인동초를 이용하여 표고균사체를 접종, 배양하여 얻어진 인동초균사체 추출액의 간암세포, 유방암세포, 자궁경부암세포 그리고 고형암의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 3가지 암세포의 형태변화 및 증식 억제에 미치는 영향에서 간암세포와 유방암세포에서 암세포에 대한 특이적 형태변화가 관찰되었고, 특히 간암세포에서 인동초균사체 추출물이 인동초추출물보다 효과적인 것으로 나타났다. 인동초균사체를 간암세포에 3mg/mL로 처리했을 때 $85.60{\pm}4.66%$의 암세포 증식억제율을 나타내어 인동초를 처리한 것보다 암세포 증식 억제율이 61.10% 높았다. 유방암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 높은 암세포 증식억제율을 보였으며, 두 군간의 차이는 미미한 것으로 나타났다. 자궁경부암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 암세포 증식억제율이 미미한 것으로 나타났다. 고형암 억제효과에서는 대조군에 비해 인동초균사체 추출물에서 고형암이 61% 억제되었으며, 인동초균사체가 인동초추출물보다 고형암 억제효과가 30% 더 높은 것으로 나타났다. 히스타민 유리 억제효과를 측정한 결과 compound 48/80처리군에 비해 인동초추출물은 9.07%, 인동초균사체 추출물은 43.05%의 히스타민 분비 억제효과가 있는 것으로 나타났다.
인동초를 이용하여 표고균사체를 접종, 배양하여 얻어진 인동초균사체 추출액의 간암세포, 유방암세포, 자궁경부암세포 그리고 고형암의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 3가지 암세포의 형태변화 및 증식 억제에 미치는 영향에서 간암세포와 유방암세포에서 암세포에 대한 특이적 형태변화가 관찰되었고, 특히 간암세포에서 인동초균사체 추출물이 인동초추출물보다 효과적인 것으로 나타났다. 인동초균사체를 간암세포에 3mg/mL로 처리했을 때 $85.60{\pm}4.66%$의 암세포 증식억제율을 나타내어 인동초를 처리한 것보다 암세포 증식 억제율이 61.10% 높았다. 유방암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 높은 암세포 증식억제율을 보였으며, 두 군간의 차이는 미미한 것으로 나타났다. 자궁경부암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 암세포 증식억제율이 미미한 것으로 나타났다. 고형암 억제효과에서는 대조군에 비해 인동초균사체 추출물에서 고형암이 61% 억제되었으며, 인동초균사체가 인동초추출물보다 고형암 억제효과가 30% 더 높은 것으로 나타났다. 히스타민 유리 억제효과를 측정한 결과 compound 48/80처리군에 비해 인동초추출물은 9.07%, 인동초균사체 추출물은 43.05%의 히스타민 분비 억제효과가 있는 것으로 나타났다.
This study was conducted to investigate the effect of mycelia of Lentinus edoes mushroom-cultured Lonicera japonica Thunberg (LLJ) on proliferation of the cancer cell lines (Hep3B, MCF-7 and HeLa), sarcoma 180 (S-180) and antiallergy. In an anti-cancer test using Hep3B (hepatic cancer cell), MCF-7 (...
This study was conducted to investigate the effect of mycelia of Lentinus edoes mushroom-cultured Lonicera japonica Thunberg (LLJ) on proliferation of the cancer cell lines (Hep3B, MCF-7 and HeLa), sarcoma 180 (S-180) and antiallergy. In an anti-cancer test using Hep3B (hepatic cancer cell), MCF-7 (breast cancer cell) and HeLa (uterine cancer cell), LLJ extract showed higher antiproliferating effect than that of LJ (Lonicera japonica Thunberg) extract. In an anti-cancer testing using Hep3B cells, LLJ extract showed growth-inhibitory effect of $85.60{\pm}4.66%$ at 3mg/rnL. In an anti-cancer testing using MCF-7 cells, LLJ and LJ extracts showed high antiproliferating effect. LLJ showed the tumor suppressive effect in mice injected with S-180 cells. The growth-inhibitory rates against tumor cells were 61% for LLJ, 37% for LJ. LLJ inhibited histamine release from rat peritoneal mast cells activated by compound 48/80. These results suggest that Lentinus edodes mushroom-cultured herb has an antiproliferating effect against cancer cell lines (Hep3B, MCF-7 and HeLa) and S-180 tumor, and will be beneficial in the treatment of allergic reaction.
