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문제 정의
- 이에 따라 쌀 오염 미생물에 의해 생성되는 독소에 대한 연구(10)가 이루어져 왔으며, 쌀 변질의 원인균 군에 대한 분리 및 동정 에 관한 연구(11, 12), 쌀의 저장성 증진을 위한 감마선 조사에 관한 연구(13, 14) 등이 이루어 졌으나, 미곡 저장창고내의 미생물학적 오염도에 대한 연구와 각 오염균의 생육억제에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 미곡창고의미 생물학적 오염도를 조사하고 미곡창고내에 존재하는 주요 오염균들을 분리 동정한 후 이 오염균에 대한 상백피, 감초 꽈배기 모자반 및 감태 추출물의 항균효과를 연구하여 쌀의 저장 중 품질저하를 일으킬 수 있는 미생물에 대한 효과적인 억제 방안을 연구하였다.
제안 방법
- 이때 세균은 NAS, 효모는 YM, 곰팡이는 PDA 배지에서 분리하였다. NAS 배지에서 분리한 세균은 집락의 형태 관찰 및 Gram stain(15)을 행하여 균주의 특징을 조사한 후 동정하였고 효모는 현미경 하(X400)에서 효모 확인 후 동정하였으며 곰팡이는 현미경 관찰로 분류 동정하였다. 이때 세균과 효모의 동정은 미생물 동정 분류기를 사용하여 균체내의 지방산을 agilent gas chromatograph(Aliglent 6890 GC, Califonia, USA)로 자동 분석한 후 Sherlock system database profile과 상호 비교한 후 동정하였다.
- 곰팡이, 세균 및 효모를 분리 . 동정한 후 주요 오염균에 대한 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태의 항균효과를 조사하였다. 미곡창고 내의 환경과 나락에서 분리된 주된 오염 균은 Sphingomonas paucimobilis와 Bacillus cereus를 비롯한 여러 Bacillus 속 세균과 불완전균류, Aspergillus spp.
- 멸균 후 완전히 굳지 않은 MHA 배지에 해조류 추출물을 최종 농도가 배지량에 대한 추출물 건조 고형분 함량의 농도 (%)가 되도록 첨가하였다. 여기에 미곡창고에서 분리한 균 액을 약 IO"~IO*5 CFU 가량(16) 혼합하였다.
- 미곡창고 내의 미생물학적 오염도를 조사하기 위해 경남지역 3곳의 상온저장창고에서 나락, 먼지, 공기 중의 낙하 균을 채집한 후 이를 배양하고 오염균을 분리하였다(Table 1). 미곡 창고에 보관되어 있는 나락에서 분리한 미생물의 분포를 조사한 결과 세균은 총 26종이 분리되었으며, 분리된 세균의 83.
- 효모는 28℃ incubator에서 48시간, 곰팡이는 실온에서 3~5일간 배양하였다. 배양 후 현미경 상에서 균의 성장이 관찰 되 지 않은 평 판의 농도를 최소저 해농도(MUC)로 하였다.
- 이때 효모는 확산 후 28℃ incubator에서 48시간 배양하였으며, 곰팡이는 실온에서 3~5일간 배양하였다. 배양 후 형성된 clear zone의 크기로 항균력을 판별하였다.
- 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태를 분쇄하여 10배 (g/mL)의 ethanol을 가하여 실온에서 24시간 교반하며 추출하였다. 이를 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리(UNION 32R, Hanil Co.
- 쌀의 저장 중 미생물학적 요인에 의한 품질 저하를 억제하기 위해 미곡창고 내의 환경과 창고 내에 보관되어 있는 나락에서 곰팡이, 세균 및 효모를 분리 . 동정한 후 주요 오염균에 대한 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태의 항균효과를 조사하였다.
- 여기 에지 름이 6 mm인 paper disc를 고정 시 키 고 ethan이을 사용하여 50, 10, 1 mg/mL 농도로 희석한 천연추출물을 20 uL 흡수 시 켜 paper disc에 함유된 추출물 건조 고형 분 함량이 각각 1, 0.2, 0.02 mg이 되도록 하였다. 이를 실온에서 약 1시간가량 확산시 킨 후 37℃ incubator에서 배양하였다.
