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문제 정의
- 이 밖에도 항균 작용, 항종양 작용, 혈중 cholesterol 저하 작용 (Shin et al 1994, Abe et al 1982, Pompei et al 1979, Nishino et al 1986)이 있는 것으로 보고되고 있다. 이에 본 연구에서는 항암 효과를 조사하여 이의 효용 가치를 극대화시킬 수. 있는 방안으로 기능성 식품 소재를 개발하고자, 생약 소재인 감초를 이용하여 한방 발효 균사체를 생산하여 한방 소재 균사체의 항암 관련 기능성을 검증하였다.
- 이에 본 연구에서는 항암 효과를 조사하여 이의 효용 가치를 극대화시킬 수. 있는 방안으로 기능성 식품 소재를 개발하고자, 생약 소재인 감초를 이용하여 한방 발효 균사체를 생산하여 한방 소재 균사체의 항암 관련 기능성을 검증하였다.
제안 방법
- HMC-1 (human mast cell) 을 sample 과 함께 6시간 배양한 다음, 세포를 모아 원심 분리하여 상층액을 제거하고, RNA =을 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA 1 座을 75 ℃ 에서 5분간 변성시 킨 후, dNTP(l mM), oligo(dT) 15(0.
- HMC-1 을 sample과 함께 배양한 다음 wa아ling 용액으로 세척한 후 tryphan blue 시 약을 이용하여 혈구 계산판으로 생세포수를 측정하였다. 먼저 비특이적인 염색을 막기 위해 세포 1乂106개를 anti-Fc rRH/Ⅲ-specific mAb(2.
- 1 mW ICR 마우스의 복강 속에 접종하고 배양하면서 13일마다 계대 배양하였다. ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 멸균된 주사기로 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4xl07cells/mL가 되게 하였다. 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 血(2xlO6 cells)씩 ICR 마우스 우측 서혜부에 피하 이식한 후, 10% 감초 및 감초 균사체 분말을 자유 급식하였다.
- S-180 고형암 성장 억제 실험은 Jo SG(1995)의 방법을 변형하여 실시하였다. ICR 마우스는 항온 항습 시스템에서 1 주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다.
- 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA 1 座을 75 ℃ 에서 5분간 변성시 킨 후, dNTP(l mM), oligo(dT) 15(0.5 써), AMV reverse transcriptase(20U), RNase inhibitor(0.5U), RT buffer, MgCl2(5 mM)와 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 血가 되도록 하여, 42 ℃ 에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하여 효소 중합 연쇄 반응에 사용하였다. 효소 중합 연쇄 반응은 합성된 cDNA 2 血를 주형으로 FceRI ⑦, tryptase, c-kit와 GAPDH의 sense primer와 antisense primer(15 pmol), Taq polymerase(0.
- USA)로 계대 배양하여 4’C에서 냉장 보관하며 사용하였다. 감초는 1시간을 침지하고 10분 단위로 60분까지 자연 탈수시키면서 자동 수분 측정기(7639-32967, Precisa, Switzer- land)로 수분을 측정하여 수분이 60% 될 때, 이것을 121℃에서 20분간 멸균하여 표고 균사체를 접종하여 24℃에서 25일간 배양하면서 생육 상태를 관찰하여 최적 상태의 감초 균사체를 시료로 사용하였다(Fig. 1).
- 감초를 이용하여 표고 균사체를 접종, 배양하여 얻어진 감초 균사체 추출액의 간암 세포(Hep3B), 유방암 세포(MCF-7), 자궁경부암세포(HeLa) 그리고 고형암(S-180)의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 3가지 암세포의 형태 변화 및 증식억제에 미치는 영향은 감초 균사체 추출물이 감초 추출물보다 효과적인 것으로 나타났으며, 간암세포와 유방암 세포에서 1 mg/ mL로 처리하였을 때 감초 균사체 추출물이 암세포 형태 변화가 더 뚜렷한 것으로 나타났다.
- 측정하였다. 먼저 비특이적인 염색을 막기 위해 세포 1乂106개를 anti-Fc rRH/Ⅲ-specific mAb(2.4G2)로 30분간 blocking한 다음 FITC- conjugated c-kit(CD117), PE-conjugated FceRI<7 로 30분간 냉암소에서 염색하였다. 다음 washing 용액으로 세척한 후 유세포 분석기(COULTER, Epics XL)로 분석하였다.
