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문제 정의
- 본 연구는 지난 수년간 전남 소록도에서 관상용으로 관리되던 철쭉나무들이 고사되기 시작하였고, 고사된 철쭉나무에 다량의 지의류가 정착 번성하고 있다는 보고를 접하고, 철쭉나무의 고사와 지의류의 병원성에 대한 관계규명을 위하여 실시하게 되었다. 이를 위하여 지금까지 문헌에 보고된 식물병원성 가능 인자에 대하여 조사하기 위하여 지의류형성곰팡이 균사의 식물체 감염 여부, 공생조류에 의한 병원성 여부, 지의체 대사산물에 의한 식물체 피해 여부에 대하여 검증을 실시하였다.
- 지난 수년간 전남 소록도에서 관상용으로 관리되던 철쭉나무들이 고사되기 시작하였고, 고사된 철쭉나무에 다량의 지의류가 정착 번성하고 있다는 보고를 접하고, 철쭉나무의 고사와 지의류의 병원성에 대한 관계 규명을 위하여 본 조사를 실시하게 되었다. 이를 위하여 지금까지 문헌에 보고된 식물병원성 가능 인자에 대하여 조사하기 위하여 지의류형성곰팡이 균사의 식물체 감염 여부, 공생조류에 의한 병원성 여부, 지의체 대사산물에 의한 식물체 피해 여부에 대하여 검증을 실시하였다.
제안 방법
- 4% picric acid)을 2~3방울 처리하고 바로 식물 조직 내의 picroethanob을 제외한 여분의 picroethanol-g- 제거하고 clove oil을 10분 동안 2~3 번 교환하여 처리하였다. xylene으로 clove oil을 씻어내고 balsam oil을 처리한 후 광학현미경으로 조직을 관찰하였다.
- 지의체가 부착되어 고사된 철쭉나무 가지에서 살균 처리된 면도칼을 이용하여 표면에 부착된 지의체를 제거하고 고사된 철쭉가지를 이용하여 무균 조작으로 다양한 크기의 박면 시료를 제작한 다음, 2% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 1분간 침지시켜 표면 소독을 실시하고 60% 에탄올 용액에 30초간 살균한 후 멸균수로 3회 세척하고 filter paper를 이용하여 건조를 시켰다. 감자한천배지(PDA), 영양배지(NA) 와 지의류형성곰팡이 분리 및 배양용 배지인 malt-yeast extract(MY) 배지 (Yoshimura 등, 2002)에 각각 치 상한 후 2CTC에서 배양하면서 PDA와 NA 배지는 7일 후에, MY 배지는 8주 후에 관찰하여 병원성 미생물 출현 여부를 조사하였다.
- 1) 공시 표본은 한국 지의류연구센터 표본실에 보관되어 있다. 공생조류 분리는 채집 후 2일 안에 지의체 선단부 조직을 이용하여 실시하였으며, 상온에서 풍건한 지의체는 -2(TC 냉동고에 보관하였다가 지의류 대사물질 추출을 위하여 이용하였다. 지의류 동정은 일본지의도감(Yoshimura, 1974)의 분류기준에 의하여 형태적 동정을 실시하였다.
- 농축 잔재물에 10mZ 10% DMSO로 첨가하여 다시 용해시킨 후여과 회수한 용액을 최종 처리하여 추출액으로 이용하였다. 대사산물 농도에 따른 피해정도의 차이를 알아보기 위하여 최종 추출액을 1/5로 희석한 추출용액과 최종 추출액을 각각 철쭉 가지의 선단부에 수차례 도포하여 건조시킨 후에 201 온실에서 옮겨 30일간 재배하면서 발병 여부와 처리부위의 조직 관찰을 실시하였다.
- 공생조류 접종. 분리 배양된 공생조류를 Bold's basal medium(Ybshimura 등, 2002) 100 mZ에 접종하고 2주 동안 18℃에서 12시간씩 광처리를 하면서 llOrpm에서 진탕 배양한 후 3000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 조류 세포만을 회수한 후 IM NHQl buffer에 현탁시켜 공생조류 접종원(iWcells/m/)을 준비하였다. 온실에서 관리한 건전한 철쭉 가지에 3 cm 간격으로 약 0.
- 지의체를 약 1 cm 크기로 잘라낸 후 지의체 표면의 이물질과 부생균들을 제거하기 위하여 2시간동안 흐르는 물로 씻어내고 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액으로 1분 동안 표면 살균한 후 멸균수로 2회 세척하였다. 살균 처리된 지의체 조각을 막자사발에 넣고 3 m/ 멸균수를 첨가하여 잘게 부순 후에 지의체 조각을 180)im, 100 pirn 크기의 Nylon Net Filter 로 각각 여과하여 100)im filter에 남아있는 지의체 조각을 해부현미경 하에서 관찰하였다. 조류를 포함한 지의체 조각만을 선별하여 malt-yeast extract(MY)가 함유된 24 well plate의 배지위에 치상하여 18℃(2의 광상태에서 4주간 배양하였다.