This study was conducted to investigate the effect of mycelia of Lentinus edoes mushroom-cultured Lonicera japonica Thunberg (LLJ) on proliferation of the cancer cell lines (Hep3B, MCF-7 and HeLa), sarcoma 180 (S-180) and antiallergy. In an anti-cancer test using Hep3B (hepatic cancer cell), MCF-7 (breast cancer cell) and HeLa (uterine cancer cell), LLJ extract showed higher antiproliferating effect than that of LJ (Lonicera japonica Thunberg) extract. In an anti-cancer testing using Hep3B cells, LLJ extract showed growth-inhibitory effect of $85.60{\pm}4.66%$ at 3mg/rnL. In an anti-cancer testing using MCF-7 cells, LLJ and LJ extracts showed high antiproliferating effect. LLJ showed the tumor suppressive effect in mice injected with S-180 cells. The growth-inhibitory rates against tumor cells were 61% for LLJ, 37% for LJ. LLJ inhibited histamine release from rat peritoneal mast cells activated by compound 48/80. These results suggest that Lentinus edodes mushroom-cultured herb has an antiproliferating effect against cancer cell lines (Hep3B, MCF-7 and HeLa) and S-180 tumor, and will be beneficial in the treatment of allergic reaction.
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문제 정의
본 연구에서는 기능성 식품소재를 개발하고 효용가치를극대화시킬 수 있는 방안으로 생약소재인 인동초를 이용한 한방균사체를 생산하여 항암, 알레르기 억제 관련 기능성을 검토 하였다.
제안 방법
1 mL씩 ICR 마우스의 복강 속에 접종하고 배양하면서 13일마다 계대 배양하였다. ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 멸균된 주사기로 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4xl07cells/mL7]- 되 게 하였다. 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 i」L(2 X IO*5 cells)씩 ICR 마우스 우측 서혜부에 피하 이식한 후, 10% 인동초, 인동초균사체 분말을 자유 급식하였다.
S-180 고형암 성장억제 실험은 Jo(20)의 방법을 변형하여 실시하였다. ICR 마우스는 항온항습시스템에서 1주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다.
60% 에탄올 추출물을 rotary vacuum evaporator로 60℃에서 감압농축한 후 동결건조하여 암세포 (Hep3B, MCF-7, HeLa) 증식억제 실험에 사용하였다. 그리고 복강 비만세포 내 히스타민 함량 관련실험에는 각 시료에 10배수를 가하고 98℃에서 1시간 추출한 후 여과(Advantec Japan, Yoyo Roshi Kaisha, Japan, 5C, 185 mm)하였다. 여과액을 65℃에서 감압농축한 후 ethanol을 첨가하여 1시 간 방치시키고, 3, 000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 하층을 얻어 증류수로 녹였으며, 다시 3, 000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층만 동결건조하여 시료로 사용하였다.
, USA) 에서 24시간 배양한 후 각 시료 추출물을 최종 농도가 1 mg/mL, 3 mg/mL, 5 mg/mL가 되도록 첨가하여 24시간 동안 다시 배양시 켰다. 배양된 세포는 위상차현미경 (NICON TMS, Japan) 100배율로 관찰하고, 0.4% trypan blue assay로 세포■ 증식 억제율을 계산하였다 (19).
수거한 세포는 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 PBS로 세척하여 tyrode buffer에 현탁하여 세포수를 측정하였다. 1 x 106개의 세포를 37℃에서 10분간 배양하고 시료를 첨가한 후 37℃ 에서 20분간 배양하였다.
ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 멸균된 주사기로 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4xl07cells/mL7]- 되 게 하였다. 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 i」L(2 X IO*5 cells)씩 ICR 마우스 우측 서혜부에 피하 이식한 후, 10% 인동초, 인동초균사체 분말을 자유 급식하였다. 종양세포 이식 29일째 되는 날 치사 시켜 생성된 고형암을 적출하고, 그 무게를 측정한 후 종양 성장저지 백분율(tumor growth inhibition ratio, I.
, USA)로 계대 배양하여 4℃에서 냉장보관하며 사용하였다. 인동초는 30분을 침지하고 10분 단위로 60분까지 자연탈수 시 키 면서 자동수분측정 기 (MB45, Precisa, Switzerland)로 수분을 측정하여 수분이 60% 될 때, 이것을 121℃에서 20분간 멸균하여 표고균사체를 접종하여 24℃에서 25일간 배양하면서 생육상태를 관찰하여 최적 상태의 인동초 균사체를 시료로 사용하였다(Fig. 1).