- Hep3B 및 HeLa 암세포주는 5x 105 cells, MCF-7 암세포주는 1><106 cells를 cell culture plate (NUNC, 60 mm)에 분주하고, 37℃, 5% CO2 incubator(3154 S/N 32504-1811, Forma Scientific Inc, USA)에서 24시간 배양한 후 각 시료 추출물을 최종 농도가 1 mg/mL, 3 mg/mL, 5 mg/mL 되도록 첨가하여 24시간 동안 다시 배양시켰다. 배양된 세포는 위상차현미경(NICON TMS, Japan) 100 배율로 관찰하고, 0.4 % trypan blue assay로 세포 증식 억제율을 계산하였다(Park et al 2005).
- ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 멸균된 주사기로 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4xl07cells/mL가 되게 하였다. 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 血(2xlO6 cells)씩 ICR 마우스 우측 서혜부에 피하 이식한 후, 10% 감초 및 감초 균사체 분말을 자유 급식하였다. 종양 세포 이식 29일째 되는 날 치사 시켜 생성된 고형암을 적출하고, 그 무게를 측정한 후 종양 성장저지 백분율(tumor growth inhibition ratio, I.
- 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 血(2xlO6 cells)씩 ICR 마우스 우측 서혜부에 피하 이식한 후, 10% 감초 및 감초 균사체 분말을 자유 급식하였다. 종양 세포 이식 29일째 되는 날 치사 시켜 생성된 고형암을 적출하고, 그 무게를 측정한 후 종양 성장저지 백분율(tumor growth inhibition ratio, I.R. : %)을 계산하였다.
- ICR 마우스는 항온 항습 시스템에서 1 주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다. 즉, 복수암에 걸려서 복부가 팽만한 마우스의 복강 속으로 일회용 1 mL 주사기로 찔러 노란색의 복수액 1 mL를 채취한 후, 그 원액을 0.1 mW ICR 마우스의 복강 속에 접종하고 배양하면서 13일마다 계대 배양하였다. ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 멸균된 주사기로 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4xl07cells/mL가 되게 하였다.
- 5U), polymerase buffer를 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 20 /心 되도록 하여 predenaturation: 95 ℃ 5분, denaturation; 95 ℃ 1분, annealing; 55 ℃ 1분, elongation; 72℃ 1분을 35cycle한 다음, postelongation을 72℃에서 5분 하는 조건으로 수행하였다(Table 1). 효소 중합 연쇄 반응의 pro- duct는 20 血씩 2% agarose gel에 loading하여 100 V에서 40 분간 전기 영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 관찰하였다.
대상 데이터
- 60% 에탄올 추출물을 rotary vacuum eva-poratorS. 60℃에서 감압 농축한 후 동결 건조하여 암세포 (Hep3B, HeLa, MCF-7) 증식 억제 실험에 사용하였다.
- 실시하였다. ICR 마우스는 항온 항습 시스템에서 1 주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다. 즉, 복수암에 걸려서 복부가 팽만한 마우스의 복강 속으로 일회용 1 mL 주사기로 찔러 노란색의 복수액 1 mL를 채취한 후, 그 원액을 0.
- 간암 세포주(Hep3B)는 10X antibicotic-antimycotic(Gibco, USA) 1 %와 FBS 10% 첨가한 DMEM(high glucose)배지를 사용하여 배양하였고, 유방암 세포주 (MCF-7), 자궁경부암 세포주(HeLa)는 10X antibicotic-antimycotic(Gibco, USA) 1 % 와 FBS 10% 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하여 계대배양 하면서 실험에 사용하였다. Hep3B 및 HeLa 암세포주는 5x 105 cells, MCF-7 암세포주는 1><106 cells를 cell culture plate (NUNC, 60 mm)에 분주하고, 37℃, 5% CO2 incubator(3154 S/N 32504-1811, Forma Scientific Inc, USA)에서 24시간 배양한 후 각 시료 추출물을 최종 농도가 1 mg/mL, 3 mg/mL, 5 mg/mL 되도록 첨가하여 24시간 동안 다시 배양시켰다.
- 감초는 대구광역시 약령 시장의 한약 도매상에서 구입하였다. 표고 균사체는 한국 농용미생물보존센터(KACC)에서 분양받아 사용하였고, 인체 간암세포주인 Hep3B(KCLB 58064), 인체 자궁경부암세포주인 HeLa(KCLB 10002), 인체 유방암 세포주 MCF-7(KCLB 30022), 생쥐 복수암세포인 sarcoma 180 (40066)은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다.