- NAS 배지에서 분리한 세균은 집락의 형태 관찰 및 Gram stain(15)을 행하여 균주의 특징을 조사한 후 동정하였고 효모는 현미경 하(X400)에서 효모 확인 후 동정하였으며 곰팡이는 현미경 관찰로 분류 동정하였다. 이때 세균과 효모의 동정은 미생물 동정 분류기를 사용하여 균체내의 지방산을 agilent gas chromatograph(Aliglent 6890 GC, Califonia, USA)로 자동 분석한 후 Sherlock system database profile과 상호 비교한 후 동정하였다. 이때 지방산 분석에 사용한 GC의 columne HP 19091B-102(25 mx200 mm x0.
대상 데이터
- 경남 3곳의 미곡창고에서 나락, 먼지, 낙하균을 채집하여 NAS(nutrient agar+1% starch), YM(yeast malt agar), PDA (potato dextrose agar) 배지에서 배양하였다. 이때 세균은 NAS, 효모는 YM, 곰팡이는 PDA 배지에서 분리하였다.
- 상백피 (Mart”? albalinne), 감초(Glycyorrhiza uralensis) 는 한의원에서 국내산을 구입하였으며, 꽈배기 모자반(&厂 gassum siliquastrum)과 감태 (Ec/donia azua)는 부산 연안에서 채취하여 담수로 깨끗이 씻은 후 실온에서 건조하였다. 이를 잘게 분쇄한 후 -70℃에서 동결 저장하며 사용하였다.
이론/모형
- 경남지역 3곳의 미곡창고에서 분리 된 주요 오염균에 대한 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태의 항균 및 항진균 활성을 paper disc 법으로 측정하였다. 주요 오염세균에 대해서는 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 그리고 갇태가 10 mg/mL 농도에서 모두 효과가 있는 것으로 나타났으며, 1 mg/mL 농도에서도 상백피, 감초, 꽈배기 모자반이 Sphingomonas paucimobilis를 제외한 모든 균주에 대해 항균효과를 가지는 것으로 나타났다(Table 2).
성능/효과
- 02%를 차지하는 우점종은 Sphingomonas paucimobilis, Bacillus cereus, Curtobacter flaccumfaciens, Bacillus spp., Bacillus sphaericus로 밝혀졌으며 대부분이 그람 음성균이었다. 이 중 Sphingomonas paucimobilis, Bacillus spp.
- 또한 이들 추출물은 그람 음성균에 비해 그람 양성균에 대한 생육 억제 효과가 더 뛰어나다고 하였는데(23), 본 실험에서도 분리 . 동정된 균주 중 그람 양성 균주인 Bacillus cereizs와 AS-2 에 대한 효과가 그람 음성 균주에 대한 효과보다 뛰어난 것으로 나타났다.
- 는 창고에 저장되어 있던 나락에서도 높은 빈도로 발견되어진 것으로 창고 내의 환경이 나락에도 영향을 미침을 알 수 있었다. 먼지에서 분리된 곰팡이의 86.36%를 차지 하는 우점종은 불완전균류 1종, Aspergillus nidulans와 Aspergillus oryzae로 밝혀 졌으며, 64.30%를 차지하는 우점종인 불완전균류(〃纽tercmycetes (B))는 나락에서 분리된 균종과 같은 것으로 창고내의 환경이 나락에도 영향을 미침을 알 수 있었다. 창고내의 낙하균으로는 세균 64종, 곰팡이 59종이 분리되었는데, 우점균주를 대상으로 동정을 실시한 결과 한 종만이 Sherlock system database pro- file과 matching되어 Sphingomonas paucimobilis 인 것으로 밝혀졌으며, 나머지 균들은 matching되지 않아 균의 형태와 그람 염 색 상으로 분리한 후 AS-number로 표기하였다.
- 미곡 창고에 보관되어 있는 나락에서 분리한 미생물의 분포를 조사한 결과 세균은 총 26종이 분리되었으며, 분리된 세균의 83.18%를 차지하는 우점균은 Sphingomonas paucimobilis, Arthrobacter atrocyaneus, Xanthomonas arboricola, Bacillus macerans, Bacillus spp.으로 밝혀 졌다.
- 미곡창고에서 분리된 주요 오염균에 대한 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태의 최소저 해농도(MIC)를 측정한 결과(Table 4) 감초는 0.01 ~0.005%의 농도에서 주요 오염균의 생육을 억제하였으며, 꽈배기 모자반과 감태는 0.075~ 0.1%의 농도에서 오염균의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 상백피는 0.
