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문제 정의
- 따라서, 이번 연구에서는 국내의 고추와 토마토 재배지에서 분리한 35개의 풋마름병균 계통들에 대해 유전적 다양성을 조사하여 보고한다.
제안 방법
- 16S rRNA 유전자는 universal primer인 fDl, rP2를 이용하여 William 등(1991)이 제시한 조건에 의해 증폭하였고, 증폭된 PCR 산물은 제한효소(TaqI, AfcA, Ddel, Alul, Haem, Hinfl, Sau3M, HapH, NcH, Cfr\3\, Xspl)를 이용하여 RFLP 분석을 실시하였다. rep-PCRe Louws 등(1994) 이 보고한 방법에 준하여 실시한 후, unweighted pairgroup method of arithmetic average (UPGMA) similarity index와 Applied-math의 BioNumerics 4.
- 세균을 TSBA 배지(BD211825)에서 48시간 배양 후 GN/GP-IF 용액에 현틱시켜 GN2 microplatefBIOLOG GN2 MicroPlate™)에 분주하였다. 24시간과 48시간 배양 후 색깔변화 여부를 육안으로 관찰하였다.
- PCR 반응은 Takara PCR thermal cycler MP(Takara, Japan) 를 이용하였으며, PCR 반응액은 2 μ/의 DNA, 2.5U Taq polymerase(Takara, Japan), 100 mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 각각의 dNTP 0.2 mM, primer 50pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25 W 로 조절하였다. PCRe 초기 변성화 반응(95℃, 5분), 30 회의 증폭반응(94℃, 30초; 64℃, 45초; 72℃, 1분), 최종확장반응(721, 10분) 조건으로 수행하였다.
- 2 mM, primer 50pmol을 넣고 멸균수로 최종 반응용액의 부피를 25 W 로 조절하였다. PCRe 초기 변성화 반응(95℃, 5분), 30 회의 증폭반응(94℃, 30초; 64℃, 45초; 72℃, 1분), 최종확장반응(721, 10분) 조건으로 수행하였다.
- 계통들을 분리 . 동정하였으며, 풋마름병균 계통들의 유전적 특성을 비교 분석하였다. 분리한 풋 마름 병균 계통들의 동정을 위해 생리 .
- 분리된 세균을 동정하기 위해 Schonfeld 등(2003) 이 보고한 종특이적 primer(Rsol-fliCF, Rsol-fliCR)를 이용하여 PCR을 실시한 후 증폭산물의 유무를 조사하였다.
- 풋마름병균 계통들을 분리하여 생리 . 생화학 실험, 병원성 실험, 유전학적 실험을 통해 유전적 다양성을 연구하였다. 생리 .
- 세균을 TSBA 배지(BD211825)에서 48시간 배양 후 GN/GP-IF 용액에 현틱시켜 GN2 microplatefBIOLOG GN2 MicroPlate™)에 분주하였다. 24시간과 48시간 배양 후 색깔변화 여부를 육안으로 관찰하였다.
- TTC 배지에서 48시간 배양한 세균을 멸 등(2001)의 방법에 따라 특성을 조사하였다. 세균을 동정하기 위해 그람염색, KB 배지에서의 형광유무, NBY 배지에서의 색소 형성 여부 등을 조사하였다.
- 이번 연구에서는 우리나라 여러 지역에서 재배되고 있는 풋마름증상이 관찰된 고추와 토마토로부터 35개의 풋 마름 병균 계통들을 분리 . 동정하였으며, 풋마름병균 계통들의 유전적 특성을 비교 분석하였다.
대상 데이터
- 실험에 이용된 균주들의 DNA는 InstaGene matrix(Bio-Rad)를 이용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 분리한 후 -2(rc에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리된 세균을 동정하기 위해 Schonfeld 등(2003) 이 보고한 종특이적 primer(Rsol-fliCF, Rsol-fliCR)를 이용하여 PCR을 실시한 후 증폭산물의 유무를 조사하였다.
이론/모형
- Biolog system을 이용한 탄수화물 이용도 조사는 Lee 등(2005)이 보고한 방법에 준하여 실시하였다. 세균을 TSBA 배지(BD211825)에서 48시간 배양 후 GN/GP-IF 용액에 현틱시켜 GN2 microplatefBIOLOG GN2 MicroPlate™)에 분주하였다.
- 61을 이용하여 계통도를 작성하였다. RAPD 분석은 Grover 등(2006)이 보고한 방법에 준하여 실시하였고, primer는 OPA09 (GGGTAACGCC)# 이용하였다.
- 검정. TTC 배지에서 48시간 배양한 세균을 멸 등(2001)의 방법에 따라 특성을 조사하였다. 세균을 동정하기 위해 그람염색, KB 배지에서의 형광유무, NBY 배지에서의 색소 형성 여부 등을 조사하였다.
- RFLP 분석을 실시하였다. rep-PCRe Louws 등(1994) 이 보고한 방법에 준하여 실시한 후, unweighted pairgroup method of arithmetic average (UPGMA) similarity index와 Applied-math의 BioNumerics 4.61을 이용하여 계통도를 작성하였다. RAPD 분석은 Grover 등(2006)이 보고한 방법에 준하여 실시하였고, primer는 OPA09 (GGGTAACGCC)# 이용하였다.