- 22 ;m pore size membrane filter(Corning, NY, USA)를 사용하여 멸균하였다. 세포 배양에 필요한 IMDM 배지와 FBS(fetal bovine serum)는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였고, 항생제 (antibiotic-anti- mycotic) 와 sodium bicarbonate(NaHCC)3), 2-ME(2-mercaptoe- thanol)는 Sigma(St. Louis, USA) 제품을 사용하였다.
- 표고 균사체는 한국 농용미생물보존센터(KACC)에서 분양받아 사용하였고, 인체 간암세포주인 Hep3B(KCLB 58064), 인체 자궁경부암세포주인 HeLa(KCLB 10002), 인체 유방암 세포주 MCF-7(KCLB 30022), 생쥐 복수암세포인 sarcoma 180 (40066)은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 실험 동물은 6주령의 ICR 웅성 생쥐를 (주)대한바이오링크로부터 구입하였고, RPMI 1640 배지, DMEM 배지, FBS(fe- tal bovine serum)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용한 HMC-l(human mast cell)은 37”C 습윤한 5% CO2 incubatoi.에서 Iscove’s Modified Dulbecco's medium 에 10% FBS를 첨가하여 배양하였다.
- 표고 균사체는 한국 농용미생물보존센터(KACC)에서 분양받아 사용하였고, 인체 간암세포주인 Hep3B(KCLB 58064), 인체 자궁경부암세포주인 HeLa(KCLB 10002), 인체 유방암 세포주 MCF-7(KCLB 30022), 생쥐 복수암세포인 sarcoma 180 (40066)은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 실험 동물은 6주령의 ICR 웅성 생쥐를 (주)대한바이오링크로부터 구입하였고, RPMI 1640 배지, DMEM 배지, FBS(fe- tal bovine serum)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±S.E.로 나타내었고, 각 그룹간의 측정치에 대한 자료 분석은 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 p< 0.05 수준에서 유의성을 판정하였다.
성능/효과
- 4와 같다. 감초 추출물을 농도별로 처리했을 때는 control과 비교하여 세포수와 세포 형태의 변화를 관찰할 수가 없었으나, 감초 균사체를 처리하였을 때는 1 mg/mL로 처리하였을 때부터 부유하는 세포의 형태가 많이 나타나기 시작하여 처리한 농도가 높아질수록 부유하는 세포가 더욱 많아졌으며, 5 mg/ "로 처리한 경우에는 정상적인 자궁경부암 세포를 거의 관찰할 수가 없었다.
- 영향을 조사하였다. 3가지 암세포의 형태 변화 및 증식억제에 미치는 영향은 감초 균사체 추출물이 감초 추출물보다 효과적인 것으로 나타났으며, 간암세포와 유방암 세포에서 1 mg/ mL로 처리하였을 때 감초 균사체 추출물이 암세포 형태 변화가 더 뚜렷한 것으로 나타났다. 그리고 자궁경부암 세포에서는 모든 처리 농도에서 감초 균사체가 감초 추출물로 처리하였을 때보다 더 효과적이었다.
- 특히 3 mg/mL 이상 처리했을 때 완전 사멸하여 강력한 항암 효과가 있었다. HeLa 세포주에서 암세포 증식 억제율은 감초가 4.62~7.16%, 감초 균사체는 28.67~97.73%로 나타났으며, 감초 균사체가 감초보다 1 mg/mL에서 24.05%, 3 mg/mL에서 86.99%, 5 mg/mL에서 90.57% 더 높게 나타났다(Fig. 7). 감초와 감초 균사체의 Hep3B, MCF-7, HeLa 세포주에 대한 암세포 증식 억제율을 비교해보면, 감초 균사체를 Hep3B 세포주에 1 mg/mL로 처리했을 때 78.
- Hep3B 세포주에서 암세포 증식 억제율은 감초가 33.26-52.77%, 감초 균사체는 78.81 ~100%로 나타났다(Fig. 5). 모든 농도에서 감초 균사체가 감초보다 증식 억제율이 높게 나타났으며, 1 mg/mL에서 47.
- 55% 더 높은 것으로 나타났다. MCF-7 세포주에서 암세포 증식 억제율은 감초가 31.17~46.61%, 감초 균사체는 48.61 ~100%로 나타났으며, 감초 균사체가 감초보다 1 mg/mL에서 17.44%, 3 mg/mL에서 64.85%, 5 mg/mL에서 53.39% 더 높게 나타났다(Fig. 6). 특히 3 mg/mL 이상 처리했을 때 완전 사멸하여 강력한 항암 효과가 있었다.
