초록 ▼

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
가. 액체배양최적화
본 연구에서는 동충하초(cordyceps militaris)의 액체배양에서 배양최적화를 위한 배지조성, pH, 교반속도, 통기량, DO, C/N ratio에 대해 검토하였고 이들을 종합하여 polysaccharide의 수율을 극대화 시킬수 있는 최적조건을 확립하였다. 이후 확립한 조건으로 회분배양을 통하여 액체배양하였다.
나. 분리정제
균체를 배양후 gel filtraion chromatography를 통하여 분획 및 분자량을 결정하고 자실체, 균사체 및 배양여

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
가. 액체배양최적화
본 연구에서는 동충하초(cordyceps militaris)의 액체배양에서 배양최적화를 위한 배지조성, pH, 교반속도, 통기량, DO, C/N ratio에 대해 검토하였고 이들을 종합하여 polysaccharide의 수율을 극대화 시킬수 있는 최적조건을 확립하였다. 이후 확립한 조건으로 회분배양을 통하여 액체배양하였다.
나. 분리정제
균체를 배양후 gel filtraion chromatography를 통하여 분획 및 분자량을 결정하고 자실체, 균사체 및 배양여액 유래의 조다당과 정제다당의 총 당함량, protein, hexosamine, uronic acid의 함량을 조사하였고, Fungi-Fluor Kit를 통해 polysaccharide의 아노머 배위를 확인함으로써 polysaccharide의 구조를 검토하였다.
다. 생/화학적 항산화 효능평가
다당체의 항산화효능을 평가하기위해 추출물의 DPPH소거능, 과산화수소소거능, 초과산화물 소거능을 확인하였고, 세포주를 이용해 항산화효과를 확인학 위해 인간섬유아세포(Human dermal fibroblast)를 이용하여 세포생존률을 확인하였다.
라. 세포사멸 저해 평가
효능물질의 안전성을 확인하기위해 cordyceps militaris의 세포독성정도를 MTT assay를 통해 확인하였다. 또한 세포증식 및 세포보호효과를 확인하기위해 drug로 H₂O₂를 사용하여 세포의 세포사멸저해효과를 MTT assay, ROS, FACs를 이용해서 확인하였다.
ROS의 경우 DCF-DA staining을 통해 확인하였고, FACs는 Annexin V-FITC와 Propidium iodide(PI)로 double staining하여 확인하였다.
마. In vitro 항노화 효능평가
Human dermal fibroblast(인간 섬유아세포)는 배양시 세포분화가 거듭될수록 노화현상이 진행된다. 세포노화의 정도는 senescence-associated beta-galactosidase(SA-β-gal)의 활성 정도에 의하여 측정되어진다. in vitro와 in vivo에서 SA-β-gal의 활성이 증가하게되면 핵 유전자에 blue coloration을 형성하게 되는데 이를 이용하여 세포노화의 biomarker로써 사용된다. 따라서, 세포노화를 확인하기 위해 순차적으로 passage를 늘려나간 섬유아세포의 세포 노화정도를 확인하기 위해 SA-β-gal의 활성을 측정하였다. 또한 Matrix metalloproteinases(MMP) 는 세포외기질(extracellular matrix)의 구성물들을 분해하는데 중요한 역할을 하는 효소 그룹을 말한다. MMP-1 은 native fibrillar Type-1 collagen을 분해하고, Gelatinase A (MMP-2)와 Gelatinase B (MMP-9)는 기저 막을 분해하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 게다가 산화적 스트레스는 MMP의 발현을 증가시킨다는 것이 보고되어져 있으므로 H₂O₂에 의해 유도된 MMP의 활성에서 다당체의 MMP 저해정도를 측정하여 anti-aging 효과를 비교 분석 하고, MMP활성에 따른 콜라겐 단백질파괴를 확인하기 위해 Collagen assay를 진행하였다.
바. 세포사멸 및 항노화작용 메커니즘 규명
H₂O₂가 산화적 스트레스를 통한 인간 섬유아세포의 세포자멸사를 유도한다는 것을 확인하였고 이러한 산화적 스트레스의 분자수준의 메커니즘을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. Western blot를 통해 Caspase를 경유하는 apoptotic pathway인 Caspase-3 와 Bcl-2 그리고 caspase를 경유하지 않는 AIF의 발현을 단백질 수준에서 측정하였다. 또한 관련 kinase들의 활성화 역시 Western blot을 통해 확인하였다.
사. In vivo 주름개선 효능평가
Hairless mice에서 피부 주름을 유발하기 위해 hairless mice의 등 피부에 12주동안 UV-B(1.0mW/㎠)를 조사시켰다 .cordyceps militaris(1%)와, 주름개선물질로 알려진 retinol을 처리하여 control군과 skin analyze를 통해 비교 분석하였다.
아. 물질전달체계 최적조건 확립
활성물질의 최적농도를 결정한 후 농도별 투과량, 잔류량 및 투과속도를 측정하여 물질전달률을 측정하였다. 이후 물질전달률을 향상시킬수 있는 물질전달체를 검토하였다. Tween20, Oleic acid, Lauryl alcohol, Lauric acid, Oleyl alcohol, Isopropyl myristate 이상 6가지의 carrier들을 비교 분석하였다. 여기서 얻어진 가장 효율이 높은 물질의 농도를 다르게하여 활성물질과의 가장 최적의 농도를 결정하였다.

