 0.02 mg; niacin, 22.5 mg; thiamin, 5.0 mg; folic acid, 0.70 mg; pyridoxin, 1.3 mg; riboflavin, 5 mg; pantothenic acid, 25 mg; choline chloride, 175 mg; Mn, 60 mg; Zn, 45 mg; I, 1.25 mg; Cu, 10.0 mg; Fe, 72 mg; Co, 2.5 mg.
- 2.0×10-4 M DPPH 용액에 농도별로 반응시켜 DPPH radical을 50% 감소시키는 농도인 SC50은 인진쑥 추출물이 0.30 mg, 녹차 추출물이 0.06 mg으로 높은 항산화 활성을 나타냈다(Table 4).
- E. coli, S. Typhimurium 및 S. aureus에 대한 인진쑥 및 녹차 추출물의 성장 저해율은 각각 52.3%, 45.6%, 42.1% 및 33.7%, 28.5%, 21.6%를 나타내었다(Table 5).
- 닭의 splenocyte 증식에도 효과가 나타냈는데, 특히 인진쑥 추출물은 2.5 µL, 5.0 µL 농도에서 림프구분열촉진인자로 알려진 Echinacea 및 concanavalin A보다 우수한 세포 증식도를 보였다.
- 74 GE mg/mL이었다. 또한 이들 추출물의 항산화, 항균 활성 및 닭의 splenocyte 증식에 미치는 영향을 조사한 결과, DPPH radical을 50% 감소시키는 농도인 SC50은 각각 0.30 mg, 0.06 mg으로 나타냈으며, 유해균 3종(E. coli, S. aureus, S. Typhimurium)에 대해 항균 활성은 인진쑥 추출물이 33.7%, 21.6%, 28.5%, 녹차 추출물이 52.3%, 42.1%, 45.6%의 성장 저해율을 나타냈다. 닭의 splenocyte 증식에도 효과가 나타냈는데, 특히 인진쑥 추출물은 2.
- , 2004). 목질 부분이 많은 인진쑥의 총 페놀화합물이 높을 것으로 생각하였으나 녹차 추출물의 총 페놀화합물 함량이 가장 높았다. 녹차에는 페놀화합물의 하나로 그 생리활성 효과가 입증된 catechin이 풍부하며 총 페놀화합물 중 75% 가량을 차지하는 것으로 알려져 있다.
- 복강 지방에서는 녹차 추출물 처리구(CS)가 대조구(NC, PC)에 비해 유의하게 감소는 결과를 보였으며(p<0.05), 도체율 및 간, 비장, 췌장, F낭의 상대적 중량에 있어서는 처리구간에 큰 차이가 나타나지 않았다.
- , 1994), 본 연구에서도 시험 1을 통해 이들 추출물의 항균활성을 확인할 있었다. 본 시험 결과, 녹차 추출물은 Salmonella 등의 유해균을 효과적으로 저해하면서 유익균으로 알려진 lactic acid bacteria에는 영향을 미치지 않아 장내 미생물 균총 안정화에 긍정적인 영향을 미친 것으로 사료된다.
- , 2003). 본 시험 결과, 인진쑥 및 녹차의 추출수율은 16.8% 및 26.5%로 경제적 측면에서 활용 가능성이 높은 식물 소재로 사료된다.
- Ma 등(2009) 역시 여정자, 오미자와 같은 약용식물 추출물이 면역 세포 증식, cytokine 분비량 증가 등 면역 증진에 영향을 미친다는 결과를 보고한 바 있다. 본 시험 결과, 인진쑥 추출물이 닭의 비장 세포 증식에 긍정적인 영향을 미쳐 면역 활성 증진에 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것이라 판단된다.