인동초를 이용하여 표고균사체를 접종, 배양하여 얻어진 인동초 균사 체 추출액의 간암세포, 유방암세 포, 자궁경 부암세포 그리고 고형암의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 3가지 암세포의 형태변화 및 증식 억제에 미치는 영향에서 간암 세포와 유방암세포에서 암세포에 대한 특이적 형태 변화가 관찰되었고, 특히 간암세포에서 인동초균사체 추출물이 인동초추출물보다 효과적인 것으로 나타났다.
이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 i」L(2 X IO*5 cells)씩 ICR 마우스 우측 서혜부에 피하 이식한 후, 10% 인동초, 인동초균사체 분말을 자유 급식하였다. 종양세포 이식 29일째 되는 날 치사 시켜 생성된 고형암을 적출하고, 그 무게를 측정한 후 종양 성장저지 백분율(tumor growth inhibition ratio, I.R.: %)을 계산하였다.
ICR 마우스는 항온항습시스템에서 1주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다. 즉 복수암에 걸려서 복부가 팽만한 마우스의 복강 속으로 일회용 1 mL 주사기로 찔러 노란색 복수액 1 mL를 채취한 후, 그 원액을 0.1 mL씩 ICR 마우스의 복강 속에 접종하고 배양하면서 13일마다 계대 배양하였다. ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 멸균된 주사기로 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4xl07cells/mL7]- 되 게 하였다.
흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민 유리에 미치는 인동초 및 인동초균사체의 영향을 알아보기 위해 compound 48/80과 인동초 및 인동초균사체의 추출물을 처리 후 히스타민 유리량을 측정하여 Fig. 8에 나타내었다. Compound 48/80은 고농도에서 비만세포로부터 약 90%의 히스타민을 유리시키는 것으로 알려져 있으며, 적당량의 compound 48/80은 아나팔락시스의 기전을 연구하기 위한 히스타민 유리 촉진제로서 가장 널리 사용되고 있다.
대상 데이터
ICR 마우스는 항온항습시스템에서 1주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다. 즉 복수암에 걸려서 복부가 팽만한 마우스의 복강 속으로 일회용 1 mL 주사기로 찔러 노란색 복수액 1 mL를 채취한 후, 그 원액을 0.
간암세포주는 10X antibicotic-antimycotic(Gibco, USA) 1%와 FBS< 10% 첨가한 DMEMOiigh glucose) 배지를 사용하여 배양하였고, 유방암세포주, 자궁경 부암세포주는 iox antibicotic-antimycotic(Gibco, USA) 1%와 FBS를 10% 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하여 계대배양하면서 실험에사용하였 다. 간암세 포주 및 자궁경 부암세 포주는 5X105 cells, 유방암세포주는 1x10° cells를 cell culture plate (NUNC, Denmark, 60 mm) 에 분주하고, 37℃, 5% CO2 incubator(3154, Forma Scientific Inc.
표고균사체는 한국 농용미 생물보존센터 (KACC)에서 분양받아 사용하였고, 인체 간암세포주인 Hep3B(KCLB 58064), 인체 유방암세포주 MCF-7(KCLB 30022), 인체 자궁경 부암세 포주인 HeLa(KCLB 10002), 생 쥐 복수암세 포인 sarcoma 180(KCLB 40066)은 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 실험동물은 6주령의 ICR 웅성 생쥐를 (주)대한바이오링크로부터 구입하였고, RPMI 1640 배지, DMEM배지 , FBS(fetal bovine serum)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다.
표고균사체는 한국 농용미 생물보존센터 (KACC)에서 분양받아 사용하였고, 인체 간암세포주인 Hep3B(KCLB 58064), 인체 유방암세포주 MCF-7(KCLB 30022), 인체 자궁경 부암세 포주인 HeLa(KCLB 10002), 생 쥐 복수암세 포인 sarcoma 180(KCLB 40066)은 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 실험동물은 6주령의 ICR 웅성 생쥐를 (주)대한바이오링크로부터 구입하였고, RPMI 1640 배지, DMEM배지 , FBS(fetal bovine serum)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
실험결과는 mean士SE로 나타내었고, 각 그룹간의 측정치에 대한 자료 분석은 SPSS 통계프로그램 (10.0 versionX 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성을 판정하였다.
