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문제 정의
- 본 연구에서는 황벽나무, 두충나무, 귀룽나무 추출물 등을 포함한 천연 추출물에서 항균력시험과 안전성 시험을 실시하여 천연추출물의 안전성과 살균능력을 확인 하였다. 항균력효과시험 결과 추출물은 Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans에 대한 우수한 항균활성을 보여주었다.
- 본 연구에서는 황벽나무, 두충나무, 녹차 및 귀룽나무 등을 포함하는 천연 추출물에 대해 항균력 시험 및 안전성 시험을 실시하여 천연 살충제 및 살균제로서의 활용가능성을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- B16 F10 mouse melanoma cell(한국세포주은행)을 1×104 cell/ml 씩 분주하여 24시간 배양 후 100~1,000 µg/ml의 농도로 희석한 추출물의 시료가 첨가된 새 배지로 교체하고 다시 24시간 동안 배양하였다.
- Antimicrobial effect of natural extract including Phellodendro namurense, Eucommia ulmides Oliv extracts. From top right to left, purified water, 10%, 30%, 50%, 70%, 100% extract, Penicillin or Itraconazole.
- 살균제, 살충제로서의 안전성을 알아보기 위하여 추출물을 사용하여 단회 경구투여 독성시험, 단회 흡입투여 독성시험, 반복 흡입 투여 독성시험과 안점막 자극시험을 실시하였다. Table 1의 결과를 보면 단회 경구투여 독성시험은 추출물 100%농도 2 mL/kg로 5마리의 Mouse에 경구투여 하였다. 실험 후 2주 동안 실험군 및 대조군을 관찰하였고 실험 2주 후에도 특별한 이상 증후 및 사망개체는 발생하지 않았으며 실험동물군의 평균무게도 2주 후 증류수를 투여한 대조군과 비교하였을 시 뚜렷한 차이가 없는 것으로 보아 특별한 독성은 관찰되지 않았다.
- 이 과정에서 유효 물질의 성분 파괴를 최소화하고 유효성분을 고농도로 획득하기 위해 역삼투 및 초음파 추출법이 사용되었다. 각각의 추출물을 황벽나무 추출물 25%, 녹차 추출물 30%, 귀룽나무 추출물 25% 올리브 리퀴드 5% 그외에 천연방부제를 포함한 각종 성분 15%를 섞어서 사용하였다.
- 살충제나 살균제는 주로 스프레이 형태로 만들어져서 사용되기 때문에 흡입독성에 대한 문제가 발생할 수 있으며 그에 대한 안전성시험으로 단회 흡입 및 반복 흡입독성 시험을 실시하였다. 단회 흡입투여 독성시험은 추출물의 농도 100%와 비투여대조군을 대상으로 실험하였으며 모든 Rat은 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다. 시험 당시 실험군, 대조군 동물들의 평균무게는 175 g 이었으며 각각 50 mL의 추출물을 4시간 동안 총 15 mL을 챔버 안에서 흡입투여 하였다.
- 살충제와 살균제의 경우 매우 자주 사용되기에 소재의 유효성에 앞서 안전성이 우선 검토되어야 한다. 동물실험 이전에 먼저 살아있는 세포를 이용하여 MTT assay를 진행하였으며 추출물이 동물세포를 사멸시키는 정도를 평가하는 시험이다. 100~1,000 µg/ml 범위의 농도에서 추출물에서 세포독성이 전혀 나타나지 않았다.
- 반복 흡입 투여 독성시험은 추출물의 농도 100%를 실험군 5마리와 증류수투여군 5마리를 대상으로 실험을 진행하였으며 Rat은 1주일간 실험 환경에 적응시켰다. 추출물 100% 농도와 증류수를 각각 하루 6시간 총 60일간 흡입투여 하였다.
- 추출물과 균을 9:1의 비율로 혼합하여 24시간 배양하였다. 배양된 추출물과 균 혼합물을 Staphylococcus aureus는 TSA (Tryptic Soy Agar)배지, Pseudomonas aeruginosa와 Escherichia coli는 NA (Nutrient Agar)배지, Candida albicans는 YMA (Yeast Malt Agar)배지에 1 mL씩 분주하고 37℃에서 24시간 동안 배양 후 향균력을 평가하였다.
- 살균제, 살충제로서의 안전성을 알아보기 위하여 추출물을 사용하여 단회 경구투여 독성시험, 단회 흡입투여 독성시험, 반복 흡입 투여 독성시험과 안점막 자극시험을 실시하였다. Table 1의 결과를 보면 단회 경구투여 독성시험은 추출물 100%농도 2 mL/kg로 5마리의 Mouse에 경구투여 하였다.
- 살균제나 살충제가 스프레이 형태로 제조되어 사용 시에 점막자극을 일으킬 수 있는데 그 중에 특히 안점막의 경우 스프레이 형태에 노출이 많이 되므로 토끼를 이용하여 안점막 시험을 진행하였다.