- 가분포하고 있어(8) 문제시 되고 있다. 본 실험의 연구 결과에 의하면 나락에서 분리된 주요 우점균주와 미곡창고내의 환경으로부터 분리된 주요 우점균주 중 일부가 일치하는 것으로 보아 쌀의 미생물학적 오염은 미곡창고의 환경에서 유래되었을 가능성이 있는 것으로 사료된다. 따라서 미곡 창고 내의 미생물 오염도를 줄이면 나락의 미생물학적 오염도를 낮추어 쌀의 품질 유지 및 미생물학적 안전성을 확보하는데 큰 도움이 될 것으로 생각된다.
- 의 효모인 것으로 나타났다. 분리된 균주에 대한 천연추출물의 항균력을 측정한 결과 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태 모두 미곡창고 오염균주에 대해 항균력 이 있는 것으로 나타났으며, 꽈배기 모자반, 상백피, 감초는 항진균 활성도 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 상백피의 항균력이 뛰어난 것으로 나타났는데, 0.
- 1%의 농도에서 오염균의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 상백피는 0.0025-0.0075% 농도에서 주요 오염균의 생육을 억제하여 가장 뛰어난 항균력을 가지는 것으로 밝혀졌다. 특히 나락에서 가장 높은 빈도로 분포하며, 창고 내 환경에서도 다수 분포하였던 Sphingomonas paucimobilis와 내열성 포자를 형성하여 취반과정 중에도 살아남아 인체 내에서 enterotoxin을 생산하는 Bacillus cereus의 생육을 각각 0.
- 으로 밝혀 졌다. 이 중 Sphing- omonas paucimobilis, Arthrobacter atrocyaneus 두 균주는 전체의 50% 이상을 차지하여 보관된 나락의 주요 오염균임을 알 수 있었다. 나락에서 분리된 곰팡이는 총 5종으로 많은 종이 분리되지는 않았으며, 분리된 5종 중 94.
- 이상의 결과를 보면 창고내의 나락과 환경으로부터 유래된 주요 세균은 Sphingomonas paucimobilis, Bacillus cer- eus를 비롯한 여러 Bacillus spp.인 것으로 밝혀졌으며, 주요 오염 곰팡이는 불완전균류, Aspergillus spp.
- paper disc 법으로 측정하였다. 주요 오염세균에 대해서는 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 그리고 갇태가 10 mg/mL 농도에서 모두 효과가 있는 것으로 나타났으며, 1 mg/mL 농도에서도 상백피, 감초, 꽈배기 모자반이 Sphingomonas paucimobilis를 제외한 모든 균주에 대해 항균효과를 가지는 것으로 나타났다(Table 2). 특히, 상백피와 감초가 뛰어난 효과를 보였는데, 이들은 10 mg/mL 농도에서 대부분의 오염균에 대해 1.
- 15%를 차지하는 우점균은 AS~1, AS~2, Sphingomonas paucimobilis, AS-3, AS-4, AS-5, AS-6인 것으로 나타났다. 창고 내 공기 중에 존재하는 곰팡이의 82.72%를 차지하는 우점종은 불완전균류 1종과 Aspergillus oryzae, Penicillium spp로 밝혀 졌으며, 이 중 가장 높은 비율을 보인 불완전균류와 Aspergillus oryzae는 각각 나락과 창고내의 먼지에서도 발견된 종으로 창고 내의 환경이 나락의 품질에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 창고내의 낙하균으로는 세균 64종, 곰팡이 59종이 분리되었는데, 우점균주를 대상으로 동정을 실시한 결과 한 종만이 Sherlock system database pro- file과 matching되어 Sphingomonas paucimobilis 인 것으로 밝혀졌으며, 나머지 균들은 matching되지 않아 균의 형태와 그람 염 색 상으로 분리한 후 AS-number로 표기하였다. 창고 내 공기 중에서 분리된 세균의 50.15%를 차지하는 우점균은 AS~1, AS~2, Sphingomonas paucimobilis, AS-3, AS-4, AS-5, AS-6인 것으로 나타났다. 창고 내 공기 중에 존재하는 곰팡이의 82.