- , 2008), Wang 등(1998)은 식물 유래 천연물의 첨가 급여시 영향을 미치는 주요 요인은 식물의 종류, 사용된 식물 부위 및 물리적 특성, 재배지역, 수확시기 및 사료 내 다른 성분과의 친화성으로 이들 요인에 의해 서로 상반된 결과가 나올 수 있다고 보고하였다. 본 시험 결과, 인진쑥, 녹차 추출물은 모두 육계 생산성에 긍정적인 영향을 미쳤으며, 특히 녹차 추출물이 인진쑥 추출물에 비해 육계 생산성 측면에서는 우수한 것을 확인할 수 있었다.
- 본 시험 결과, 인진쑥, 녹차 추출물은 생리적으로 부정적인 영향 없이 지질 대사에 관여하여 혈액 콜레스테롤을 감소시켰으며, 강력한 항산화 활성을 통해 간 및 조직의 손상을 저해하여 건강 유지에 긍정적인 영향을 미친 것으로 사료된다.
- Oliveira 등(1988)와 Seena 등(2005)은 식물체 내 다양한 항영양인자는 전체적으로 영양소의 소화, 흡수를 저해하고 지방, 단백질 및 탄수화물 대사를 방해하여 간 및 췌장의 비대를 유발시킬 수 있다고 하였다. 본 시험 결과, 인진쑥, 녹차 추출물은 체조직 및 주요 기관 발달에 부정적인 영향을 미치지 않았는데, 이는 약용식물의 종류, 처리방법, 급여 수준에 따른 차이로 판단되며 적절한 열처리를 통해 약용식물 내 항영양인자를 불활성화시키고 독성을 감소시켰기 때문이라고 사료된다.
- , 1996). 본 시험에서는 비장 조직 내 IL-2 및 IL-6 mRNA 발현량에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. β-actin에 대한 상대적 비율로 IL-2 및 IL-6의 mRNA 발현량을 측정하는 RT-PCR로는 splenocyte 증가에 따른 IL-2 및 IL-6의 변화를 측정하기에는 어려움이 있었으며, 비장 세포 전체에서 IL-2 및 IL-6의 mRNA 발현량을 조사하였기 때문에 그 양이 매우 적었다.
- 05). 본 연구를 통해 인진쑥 및 녹차 추출물의 생리활성효과를 구명하였으며, 이들 추출물은 육계 생산성을 향상시키고 유해균의 성장 및 증식을 억제시켜 장내 미생물 균총 안정화에 긍정적인 영향을 미치는 한편, 조직 발달 및 혈액 성상에 부정적인 영향을 미치지 않아 항생제 대체제로서의 이용 가능성을 확인하였다.
- 실험 1에서 항산화, 항균 및 면역조절효과가 확인된 인진쑥, 녹차 추출물을 육계에 음수 급여한 결과, 인진쑥, 녹차 추출물 처리구가 무항생제 대조구(NC)에 비해 종료체중 및 증체량이 유의하게 증가하였으며(p<0.05), 맹장 내 Salmonella 수에서는 무항생제 대조구(NC)에 비해 유의하게 감소하거나, 감소하는 경향을 나타내었다(p<0.05).
- 이들 추출물 급여에 따른 IL-2 및 IL-6 band의 발현 양상의 차이는 관찰되지 않았으며, β-actin에 대한 IL-2와 IL6의 상대적 비율에 있어서도 차이를 나타내지 않았다.
- 인진쑥 및 녹차 추출물의 추출수율은 각각 16.8%, 26.5%이었으며, 총 페놀화합물 함량은 15.28 및 26.74 GE mg/mL이었다. 또한 이들 추출물의 항산화, 항균 활성 및 닭의 splenocyte 증식에 미치는 영향을 조사한 결과, DPPH radical을 50% 감소시키는 농도인 SC50은 각각 0.
- 인진쑥, 녹차 추출물의 음수 급여에 따른 맹장 미생물 균총의 변화를 조사한 결과(Table 8), 녹차 추출물 처리구(CS)에서 Salmonella 수가 무항생제 대조구(NC)에 비해 유의하게 감소하였으며 인진쑥 처리구(AC)는 감소하는 경향을 나타내었다(p<0.05).