- 살충제나 살균제는 주로 스프레이 형태로 만들어져서 사용되기 때문에 흡입독성에 대한 문제가 발생할 수 있으며 그에 대한 안전성시험으로 단회 흡입 및 반복 흡입독성 시험을 실시하였다. 단회 흡입투여 독성시험은 추출물의 농도 100%와 비투여대조군을 대상으로 실험하였으며 모든 Rat은 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다.
- 수목추출물의 Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans에 대한 항균력 실험을 진행하였다. 위 실험에서 양성대조군으로 Penicillin과 Itraconazole을 음성대조군으로는 증류수가 사용되었다.
- 모든 Mouse는 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다. 시험 당시 실험군, 대조군 동물들의 평균 무게는 20 g 이었으며 100% 농도의 추출물 2 mL를 5마리의 실험군에 각각 경구 투여 하였다. 투여 후 일정량의 사료와 물을 섭취 시키고 14일간 몸무게 측정과 상태변화를 관찰하였다.
- 모든 Rat은 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다. 시험 당시 실험군, 대조군 동물들의 평균무게는 171 g 이었으며 50 mL의 100% 추출물, 증류수를 4시간 동안 흡입챔버를 통해 흡입투여 하였다. 흡입투여 후 일정량의 사료와 물을 섭취 시키고 14일간 몸무게 측정과 상태변화를 관찰하였다[10].
- 단회 흡입투여 독성시험은 추출물의 농도 100%와 비투여대조군을 대상으로 실험하였으며 모든 Rat은 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다. 시험 당시 실험군, 대조군 동물들의 평균무게는 175 g 이었으며 각각 50 mL의 추출물을 4시간 동안 총 15 mL을 챔버 안에서 흡입투여 하였다. 흡입투여 후 14일간 몸무게 측정은 Table 2를 통해 확인 할 수 있었고 상태변화를 관찰한 결과 대조군과 비교했을 때 큰 차이는 없었으며 특이사항 및 사망개체는 발생하지 않았다.
- 모든 Rat은 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다. 시험 시작 당시 Rat 들의 평균 무게는 165 g 이었으며 100% 추출물을 하루 6시간 30일 간 흡입투여 하였다. 자동분사기를 이용하여 15분마다 분사 되었으며 하루 총 분사량은 약 5~6 mL 이었다.
- 안전성시험은 단회 경구투여독성시험, 단회흡입투여 독성시험, 반복 흡입투여 독성시험 및 안점막 자극시험을 실시하였다. 4종의 동물시험은 식품의약품안전처 의약품등의 독성시험기준에 따라 시험되었다[2].
- 안점막 자극시험은 생후 9주령의 백색토끼를 3마리 구입하여 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다. 토끼의 왼쪽 눈에는 100% 추출물을 100 µL를 넣고 오른쪽 눈에는 식염수 100 µL를 넣은 후, 토끼 눈의 상태를 1, 24, 48, 72 시간 관찰 하였다.
- 여기에 EZ-Cytox(두젠바이오)를 각 well당 20 µl 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator (Sanyo, Japan)에서 배양 1시간 후 450 nm에서 ELISA reader (PowerWave XS2, BioTek, USA)로 흡광도를 측정하였다.
- 자동분사기를 이용하여 15분마다 분사 되었으며 하루 총 분사량은 약 5~6 mL 이었다. 일정량의 사료와 물을 섭취 하도록 하고 하루 6시간 흡입투여 후 매일 무게측정 및 상태변화를 관찰하였다[10].
- 추출물 100% 농도와 증류수를 각각 하루 6시간 총 60일간 흡입투여 하였다. 자동 분사기를 이용하여 15분마다 한번씩 분사가 이루어 졌으며 하루 총 분사량은 약 5~6 mL이었다. 매일 6시간 흡입 후 실험동물들의 무게를 측정하고 60일 동안 실험동물들의 행동 및 이상징후를 관찰한 결과는 Table 3과 Fig.
- 소재의 안전성시험으로 세포독성시험인 MTT assay를 사용하였다. 정량은 Mosmann 방법을 변형하여 측정하였다[8,9]. B16 F10 mouse melanoma cell(한국세포주은행)을 1×104 cell/ml 씩 분주하여 24시간 배양 후 100~1,000 µg/ml의 농도로 희석한 추출물의 시료가 첨가된 새 배지로 교체하고 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 반복 흡입 투여 독성시험은 추출물의 농도 100%를 실험군 5마리와 증류수투여군 5마리를 대상으로 실험을 진행하였으며 Rat은 1주일간 실험 환경에 적응시켰다. 추출물 100% 농도와 증류수를 각각 하루 6시간 총 60일간 흡입투여 하였다. 자동 분사기를 이용하여 15분마다 한번씩 분사가 이루어 졌으며 하루 총 분사량은 약 5~6 mL이었다.
- 추출물의 향균력을 확인하기 위해 피부에 상재하며 기회병원성을 일으키는 Staphylococcus aureus(포도상구균, 그람양성균), Pseudomonas aeruginosa(녹농균, 그람음성균), Escherichia coli(대장균, 그람음성균)의 세균과 Candida albicans(효모, 진균)에 대해 실험을 실시하였다. 향균력 시험은 추출물을 각각 10%, 30%, 50%, 70%, 100%의 농도로 증류수에 희석하여 실험을 진행하였으며 양성대조군으로는 Penicillin과 Itraconazole을 사용하였으며 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다.