- 16 g이었다. Table 2에 나타난 바와 같이 시로 투여에 따른 고형암괴의 억제는 실험군에 따라 차이가 있어, 감초군은 암괴 무게가 1.3OW.93 아으로 대조군에 비해 37 %, 감초 균사체군은 0.92±0.18 으으로 56%의 암괴 무게가 감소하는 항암 효과를 보였다. 이러한 결과로 볼 때 감초 균사체를 식이한 군이 감초를 식이한 군보다 in vz'vo상의 항암 억제의 경향이 더 높다고 볼 수 있으며, S-180 세포에 대한 상황(Ta mura et al 1973), 영지(Hartwell JL 1971) 및 운지(Li et al 1990)의 항종양 효과에 대한 연구와 많은 담자균류의 균사체는 항암 효과 및 면역 활성 증강 효과가 있는 것으로 보고(Choi et al 1996)의 경향과 유사한 것으로 나타났다.
- 2와 같다. 각 세포는 다각형의 형태로 군집을 형성하며 자랐고 감초 추출물로 처리하였을 때, 1 mg/mL에서부터 다각형의 세포의 밀도가 감소하고 원형의 부유 세포가 나타났으며, 감초 추출물이 3 mg/mL, 5 mg/mL로 농도가 증가할수록 전체 간암 세포의 수가 확연히 줄어들고 사멸 세포 형태인 원형의 세포 수가 증가하였으며, 정상 형태의 간암 세포와 사멸 세포 모두 줄어든 것을 볼 수가 있었다. 3 mg/mL에서 부터는 세포 말단에 돌기들이 뻗어 나오고 원형화의 손실이 큰 것을 관찰할 수 있었다.
- 그리고 감초 균사체 추출물을 처리했을 때는 감초 추출물로 처리했을 때와 비교했을 때 비슷한 경향을 보였으며, 특히 1 mg/mL로 처리했을 때는 감초 추출물로 처리했을 때보다 다각형의 간암 세포의 밀도가 낮아진 것을 관찰할 수 있었다. 감초 균사체 추출물 3 mg/mL, 5 mg/mL로 처리했을 때는 사멸 세포 형태인 원형태의 세포수가 감초 추출물을 처리했을 때보다 증가한 것을 볼 수가 있었다. 이러한 결과는 인삼박으로 배양된 버섯 균사체 추출물이 암세포에 미치는 영향(Park et al 2005)의 연구와 버섯 균사체에 의한 암세포 성장 억제 효과(Kwon et al 2003)에 관한 연구에서 유사한 결과를 나타났다.
- 대조군과 비교하여 시료를 처리하여 발현 정도를 비교하였을 때(Table 3) GAPDH의 발현량은 대조군과 시료를 처리한 실험군에서 모두 비슷하게 나타났다. 감초 및 감초 균사체 추출물을 처리한 것이 알레르기를 유발하는 면역 글로불린 IgE가 부착하는 비만 세포의 FcsRI의 발현을 억제하였으며, 감초 균사체 추출물을 처리한 것이 비만 세포의 FceRI mRNA의 발현을 더 많이 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 c-kit의 mRNA 발현도 감초 균사체 추출물이 더 많이 억제하였다.
- 3과 같다. 감초 추출물을 1~5 mg/mL로 처리했을 때는 control과 비교하여 처리 농도와 비례하여 다각형의 정상 세포의 수가 줄어드는 것을 관찰할 수가 있었고, 감초 추출물을 각 농도별로 처리하였을 때에는 1 mg/mL로 처리하였을 때부터 정상 암세포의 수가 확연히 줄어들고 부유 세포의 수가 늘어나는 것을 관찰할 수가 있었다.
- 특히 유방암세포에서 감초 균사체 추출물 3 mg/mL로 처리하였을 때 강력한 암세포 증식 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 고형암 억제 효과에서도 대조군에 비해 감초 균사체 추출물이 56%의 고형암 억제 효과가 있었고, 감초 추출물보다 고형암 억제 효과가 19% 더 높았다. 비만 세포주(HMF-1)에서의 유전자 발현 및 세포표면 단백질 분석 결과 FceRI mRNA과 c-kit mRNA에서는 감초 균사체 추출물이 감초보다 발현을 더 많이 억제하였고, Trytase mRNA 발현에서는 감초가 감초 균사체보다 발현 억제율이 더 높은 것으로 관찰되었다.