- 분리 배양된 공생조류를 Bold's basal medium(Ybshimura 등, 2002) 100 mZ에 접종하고 2주 동안 18℃에서 12시간씩 광처리를 하면서 llOrpm에서 진탕 배양한 후 3000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 조류 세포만을 회수한 후 IM NHQl buffer에 현탁시켜 공생조류 접종원(iWcells/m/)을 준비하였다. 온실에서 관리한 건전한 철쭉 가지에 3 cm 간격으로 약 0.2 cm 깊이로 침 상처를 내고 멸균수로 흠뻑 적신 거즈를 한 겹으로 상처 부위를 덮고, 공생조류 접종원을 상처부위 위에 흘러내릴 정도로 중분히 접종한 후, 수분증발 방지를 위해 1% agar에 적신 거즈를 덮고, 충분한 수분이 유지될 수 있도록 비닐을 덮어 3일간 유지한 후 20, C 온실에서 옮겨 60일간 재배하면서 발병 여부와 상처접종부위의 조직 관찰을 실시하였다. 대조구는 IM NH4CI buffer만을 접종한 철쭉나무를 이용하였다.
- 위하여 실시하게 되었다. 이를 위하여 지금까지 문헌에 보고된 식물병원성 가능 인자에 대하여 조사하기 위하여 지의류형성곰팡이 균사의 식물체 감염 여부, 공생조류에 의한 병원성 여부, 지의체 대사산물에 의한 식물체 피해 여부에 대하여 검증을 실시하였다.
- 지의체가 생성, 분비하는 다양한 대사산물에 의한 식물체 피해 여부를 알아보기 위하여 지의체로부터 지의류 2차 대사산물을 추출하여 처리를 실시하였다. 이를 위하여 풍건된 지의 체 5 g에 200 ml acetone을 첨가하여 상온에서 24시 간 2회 진탕 추출하여 총 400m/의 acetone 추출액을 회수 여과한 후(Whatman No. 1), 감압장치를 이용하여 추출액을 농축시켜 농축 잔재물(320 mg)을 회수하였다. 농축 잔재물에 10mZ 10% DMSO로 첨가하여 다시 용해시킨 후여과 회수한 용액을 최종 처리하여 추출액으로 이용하였다.
- 지의체에서 공생조류 분리. 지의류 공생조류의 병원성 여부를 알아보기 위하여 공생조류의 인공접종을 실시하였다. 이를 위하여 우선 지의체로부터 지의류 공생조류 분리를 실시하였다(Yoshimura 등, 2002).
- 병원성 미생물 감염 여부 조사. 지의체가 부착되어 고사된 철쭉나무 가지에서 살균 처리된 면도칼을 이용하여 표면에 부착된 지의체를 제거하고 고사된 철쭉가지를 이용하여 무균 조작으로 다양한 크기의 박면 시료를 제작한 다음, 2% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 1분간 침지시켜 표면 소독을 실시하고 60% 에탄올 용액에 30초간 살균한 후 멸균수로 3회 세척하고 filter paper를 이용하여 건조를 시켰다. 감자한천배지(PDA), 영양배지(NA) 와 지의류형성곰팡이 분리 및 배양용 배지인 malt-yeast extract(MY) 배지 (Yoshimura 등, 2002)에 각각 치 상한 후 2CTC에서 배양하면서 PDA와 NA 배지는 7일 후에, MY 배지는 8주 후에 관찰하여 병원성 미생물 출현 여부를 조사하였다.
- 지의류형성곰팡이 균사의 식물체 내 침입 여부를 알아보기 위하여 고사조직의 분별염색을 실시하였다(Dhingra와 Sinclair, 1985). 지의체가 부착되어 자라는 철쭉 가지를 광학현미경으로 관찰하여 마이크로톰으로 조직관찰이 가능한 두께로 잘라서 1% safranin 용액을 1 분 동안 처리하고 증류수로 2~3번 세적한 후 picroaniline을 1분 동안 처리하고 증류수로 2~3번 세척한 후 다시 picroethanol(ethanol 0.4% picric acid)을 2~3방울 처리하고 바로 식물 조직 내의 picroethanob을 제외한 여분의 picroethanol-g- 제거하고 clove oil을 10분 동안 2~3 번 교환하여 처리하였다. xylene으로 clove oil을 씻어내고 balsam oil을 처리한 후 광학현미경으로 조직을 관찰하였다.