성능/효과
형태적인 면에서 관찰한 결과 인동초 균사체를 처리한 것이 인동초를 처리한 것보다 간암 세포의 전체적인 수와 형태에 더 많은 영향을 준 것으로 나타났다. 각 시료의 유방암세포에 대하여 형태변화를 관찰한 결과는 Fig. 3에서 보는 것과 같이 인동초와 인동초균사체 추출물을 각각 1, 3, 5 mg/mL로" 처리했을 때, 두 군 모두 control과 비교하여 처리 농도와 비례하여 다각형의 정상세포의 수가 줄어드는 것을 관찰할 수가 있었다. 인동초와 인동초 균사체의 유방암세포에 대한 형태변화는 유사한 경향으로 나타났다.
1 mg/mL 농도에서는 인동초를 처리한 것과 인동초 균사체를 처리한 것의 암세포 증식억제율이 비슷한 것으로 나타났다. 3 mg/mL와 5 mg/ml丄로 처리하였을 때에는 인동초균사체를 처리한 것이 인동초를 처리한 것에서보다 암세포 증식억제율이 각각 61.10%, 61.71% 높은 것으로 나타났다. 유방암세포에 대한 증식억제율은 Fig.
41%로 나타나서 자궁경부암세 포에서 의 인동초 및 인동초균사체 의증식억제율은 전반적으로 미미함을 보였다. 3가지 암세포 주에 대한 암세포 증식억제율을 검토한 결과 간암세포 및 유방암세포에서 인동초균사체를 처리한 것이 높은 암세포 증식억제율을 보였으며, 특히 간암세포에서는 인동초를 처리한 것과 비교하였을 때에도 암세포 증식억제율이 높은 것으로 나타났다.
조사하였다. 3가지 암세포의 형태변화 및 증식 억제에 미치는 영향에서 간암 세포와 유방암세포에서 암세포에 대한 특이적 형태 변화가 관찰되었고, 특히 간암세포에서 인동초균사체 추출물이 인동초추출물보다 효과적인 것으로 나타났다. 인동초 균사체를 간암세포에 3 mg/mL로 처리 했을 때 85.
3 ng/mL의 히스타민이 유리되었다. Compound 48/80 처 리군에 비해 인동초추출물은 9.0%, 인동초 균사체 추출물은 43.0%의 히스타민 분비 억 제효과가 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 황기와 감초에 표고버섯 균사체를 배양하여 항암, 알레르기 억제에 관한 연구(31, 32) 의 결과와 유사한 것으로 나타났다.
2에서 보는 것과 같이 나타났다. Control군의 간암세포는 다각형의 형태로 군집을 형성하며 자랐고 인동초추출물을 3 mg/mL와 5 mg/mL로 처리 하였을 때 전체 세포수가 확연히 줄어드는 경향을 보였다. 인동초 균사체를 처리했을 때는 1 mg/mL로 처리한 것에서부터 전체 세포의 수가 줄어드는 경향을 나타내었다.
자궁경부암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 암세포 증식억제율이 미미한 것으로 나타났다. 고형암 억제효과에서는 대조군에 비해 인동초균사체 추출물에서 고형암이 61% 억제되었으며, 인동초균사체가 인동초추출물보다 고형 암 억제효과가 30% 더 높은 것으로 나타났다. 히스타민 유리 억제효과를 측정한 결과 compound 48/80 처 리군에 비해 인동초추출물은 9.
10% 높았다. 유방암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 높은 암세포 증식억제율을 보였으며, 두 군 간의 차이는 미미한 것으로 나타났다. 자궁경부암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 암세포 증식억제율이 미미한 것으로 나타났다.
3가지 암세포의 형태변화 및 증식 억제에 미치는 영향에서 간암 세포와 유방암세포에서 암세포에 대한 특이적 형태 변화가 관찰되었고, 특히 간암세포에서 인동초균사체 추출물이 인동초추출물보다 효과적인 것으로 나타났다. 인동초 균사체를 간암세포에 3 mg/mL로 처리 했을 때 85.60±4.66% 의 암세포 증식억제율을 나타내어 인동초를 처리한 것보다 암세포 증식억제율이 61.10% 높았다. 유방암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 높은 암세포 증식억제율을 보였으며, 두 군 간의 차이는 미미한 것으로 나타났다.
20 g으로 61%의 암괴무게가 감소하는 항암효과를 보였다. 인동초균사체군이 인동 초군에 비해 암괴 무게가 30%가 더 적은 것으로 나타나 인동초 균사체가 인동초보다 고형암 억제효과가 있는 것으로 나타났다.