- 30%를 차지하는 우점종인 불완전균류(〃纽tercmycetes (B))는 나락에서 분리된 균종과 같은 것으로 창고내의 환경이 나락에도 영향을 미침을 알 수 있었다. 창고내의 낙하균으로는 세균 64종, 곰팡이 59종이 분리되었는데, 우점균주를 대상으로 동정을 실시한 결과 한 종만이 Sherlock system database pro- file과 matching되어 Sphingomonas paucimobilis 인 것으로 밝혀졌으며, 나머지 균들은 matching되지 않아 균의 형태와 그람 염 색 상으로 분리한 후 AS-number로 표기하였다. 창고 내 공기 중에서 분리된 세균의 50.
- 0075% 농도에서 주요 오염균의 생육을 억제하여 가장 뛰어난 항균력을 가지는 것으로 밝혀졌다. 특히 나락에서 가장 높은 빈도로 분포하며, 창고 내 환경에서도 다수 분포하였던 Sphingomonas paucimobilis와 내열성 포자를 형성하여 취반과정 중에도 살아남아 인체 내에서 enterotoxin을 생산하는 Bacillus cereus의 생육을 각각 0.0075%및 0.0025%의 농도에서 효과적으로 억제하여 쌀의 미 생물학적 안전성을 확보하는데 효과적으로 사용할 수 있으리라 생각된다. 이러한 결과는 곡류 및 곡류의 저장시설에 훈증제로 사용하는 ethylene oxide를 쌀 분리 균주에 대해 처리한 경우 1.
- 분리된 균주에 대한 천연추출물의 항균력을 측정한 결과 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태 모두 미곡창고 오염균주에 대해 항균력 이 있는 것으로 나타났으며, 꽈배기 모자반, 상백피, 감초는 항진균 활성도 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 상백피의 항균력이 뛰어난 것으로 나타났는데, 0.0025-0.0075% 농도에서 주요 오염균의 생육을 억제하였으며, 내열성 포자를 형성하는 Bacillus cereus 의 생육을 0.0025% 농도에서 억제하였다. 이상의 결과를 볼 때 이들 천연추출물을 미곡창고 내에 처리하거나 나락에 직접 처리할 경우 쌀의 저장 중 미생물학적 안전성을 확보할 수 있을 것으로 생각된다.
- 주요 오염세균에 대해서는 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 그리고 갇태가 10 mg/mL 농도에서 모두 효과가 있는 것으로 나타났으며, 1 mg/mL 농도에서도 상백피, 감초, 꽈배기 모자반이 Sphingomonas paucimobilis를 제외한 모든 균주에 대해 항균효과를 가지는 것으로 나타났다(Table 2). 특히, 상백피와 감초가 뛰어난 효과를 보였는데, 이들은 10 mg/mL 농도에서 대부분의 오염균에 대해 1.5~3 mm 정도의 생육저해환을 형성하여 뛰어난 항균효과를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 상백피, 감초, 꽈배기 모자반 및 감태 ethanol 추출물이 식품부패 및 식중독에 관여하는 여러 미생물에 대해 뛰어난 항균 활성을 보였다는 연구결과와 유사하였다(20-22).
후속연구
- 본 실험의 연구 결과에 의하면 나락에서 분리된 주요 우점균주와 미곡창고내의 환경으로부터 분리된 주요 우점균주 중 일부가 일치하는 것으로 보아 쌀의 미생물학적 오염은 미곡창고의 환경에서 유래되었을 가능성이 있는 것으로 사료된다. 따라서 미곡 창고 내의 미생물 오염도를 줄이면 나락의 미생물학적 오염도를 낮추어 쌀의 품질 유지 및 미생물학적 안전성을 확보하는데 큰 도움이 될 것으로 생각된다.
- 1 ~1%임을 감안할 때(26), 이들 천연 추출물은 낮은 농도에서도 균의 생육을 효과적으로 억제하므로 미곡 창고 내의 환경이나 나락에 이들 추출물을 처리하면 균의 생육을 효과적으로 억제할 수 있으리라 생각된다. 또한 이들 추출물은 오랜 기 간 동안 약재나 식용으로 사용되어 오면서 그 안전성이 이미 입증되어 있기 때문에 미곡창고가 아닌 나락에 직접 처 리하여 오염균의 생육을 억제하는 방법으로도 사용 가능하리라 생각된다.
- 0025% 농도에서 억제하였다. 이상의 결과를 볼 때 이들 천연추출물을 미곡창고 내에 처리하거나 나락에 직접 처리할 경우 쌀의 저장 중 미생물학적 안전성을 확보할 수 있을 것으로 생각된다.
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