- 80%였다. 조섬유 함량은 21.45 및 48.04%로 다른 성분 중 가장 높았으며, 조회분 함량은 6.31 및 5.57%로 나타났다. 녹차의 경우 조단백질 함량이 매우 높게 나타났는데 이는 녹차에 다량 함유되어 있는 광합성 효소, 산화 효소 등의 다양한 효소 때문인 것으로 알려져 있다.
- 종료체중 및 증체량은 이들 추출물 처리구(AC, CS)에서 항생제 무첨가구(NC)에 비해 유의하게 증가하였으며(p<0.05), 그러나 항생제 첨가구(PC)에는 미치지 못 하였다.
- 추출물 및 농도에 따른 다소 차이는 있었으나 인진쑥 및 녹차 추출물 모두 2.50 µL 이상에서 닭의 splenocyte 증식을 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, 2.5 및 5.0 µL에서는 면역증강물질로 알려진 Echinacea 및 con A 보다 우수한 세포 증식도를 보였다.
- 항생제 첨가구(PC)의 소장 중량 및 길이가 유의하게 감소하였으며 인진쑥 추출물 첨가구(AC) 역시 항생제 무첨가구(NC)에 비해 다소 감소하는 경향을 보였다(p<0.05).
- 혈액 생화학 조성에 있어서는 인진쑥, 녹차 추출물 처리시 총콜레스테롤, 간 및 신장의 이상 측정 지표인 AST 및 ALT가 대조구에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05).
- 혈액 콜레스테롤 및 AST는 인진쑥 및 녹차 추출물 첨가 급여시 대조구(NC,PC)에 비해 유의하게 감소하였으며, ALT 는 녹차 추출물 처리구에서만 유의하게 감소하였다(p<0.05).
후속연구
- Akpapunam와 SefaDedeh(1997) 및 Seena 등(2005)은 적절한 열처리는 식물체 내 존재하는 lectin, tannin, alkaloid 등의 항영양인자를 불활성화시키고 독성을 감소시킬 수 있다고 하였는데, 본 시험에서 사용한 인진쑥, 녹차 추출물은 90℃에서 4시간 중탕가열하여 추출한 것으로 추출과정 중의 열처리를 통해 항영양인자를 불활성화시키고 독성을 감소시킨 것으로 사료된다. 본 시험 결과, 녹차 추출물은 항생제 무첨가구에 비해 소장 중량 및 길이가 유의하게 감소하였으며 이는 성장촉진용 항생제와 유사한 작용을 통해 기인한 것으로 판단되나, 추후 영양소 이용율, 융모 길이 및 장점막 두께 등의 직접적인 측정을 통해 보다 정확한 작용 기전을 확인할 필요가 있다고 사료된다.
- 본 시험 역시 인진쑥 추출물에 있어서는 3개 유해균에 대해 낮은 항균활성을 보였다. 본 시험에서 유해균에 대해 강한 항균 활성을 보인 녹차 추출물은 천연 항균제로서의 이용가능성을 확인할 수 있었으며, 가축에 적용시 장내 미생물 균총 안정화에 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.
- β-actin에 대한 상대적 비율로 IL-2 및 IL-6의 mRNA 발현량을 측정하는 RT-PCR로는 splenocyte 증가에 따른 IL-2 및 IL-6의 변화를 측정하기에는 어려움이 있었으며, 비장 세포 전체에서 IL-2 및 IL-6의 mRNA 발현량을 조사하였기 때문에 그 양이 매우 적었다. 추후 이와 관련된 실험을 수행할 때에는 비장 lymphocyte를 분리한 후 concanavalin A 및 phytohaemagglutinin과 같은 mitogen으로 세포 분열을 유도한 후 면역 관련 인자를 조사하거나, Salmonella, E. coli 등의 특정 질병 원인균을 이용한 시험을 통해 체내 면역 물질의 분비 양상을 살펴볼 필요가 있다고 사료된다.
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