- 지의체에서 2차 대사산물 추출 및 처리. 지의체가 생성, 분비하는 다양한 대사산물에 의한 식물체 피해 여부를 알아보기 위하여 지의체로부터 지의류 2차 대사산물을 추출하여 처리를 실시하였다. 이를 위하여 풍건된 지의 체 5 g에 200 ml acetone을 첨가하여 상온에서 24시 간 2회 진탕 추출하여 총 400m/의 acetone 추출액을 회수 여과한 후(Whatman No.
대상 데이터
- 2 cm 깊이로 침 상처를 내고 멸균수로 흠뻑 적신 거즈를 한 겹으로 상처 부위를 덮고, 공생조류 접종원을 상처부위 위에 흘러내릴 정도로 중분히 접종한 후, 수분증발 방지를 위해 1% agar에 적신 거즈를 덮고, 충분한 수분이 유지될 수 있도록 비닐을 덮어 3일간 유지한 후 20, C 온실에서 옮겨 60일간 재배하면서 발병 여부와 상처접종부위의 조직 관찰을 실시하였다. 대조구는 IM NH4CI buffer만을 접종한 철쭉나무를 이용하였다.
- 지의류 채집 및 동정. 본 연구에 이용된 지의류는 2004 년 12월에 전라남도 소록도에서 고사된 철쭉나무 가지에서 채집하였으며 (Fig. 1) 공시 표본은 한국 지의류연구센터 표본실에 보관되어 있다. 공생조류 분리는 채집 후 2일 안에 지의체 선단부 조직을 이용하여 실시하였으며, 상온에서 풍건한 지의체는 -2(TC 냉동고에 보관하였다가 지의류 대사물질 추출을 위하여 이용하였다.
이론/모형
- 지의류 공생조류의 병원성 여부를 알아보기 위하여 공생조류의 인공접종을 실시하였다. 이를 위하여 우선 지의체로부터 지의류 공생조류 분리를 실시하였다(Yoshimura 등, 2002). 지의체를 약 1 cm 크기로 잘라낸 후 지의체 표면의 이물질과 부생균들을 제거하기 위하여 2시간동안 흐르는 물로 씻어내고 1% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액으로 1분 동안 표면 살균한 후 멸균수로 2회 세척하였다.
- 공생조류 분리는 채집 후 2일 안에 지의체 선단부 조직을 이용하여 실시하였으며, 상온에서 풍건한 지의체는 -2(TC 냉동고에 보관하였다가 지의류 대사물질 추출을 위하여 이용하였다. 지의류 동정은 일본지의도감(Yoshimura, 1974)의 분류기준에 의하여 형태적 동정을 실시하였다.
성능/효과
- 일반적으로 곰팡이 균사가 침입한 식물조직을 염색할 경우, 식물 목질부는 붉은색으로, 곰팡이 균사는 파란색으로 달리 염색된다. Fig. 2의 B에서 볼 수 있듯이 지의류가 부착된 식물체 표피 윗부분에 있는 지의류 수층(medulla) 의지의 류형 성곰팡이는 뚜렷하게 파란색으로 염색되었지만, 지의류의 하피층(갈색층) 밑에 있는 식물체 부위는 뚜렷하게 붉은색으로만 염색되었음을 알 수 있었다. 따라서 지의류가 부착된 식물체 부위에서 지의류형성곰팡이의 균사가 철쭉나무의 수피조직 안으로 직접 침입하지 않았음을 확인할 수 있었다.
- 지의류의 동정. 고사된 철쭉나무 가지에 밀착되어 자라는 지의류는 Dirinaria applanata로 동정되었다. 이 지의류는 주로 평지의 수목이나 바위에 착생하여 자라는 엽상체 지의류로 회녹색을 띄고 있으며, 기물에 매우 밀착되어 자라고, 지의체 표면에 가루모양의 분아(so redia)가 산재되어 있어 비교적 쉽게 구별이 가능한 종이다(Fig.
- 지의류 대사물질에 의한 식물조직의 피해를 알아보기 위하여 지의류 추출액을 처리한 결과에서도 뚜렷한 병징 발생 유도나 조직 피해가 관찰되지 않았다. 따라서 본 실험 결과로 지의체가 직접적으로 식물병을 일으키는 것으로 보기는 어렵다는 결론을 낼 수 있었으며 식물체 고사와 지의류의 번성간의 인과관계에 대한 고찰을 하였다.
