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문제 정의
- 따라서 유기동물과 사람에게 감염원이 될 수 있는 질병에 대한 기초자료를 얻고자 2006년 3월부터 11월까지 광주지역 에 소재한 동물보호소에서 보호중인 개에 대해 공중보건학적으로 중요시되는 개 심장사상충과 개 브루셀라병 감염실태를 조사하였다.
제안 방법
- PCR 반응은 template DNA 1 ㎕, 각 10 pmol//z£ primer 1 ㎕, Prime Taq premix (GeNet Bio, Korea) 10 ㎕, 그리고 멸균증류수로 총 20 ㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 PCR thermocycler (MJ Research, PTC~200, USA)를 사용하여 94℃ 에서 2분간 수행한 후 94°C/30초, 60°C/ 30초 그리고 72°C/30초 간 3단계로 PCR을 32 cycles 수행하고, post-elongation을 72°C 에서 7분간 DNA 합 성을 하였다.
- PCR 반응은 template DNA 1 ㎕, 각 10 pmol//z£ primer 1 ㎕, Prime Taq premix (GeNet Bio, Korea) 10 ㎕, 그리고 멸균증류수로 총 20 ㎕로 조정하였다. PCR 반응조건은 PCR thermocycler (MJ Research, PTC~200, USA)를 사용하여 94℃ 에서 2분간 수행한 후 94°C/30초, 60°C/ 30초 그리고 72°C/30초 간 3단계로 PCR을 32 cycles 수행하고, post-elongation을 72°C 에서 7분간 DNA 합 성을 하였다.
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Brucella canis 혈청학적 검사
검사대상 153마리의 유기견 중 무작위로 선정된 100마리의 혈액 중에 존재하는 B canis 항체를 확인하고자 면역 크로마토그래피 원리를 이용한 Anigen Rapid C. Brucella Ab test kit (Anigen, Korea)를 사용하였으며, 제조회사의 검사방법에 따라 전혈 1방울을 떨어뜨린 후 검체 희석액 4-5방울을 떨어뜨리고 10-25분 후 결과를 판독하였으며, 대조혈청은 제조사의 제품을 사용하였다.
- 혈액 1 mC 을 2% formalin 용액 9 m2에 넣고 잘 혼합하여 적혈구를 충분히 용혈시킨 후 원심분리 (2,000 rpm, 5 min)를 시킨 다음 상층 액을 제거하였다. 남아 있는 침전물에 동량의 1% methylene blue를 첨가하여 잘 혼합한 후 현미경으로 검사하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 20〜80 mM Trisacetate-EDTA (TAE) 완충용액과 DNA 염 색을 위한 ethidium bromide (0.5 /zg/mC)가 함유된 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 최종산물을 UV transilluminator와 AlphaEase™ 5.5 software (Alpha Innotech Co, CA, USA)> 이용하여 분석하였다.
- 필라리아자충이 확인된 개체와 유기견에 혈액 상을 관찰하기 위하여 동물전용 자동 혈 액 분석 기인 HEMAVET® 950 (Drew, USA) 혈구계산기를 사용하여 백혈구 (WBC), 호중구 (neutrophils), 림프구 (lymphocytes), 단핵구 (monocytes), 호산구 (eosinophils), 적혈구 (RBC), 혈색소량 (Hb), 혈소판 (PLT), 평균 적혈구 용적 (MCV), 평균 적혈구 혈색소량 (MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도 (MCHC)를 검사하였다.
- 혈액 1 mC는 modified Knott's test를 실시하고자 2% formalin 9 mC와 혼합하였고, 나머지 혈액은 브루셀라검사 그리고 일반혈액 성상검사를 실시하기 위해 검사하기 전까지 냉장보관하였다.
대상 데이터
- 2006년 3월부터 11월까지 광주광역시 동물보호소에서 보호하고 있는 유기견 153마 리 (수캐 73마리, 암캐 80마리)를 대상으로 필라리아자충 검사법을 이용하여 개 심장사 상충증의 감염실태를 분석한 결과, Fig 1과 같은 필라리아 자충이 19마리 (12.4%)의 유 기견 혈액 내에서 검출되었다 (Table 2). D immitis의 필라리아자충 검사와 항원검사법 을 이용한 개 심장사상충의 감염률은 이 등 긔)이 전국을 대상으로 독일 세퍼드종에 대 해 조사한 결과 13.
- 2006년 3월부터 2006년 11월까지 광주지역에 소재한 동물보호소에서 보호중인 유기견들 중 건강검진 때 153마리를 무작위로 선정하여 혈액을 채취하였다. 혈액채취는 대상견의 경정맥 (jugular vein) 및 요골쪽 피부 정맥 (cephalic vein)에서 3 을 채혈하여 EDTA 용기에 담고 실험전까지 냉장 보관하였다.
이론/모형
- 말초혈액에서 필라리아자충을 확인하고자 modified Knott's test를 이용하였다20). 혈액 1 mC 을 2% formalin 용액 9 m2에 넣고 잘 혼합하여 적혈구를 충분히 용혈시킨 후 원심분리 (2,000 rpm, 5 min)를 시킨 다음 상층 액을 제거하였다.