Abstract ▼

Ⅲ. Contents and Scope of the study
A. Liquid Culture of cordyceps militaris
This study reviews that medium composition, pH, agitation speed, aeration, DO, C/N ratio were investigated for optimizing the liquid cultures of Cordyceps militaris. After mycelial culture was performed, it was fractio

Ⅲ. Contents and Scope of the study
A. Liquid Culture of cordyceps militaris
This study reviews that medium composition, pH, agitation speed, aeration, DO, C/N ratio were investigated for optimizing the liquid cultures of Cordyceps militaris. After mycelial culture was performed, it was fractionated with Gel filtration chromatography to determine the molecular weight and measure the contents for total polysaccharide contents, protein, hexosamine, and uronic acid from myceliums and culture filtrate. Also the structure of polysaccharide was investigated by measuring anomer coordination of polysaccharide.
B. Efficacy evaluation at In vitro/In vivo
The data showed that Cordyceps militaris possessed the ability of scavenging activity to DPPH, hydrogen peroxide, superoxide and determined the degree of cytotoxicity through MTT assay. H2O2 was used as a drug to determine apoptosis inhibitory efficiency with MTT assay, ROS, FACs. In these cases, ROS was shown by DCF-DA staining, FACs was also shown by double staining between Annexin V-FITC and propidium iodide(PI). In addition, this study was performed to measure the activity of SA-b-gal in order to prove cellular aging. From the activity of MMP induced H₂O₂, MMP inhibition of polysaccharide was measured to investigate anti-aging efficiency of sample, and apply the collagen assay to measure collagen protein destruction depending on activity of MMP. Western blot was performed to measure Caspase-3, Bcl-2, AIF in the protein level. Hairless mice were exposured to UV-B (1.0mW/cm2) for 12 weeks so that skin wrinkle was expressed on their back skin. And then, Cordyceps militaris (1%) and retinol known as anti-wrinkle substance were treated for skin analyze.
C. Establishment of a material delivery system
Permeability, concentration of residues and permeation rate were measured in order to investigate the substance transmissibility.
Hereafter, serveral substances improving material transmissibility such as Tween 20, oleic acid, lauryl alcohol, lauric acid, oleyl alcohol, isopropyl myristate were analyzed, respectively.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요 약 문 ... 3
• SUMMARY ... 10
• 목 차 ... 15
• 제1장 서 론 ... 16
• 제1절 연구개발의 필요성 ... 16
• 제2절 기대성과 ... 17
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 18
• 제1절 국내외 연구현황 ... 18
• 제2절 필요 연구 분야 ... 19
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 24
• 제1절 액체배양 최적화 및 배양조건 확립 ... 24
• 제2절 분리정제 및 성분분석 ... 30
• 제3절 생/화학적 항산화 효능평가 ... 35
• 제4절 세포사멸 저해평가 ... 37
• 제5절 In vitro항노화 효능평가 ... 45
• 제6절 세포사멸 및 항노화 작용 메커니즘 규명 ... 55
• 제7절 In vivo 주름개선 효능평가 ... 60
• 제8절 물질전달체계 최적조건 확립 ... 63
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 69
• 제1절 목표대비 달성도 ... 69
• 제2절 정량적 성과 ... 70
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 71
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 72
• 제7장 기타 중요 변동사항 ... 73
• 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 73
• 제9장 참고문헌 ... 74