- 2의 B에서 볼 수 있듯이 지의류가 부착된 식물체 표피 윗부분에 있는 지의류 수층(medulla) 의지의 류형 성곰팡이는 뚜렷하게 파란색으로 염색되었지만, 지의류의 하피층(갈색층) 밑에 있는 식물체 부위는 뚜렷하게 붉은색으로만 염색되었음을 알 수 있었다. 따라서 지의류가 부착된 식물체 부위에서 지의류형성곰팡이의 균사가 철쭉나무의 수피조직 안으로 직접 침입하지 않았음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구의 실험적인 결과로 지의체가 직접적으로 식물병을 일으키는 것으로 보기는 어렵다는 결론을 낼 수 있었다. 경험적으로 원인이 무엇이든지 간에 건강한 나무에 비하여 죽었거나 죽어가는 나무에 지의류가 더욱 왕성하게 정착하고 생장하는 것이 일반적으로 관찰되는 현상이며, 이는 아마도 지의류에 의한 직접 또는 간접적인 피해의 결과라기보다는 병든 나무나 고사한 나무에서 잎의 손실이 심해지고 결과적으로 채광에 더욱 유리하여 더 많은 광이 식물체 표면에 도달함으로서 지의류의 생장을 촉진시킨 결과로 해석하는 것이 더 합리적일 것 같다.
- 열대나 아열대의 다양한 관속식물 잎 표면에 부착하여 살고 있는 지의류들이 식물에 피해를 유발한다고 알려져 있지만, 이 경우에도 지의 류형 성곰팡이에 의한 피해라기보다는 공생조류인 CephaZetios와 Phycopeltis 속에 속하는 사상성 녹조류가 비공생 상태로 잎 표면에서 이상 증식하여 큐티클층이나 책상조직과 같은 그 이하의 세포층으로 침입하여 생장함으로서 식물체에 피해를 유발하여 식물병원성생물체로 간주되고 있다(Hawksworth, 1988b; Smith와 Hawksworth, 1975). 본 조사에서도 지의류가 번성하여 왕성하게 자라고 있는 식물체 조직을 살펴 본 결과, 식물 체내로의 지의류형성곰팡이 균사의 직접적인 침입을 확인할 수 없었으며, 지의류 공생조류를 상처 접종한 결과에서도 식물체 조직 내에 공생조류가 서식하고 있음에도 불구하고 뚜렷한 병징을 살펴 볼 수 없었다. D.
- 지의류 공생조류의 병원성 여부. 지의류 공생조류를 분리, 배양하여 상처 접종한 결과, 공생조류가 식물체 조직 내로 성공적으로 유입되어 생존하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 하지만 공생조류를 접종한 철쭉에서 2개월이 지난 후에도 식물병이라 진단할 수 있는 뚜렷한 외부 병징을 보이지 않았으며, 접종 부위의 조직에서도 정상 조직과 마찬가지로 뚜렷한 병적인 조직 변화가 관찰되지 않았다(Fig.
- 지의체 대사산물에 의한 식물체 피해 여부. 지의류 대사산물에 의한 식물체 피해 여부를 알아보기 위하여 지의체 추출액을 제조하여 처리한 결과, 처리농도에 상관없이 처리된 부위에서 1개월이 경과한 후에도 외관상으로 식물병이라고 진단할 수 있는 뚜렷한 병징이 나타나지 않았으며, 처리 조직을 관찰한 결과 대조구 식물체 조직과 별다른 차이를 보이지 않았다(Fig. 4A, B, C).
- 이를 위하여 지금까지 문헌에 보고된 식물병원성 가능 인자에 대하여 조사하기 위하여 지의류형성곰팡이 균사의 식물체 감염 여부, 공생조류에 의한 병원성 여부, 지의체 대사산물에 의한 식물체 피해 여부에 대하여 검증을 실시하였다. 지의류가 정착된 철쭉나무 가지를 절편하여 분별염색을 실시하여 조직을 관찰한 결과, 고사된 조직 내에 지의류 형성 곰팡이 균사의 직접적인 감염을 확인할 수 없었으며, 공생조류를 분리하여 인위적으로 접종한 결과, 공생조류가 식물체 조직 내에서 생존하고 있음에도 불구하고 뚜렷한 병 발생이나 병징이 나타나지 않았다. 지의류 대사물질에 의한 식물조직의 피해를 알아보기 위하여 지의류 추출액을 처리한 결과에서도 뚜렷한 병징 발생 유도나 조직 피해가 관찰되지 않았다.
후속연구
- 그러나 Hale(1983)의 가설처럼 철쭉나무의 줄기에 부착하여 지의류가 생장함에 따라 철쭉나무의 표피에 물리적 압박을 가하게 되고 왕성하게 생장을 거듭한 지의류가 철쭉나무의 상단부에 있는 잎까지 뒤덮어 버림으로써 철쭉나무는 줄기에서 2차 생장과 잎에서 광합성을 방해받아 고사하게 되었을 가능성도 배제할 수 없다. 따라서 본 연구에서 철쭉나무의 고사의 원인 규명을 위해 시도하였던 지의류의 생물학적, 화학적 요인의 관련성은 극히 낮을 것으로 판단되며, 정확한 인과관계 규명을 위해서는 앞으로 생태학적 및 생리학적 측면에서 지의류와 식물체의 상호작용에 대한 보다 심도 있는 연구가 필요할 것으로 여겨진다.
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