- 상층 액 에 phenol: chlorform (1 : 1) 500 ㎕를 혼합하여 12, 000 rpm에서 3분 정도 원심분리하여 단백질을 제거한 후 상층액을 isopropanol 600 ㎕ 와 혼합하여 12,000 rpm에서 5분 정도 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 추출된 DNA는 70% ethanol으로 2회 세척 후 건조하여 멸균 3차 증류수에 적당량 용해하여 PCR 법에 이용하였다(1)
- 추출된 genomic DNA부터 D immitis의 ITS2 유전자 일부를 증폭시키고자 Mar 등 U)의 방법에 따랐으며 Table 1과 같은 primer를 사용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 template DNA 1 ㎕, 각 10 pmol//z£ primer 1 ㎕, Prime Taq premix (GeNet Bio, Korea) 10 ㎕, 그리고 멸균증류수로 총 20 ㎕로 조정하였다.
- 필라리아자충에 감염된 유기견에 대한 Dimmitis의 감염을 확인하고자 Mar 등 11에 따라 genomic DNA를 다음과 같이 추출하였다. 심장사상충 양성 혈액으로부터 500 ㎕ 을 nucleic lysis solution (Promega1 , USA) 500 ㎕에 현탁시킨 후 proteinase K (10 mg/ ㎕) 10 ㎕를 첨가하여 65℃ 에서 30분정 도 반응시 켰다.
성능/효과
- 1. 유기견 153마리를 대상으로 필라리아 자충 검사에 의한 개 심장사상충 감염률은 12.4% (19/153마리)로 조사되었다.
- 2. Modified Knott's test로 관찰된 필라리아자충은 PCR법을 이용하여 유기견 19 마리 에서 D immitis로 확인되었다.
- 3. 개 심장사상충의 계절별 감염률은 다른 계절에 비해 봄철 감염률이 52.6%로 높은 경향을 보였다.
- 4. 개 심장사상충에 감염된 유기견에서 백혈구와 단핵구의 증가가 관찰되었다.
- 5. 153마리의 유기견 중 무작위로 선정된 개의 혈액 100건을 대상으로 면역 크로마토그래피 검사법을 이용하여 B canise 대한 항체검사결과는 모두 음성이었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 유기동물에 의한 시민들의 공중보건학적 피해를 사전에 예방하기 위해서는 동물보호소 내 유기견에 대해 질병감염실태를 지속적으로 조사할 수 있는 관리체계가 수립되어야 할 것으로 생각된다.
- 동물보호소 내 유기견들 중 필라리아자충에 감염된 개를 포함하여 무작위로 74마리를 선정하여 건강상태를 확인하기 위해 혈액 성상 검사를 한 결과 대부분의 유기견이 백혈구와 호중구 증가를 제외하고는 비교적 정상적인 혈액성상 수치를 나타내었다 (Table 4). 이런 결과는 동물보호소 내에서 유기견들에게 먹이공급, 위생적인 환경 그리고 정기적인 건강검진 등에 의해 안정된 환경이 조성되었기 때문으로 생각된다.
- 보고하였다. 따라서 성충 특이 항원검사법과 필라리아자충 검사법보다 다소 과정이 복잡하고 시간이 걸리기는 하지만 D immitis의 의한 심장사상충증과 다른 종과의 감별진단에는 민감성과 특이성이 뛰어난 PCR법이 유용할 것으로 판단된다.
- 중에 흔히 나타난다。본 조사 결과에서 겨울철에 대한 검사가 이루어지지 않았지만 봄철 （3-5월）에 심장사상충 감염률이 52.6%로 여름과 가을보다 높은 감염률을 보 였다 （Table 3）.
- 0%로 조사된 이후, 수도권, 충남 그리고 전주지역 등지에서 필라리아자충 검사법과 항원검사법을 이용한 감염률 조사가 지속적으로 이루어져 왔다 6-8, 13). 수도권 일대 지역에서 집단사육 축견에 대한 감염률은 항원검사법에 의해 50.3%로 조사되 었으며, 충남과 전주지역 에서 애완견과 번식견에 대한 감염률은 1429%로 나타났다.
- 필라리아자충 감염이 확인된 19마리 유기견의 혈액에 대해 민감성과 특이성이 높은 primer를 이용하여 PCR법을 실시한 결과302bp에서 D immMs의 특이적인 ITS2 유전자 산물를 19건 모두에서 확인할 수 있었다 (Fig 2). 이 등23)은 필라리아자충이 확인된 개체에 실제 성충이 감염되어 있으면서 혈액 내에 필라리아자충이 발견되지 않도록 은폐 감염을 부여한 후 PCR법으로 통해 D immitis의 항원 유전자를 검출하였다.
후속연구
- 따라서, 국내 소형견 번식장과 가정견에서 B amis의 분리 . 보고됨에 따라 동물보호 소내에서 분양 대기중인 유기견에 대해서도지속적으로 개 브루셀라병에 대한 혈청 학적검사와 균분리 등의 검사방법을 이용하여 시민들의 공중보건학적 위해요소를 사전에예방할 수 있는 관리체계가 마련되어져야 할 것으로 판단된다.
- 153마리의 유기견 중 무작위로 선정된 개의 혈액 100건을 대상으로 면역 크로마토그래피 검사법을 이용하여 B canise 대한 항체검사결과는 모두 음성이었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 유기동물에 의한 시민들의 공중보건학적 피해를 사전에 예방하기 위해서는 동물보호소 내 유기견에 대해 질병감염실태를 지속적으로 조사할 수 있는 관리체계가 수립되어야 할 것으로 생각된다.
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