인동초와 인동초균사체를 1 mg/mL로 처리하였을 때에는 control과 비교하였을 때 특이한 점이 관찰 되 지 않았으나, 3 mg/mL와 고농도인 5 mg/mL로 처리 했을 때에는 인동초균사체를 처리한 것이 인동초를 처리한 것에서보다 자궁경부암세포수가 확연히 줄어든 것을 관찰할 수 있었다. 인동초를 3 mg/mL, 5 mg/mL로 처리한 것에서는 뚜렷한 세포형태변화를 관찰할 수 없었고, 암세포의 전체적인 수에도 control과 비슷한 경향으로 나타났다.
25±391%로 나타났다. 인동초와 인동초 균사체를 처리한 것 모두 처리한 농도와 비례하여 암세포 증식억제율이 증가하는 경향을 보였으며 그 수치도 비슷한 것으로 나타났다. 자궁경부암세포에서 암세포 증식억제율(Fig.
4와 같다. 인동초와 인동초균사체를 1 mg/mL로 처리하였을 때에는 control과 비교하였을 때 특이한 점이 관찰 되 지 않았으나, 3 mg/mL와 고농도인 5 mg/mL로 처리 했을 때에는 인동초균사체를 처리한 것이 인동초를 처리한 것에서보다 자궁경부암세포수가 확연히 줄어든 것을 관찰할 수 있었다. 인동초를 3 mg/mL, 5 mg/mL로 처리한 것에서는 뚜렷한 세포형태변화를 관찰할 수 없었고, 암세포의 전체적인 수에도 control과 비슷한 경향으로 나타났다.
인동초와 인동초 균사체를 처리한 것 모두 처리한 농도와 비례하여 암세포 증식억제율이 증가하는 경향을 보였으며 그 수치도 비슷한 것으로 나타났다. 자궁경부암세포에서 암세포 증식억제율(Fig. T)은 인동초를 처리한 것에서는 0±0.20~0.91 ±0.50%로 나타나 암세포 증식억제율이 미미한 것으로 나타났다. 인동초 균사체를 처리한 것에서도 0.
유방암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 높은 암세포 증식억제율을 보였으며, 두 군 간의 차이는 미미한 것으로 나타났다. 자궁경부암세포에서는 인동초 및 인동초균사체를 처리한 것 모두 암세포 증식억제율이 미미한 것으로 나타났다. 고형암 억제효과에서는 대조군에 비해 인동초균사체 추출물에서 고형암이 61% 억제되었으며, 인동초균사체가 인동초추출물보다 고형 암 억제효과가 30% 더 높은 것으로 나타났다.
51%S. 처리농도와 비 례 하여 암세포 증식 억 제 율이 증가하는 것으로 나타났다. 1 mg/mL 농도에서는 인동초를 처리한 것과 인동초 균사체를 처리한 것의 암세포 증식억제율이 비슷한 것으로 나타났다.
3 mg/mL, 5 mg/mL로 처리 하였을 때 대부분의 세포들이 부유 세포의 형태인 둥근 형태이거나 말단 쪽의 돌기가 뻗어져 나온 형태를 관찰할 수가 있었다. 형태적인 면에서 관찰한 결과 인동초 균사체를 처리한 것이 인동초를 처리한 것보다 간암 세포의 전체적인 수와 형태에 더 많은 영향을 준 것으로 나타났다. 각 시료의 유방암세포에 대하여 형태변화를 관찰한 결과는 Fig.
고형암 억제효과에서는 대조군에 비해 인동초균사체 추출물에서 고형암이 61% 억제되었으며, 인동초균사체가 인동초추출물보다 고형 암 억제효과가 30% 더 높은 것으로 나타났다. 히스타민 유리 억제효과를 측정한 결과 compound 48/80 처 리군에 비해 인동초추출물은 9.07%, 인동초 균사체 추출물은 43.05%의 히스타민 분비 억 제효과가 있는 것으로 나타났다.
후속연구
S-180 세포에 대한 상황(23), 영지(24) 및 운지(25)의 항종양효과 관련연구와 담자균류의 균사체의 항암효과 및 면역 활성 증강효과에 관한 보고(26)가 표고균사체를 이용한 발효한 시료의 고형암 억제효과를 뒷받침할 수 있으며, in d拔>에서의 항암효과의 가능성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
이러한 결과는 인동초를 표고균사체로 발효하였을 때 인동초 자체의 성분이 변화가 생겼거나 표고균사체 자체의 항암 및 항 알레르기의 기능성이 부가되었을 가능이 있다고 생각되며, 차후 이에 관한 더 구체적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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