- 감초 및 감초 균사체 추출물을 처리한 것이 알레르기를 유발하는 면역 글로불린 IgE가 부착하는 비만 세포의 FcsRI의 발현을 억제하였으며, 감초 균사체 추출물을 처리한 것이 비만 세포의 FceRI mRNA의 발현을 더 많이 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 c-kit의 mRNA 발현도 감초 균사체 추출물이 더 많이 억제하였다. 그러나 Tiytase mRNA 발현에서는 감초가 감초 균사체보다 발현 억제율이 더 높은 것으로 관찰되었다 (Fig- 9).
- 3 mg/mL에서 부터는 세포 말단에 돌기들이 뻗어 나오고 원형화의 손실이 큰 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 감초 균사체 추출물을 처리했을 때는 감초 추출물로 처리했을 때와 비교했을 때 비슷한 경향을 보였으며, 특히 1 mg/mL로 처리했을 때는 감초 추출물로 처리했을 때보다 다각형의 간암 세포의 밀도가 낮아진 것을 관찰할 수 있었다. 감초 균사체 추출물 3 mg/mL, 5 mg/mL로 처리했을 때는 사멸 세포 형태인 원형태의 세포수가 감초 추출물을 처리했을 때보다 증가한 것을 볼 수가 있었다.
- 3가지 암세포의 형태 변화 및 증식억제에 미치는 영향은 감초 균사체 추출물이 감초 추출물보다 효과적인 것으로 나타났으며, 간암세포와 유방암 세포에서 1 mg/ mL로 처리하였을 때 감초 균사체 추출물이 암세포 형태 변화가 더 뚜렷한 것으로 나타났다. 그리고 자궁경부암 세포에서는 모든 처리 농도에서 감초 균사체가 감초 추출물로 처리하였을 때보다 더 효과적이었다. 특히 유방암세포에서 감초 균사체 추출물 3 mg/mL로 처리하였을 때 강력한 암세포 증식 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 8과 같다. 대조군과 비교하여 시료를 처리하여 발현 정도를 비교하였을 때(Table 3) GAPDH의 발현량은 대조군과 시료를 처리한 실험군에서 모두 비슷하게 나타났다. 감초 및 감초 균사체 추출물을 처리한 것이 알레르기를 유발하는 면역 글로불린 IgE가 부착하는 비만 세포의 FcsRI의 발현을 억제하였으며, 감초 균사체 추출물을 처리한 것이 비만 세포의 FceRI mRNA의 발현을 더 많이 억제하는 것으로 나타났다.
- 5). 모든 농도에서 감초 균사체가 감초보다 증식 억제율이 높게 나타났으며, 1 mg/mL에서 47.23%, 3 mg/mL에서 51.03%, 5 mg/mL에서 45.55% 더 높은 것으로 나타났다. MCF-7 세포주에서 암세포 증식 억제율은 감초가 31.
- 고형암 억제 효과에서도 대조군에 비해 감초 균사체 추출물이 56%의 고형암 억제 효과가 있었고, 감초 추출물보다 고형암 억제 효과가 19% 더 높았다. 비만 세포주(HMF-1)에서의 유전자 발현 및 세포표면 단백질 분석 결과 FceRI mRNA과 c-kit mRNA에서는 감초 균사체 추출물이 감초보다 발현을 더 많이 억제하였고, Trytase mRNA 발현에서는 감초가 감초 균사체보다 발현 억제율이 더 높은 것으로 관찰되었다. 이상의 결과로 볼 때 감초에 균사체 배양 기법의 접목으로 기능의 상승 효과를 기대할 수 있겠다.
- 그리고 자궁경부암 세포에서는 모든 처리 농도에서 감초 균사체가 감초 추출물로 처리하였을 때보다 더 효과적이었다. 특히 유방암세포에서 감초 균사체 추출물 3 mg/mL로 처리하였을 때 강력한 암세포 증식 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. 고형암 억제 효과에서도 대조군에 비해 감초 균사체 추출물이 56%의 고형암 억제 효과가 있었고, 감초 추출물보다 고형암 억제 효과가 19% 더 높았다.
후속연구
- 비만 세포주(HMF-1)에서의 유전자 발현 및 세포표면 단백질 분석 결과 FceRI mRNA과 c-kit mRNA에서는 감초 균사체 추출물이 감초보다 발현을 더 많이 억제하였고, Trytase mRNA 발현에서는 감초가 감초 균사체보다 발현 억제율이 더 높은 것으로 관찰되었다. 이상의 결과로 볼 때 감초에 균사체 배양 기법의 접목으로 기능의 상승 효과를 기대할 수 있겠다.
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