- 여러 지역과 기주에서 분리된 풋마름병균 계통들의 유전적 다양성을 검정하기 위해서 다양한 방법들(randomlyamplified polymorphic DNA, restriction fragment length polymorphism, repetitive sequence-based polymerase chain reaction)을 이용한.연구들이 진행되어져 왔다(Horita와 Tsuchiya, 2001; Thwaites 등, 1999).
성능/효과
- 분리 균은 고추와 토마토 유묘를 이용해 병원성이 확인되었다. Repetitive sequence-based PCR(rep-PCR) 결과를 토대로 계통도 분석을 한 결과 고추와 토마토 분리균은 6개의 group으로 나뉘었으며, 유전적 다양성은 높게 나타났다. 풋마름병균 계통들의 그룹간에는 지역별, 기주별 특이성은 관찰되지 않았다.
- 그러나, rep-PCR(BOX-와 ERIC-PCR) 산물을 전기영동 후(Fig. 2A, B) 계통도를 작성한 결과 35개의 분리균은 6개의 그룹을 형성하면서 유전적 다양성이 높게 나타났다(Fig. 2C). 그룹 1에는 35균주 중 21균주가 속하며 가장 많은 균주가 속하였고, 다음으로 그룹 3에 8균주가 속하였다.
- 또한, 이(1999)도 국내 풋 마름 병균은 biovar 3과 4의 존재가 많음을 보고하였다. 그러나, 이번 연구에서 분리균의 biovar를 결정하기 위해 Schaad 등(2001)이 기술한 방법과 Biolog system을 이용한 탄소원 이용도를 조사한 결과 풋마름병균 계통들 은 모두 biovar 4로 동정되었으며 (Table 3), 고추와 토마토 분리균간의 특이한 생리적 특성은 나타나지 않았다. 또한, 풋마름병균 계통들을 고추와 토마토 유묘에 병원성을 실험한 결과 병원성 정도의 차이는 있었으나, 35 균주 모두 고추와 토마토에 풋마름병징을 나타내었다.
- 그러나, 이번 연구에서 분리균의 biovar를 결정하기 위해 Schaad 등(2001)이 기술한 방법과 Biolog system을 이용한 탄소원 이용도를 조사한 결과 풋마름병균 계통들 은 모두 biovar 4로 동정되었으며 (Table 3), 고추와 토마토 분리균간의 특이한 생리적 특성은 나타나지 않았다. 또한, 풋마름병균 계통들을 고추와 토마토 유묘에 병원성을 실험한 결과 병원성 정도의 차이는 있었으나, 35 균주 모두 고추와 토마토에 풋마름병징을 나타내었다. 토마토의 경우 빠르면 접종 5일 후부터, 고추에서는 접종 3주 후부터 병원성이 확인되었으며, 고추에서 분리한 20, 토마토에서 분리한 R22 균주가 가장 강한 병원성을 나타내었다.
- 고추와 토마토 분리균은 생리 . 생화학 성질과 병원성 면에서 서로 상이한 점을 관찰할 수 없었는데, 11개의 제한효소를 이용한 16S rRNA 유전자의 RFLP 분석에서도 모두 같은 RFLP pattern을 나타내어(결과 미제시), 균주간 16S rRNA 유전자 상동성도 매우 높게 나타났다.
- 위의 생리 . 생화학 실험과 유전적 실험 결과에 따라 고추와 토마토에서 분리한 35개의 균주를 풋 마름 병균(Ralstonia solanaceartw)으로 동정하였다.
- 생리 . 생화학 실험과 종특이적 polymerase chain reaction(PCR)을 실시한 결과 풋마름병균 계통들은 모두 Ralstonia solanacerum biovar 4로 동정되었다. 분리 균은 고추와 토마토 유묘를 이용해 병원성이 확인되었다.
- 분리한 풋 마름 병균 계통들의 동정을 위해 생리 . 생화학 실험을 실시한 결과 그람염색 음성, 형광색소 발현 음성, urease 양성 등 Schaad 등(2001)이 기술한 풋마름병균의 특성과 일치하였다(Table 2). 또한, Schonfeld 등(2003)이 보고한 종특이적primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과 분리한 35 균주에서만 400 bp의 풋마름병균 특이적 band가 관찰되었으며, 다른 속의 식물병원세균에서는 band가 증폭되지 않았다 (Fig.
- 3). 이번 연구에서의 경우 국내에 분포하는 풋마름병균 계통들의 유전적 다양성 분석에 있어서는 rep-PCR이 16S rRNA 유전자의 RFLP 분석보다 적합하였다. 국내에 분포하는 풋 마름 병균의 유전적 다양성은 아마도 풋마름병균의 발생지역과 기주범위가 광범위하며, 유전적 진화속도가 빠르기 때문이라고 생각된다.
후속연구
- 이런 다양성으로 말미암아 풋마름병균의 진단방법이 제한되고 있는 실정이다. 그러나, 이번 rep-PCR을 이용한 연구에서는 35개의 풋 마름 병균 계통들에 공통으로 나타나는 band가 관찰되었으며 (Fig. 2), 이는 국내의 고추, 토마토에서 발생하는 풋 마름 병균의 진단법 개발에 이용할 수 있을 것이라 사료된다.
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