- 토끼 3마리를 사육실에 옮기고, 11일간 실험환경에 적응시켰다. 토끼의 한쪽 눈에 추출물 100%를 100 µL를 넣고 반대쪽 눈에는 식염수(대조군) 100 µL를 넣은 후, 토끼 눈의 상태를 1, 24, 48, 72 시간 동안 관찰하면서 시료의 안점막 자극을 확인 하였으며 Fig.
- 토끼의 왼쪽 눈에는 100% 추출물을 100 µL를 넣고 오른쪽 눈에는 식염수 100 µL를 넣은 후, 토끼 눈의 상태를 1, 24, 48, 72 시간 관찰 하였다.
- 토끼의 한쪽 눈에 추출물 100%를 100 µL를 넣고 반대쪽 눈에는 식염수(대조군) 100 µL를 넣은 후, 토끼 눈의 상태를 1, 24, 48, 72 시간 동안 관찰하면서 시료의 안점막 자극을 확인 하였으며 Fig. 4에서 확인 할 수 있듯 안점막에서는 이상 징후를 확인 할 수 없었다.
- 시험 당시 실험군, 대조군 동물들의 평균 무게는 20 g 이었으며 100% 농도의 추출물 2 mL를 5마리의 실험군에 각각 경구 투여 하였다. 투여 후 일정량의 사료와 물을 섭취 시키고 14일간 몸무게 측정과 상태변화를 관찰하였다.
- 추출물의 향균력을 확인하기 위해 피부에 상재하며 기회병원성을 일으키는 Staphylococcus aureus(포도상구균, 그람양성균), Pseudomonas aeruginosa(녹농균, 그람음성균), Escherichia coli(대장균, 그람음성균)의 세균과 Candida albicans(효모, 진균)에 대해 실험을 실시하였다. 향균력 시험은 추출물을 각각 10%, 30%, 50%, 70%, 100%의 농도로 증류수에 희석하여 실험을 진행하였으며 양성대조군으로는 Penicillin과 Itraconazole을 사용하였으며 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다. 추출물과 균을 9:1의 비율로 혼합하여 24시간 배양하였다.
- 시험 당시 실험군, 대조군 동물들의 평균무게는 171 g 이었으며 50 mL의 100% 추출물, 증류수를 4시간 동안 흡입챔버를 통해 흡입투여 하였다. 흡입투여 후 일정량의 사료와 물을 섭취 시키고 14일간 몸무게 측정과 상태변화를 관찰하였다[10].
대상 데이터
- 4종의 동물시험은 식품의약품안전처 의약품등의 독성시험기준에 따라 시험되었다[2]. 단회 경구 투여 독성시험은 생후 6주령의 ICR Mouse를 10마리 구입하여 실험군 5마리, 대조군 5마리로 각각 분류하였다. 모든 Mouse는 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다.
- 단회투여 흡입 독성시험은 생후 5주령의 SD-Rat을 10마리 구입하여 100% 추출물 실험군 5마리, 대조군 5마리로 분류하였다. 모든 Rat은 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다.
- 반복투여 흡입투여독성 시험은 생후 5주령의 SD-Rat을 5마리 구입하여 100% 추출물 실험군 5마리, 대조군 5마리로 실험하였다. 모든 Rat은 실험 환경에 적응하도록 1주일간 적응시켰다.
- 본 연구에서 사용한 수목추출물은 바이오메틱스에 의해 제공되었으며 황벽나무, 두충나무, 녹차 및 귀룽나무 등의 껍질을 건조 후 분쇄, 열수추출 및 숙성을 과정을 거쳐서 제조되었다. 이 과정에서 유효 물질의 성분 파괴를 최소화하고 유효성분을 고농도로 획득하기 위해 역삼투 및 초음파 추출법이 사용되었다.
- 수목추출물의 Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans에 대한 항균력 실험을 진행하였다. 위 실험에서 양성대조군으로 Penicillin과 Itraconazole을 음성대조군으로는 증류수가 사용되었다. Staphylococcus aureus는 기회감염을 일으키는 주요 원인균으로 피부감염, 골관절염, 균혈증, 폐렴 등을 유발시킨다[11].
이론/모형
- 소재의 안전성시험으로 세포독성시험인 MTT assay를 사용하였다. 정량은 Mosmann 방법을 변형하여 측정하였다[8,9].
- 본 연구에서 사용한 수목추출물은 바이오메틱스에 의해 제공되었으며 황벽나무, 두충나무, 녹차 및 귀룽나무 등의 껍질을 건조 후 분쇄, 열수추출 및 숙성을 과정을 거쳐서 제조되었다. 이 과정에서 유효 물질의 성분 파괴를 최소화하고 유효성분을 고농도로 획득하기 위해 역삼투 및 초음파 추출법이 사용되었다. 각각의 추출물을 황벽나무 추출물 25%, 녹차 추출물 30%, 귀룽나무 추출물 25% 올리브 리퀴드 5% 그외에 천연방부제를 포함한 각종 성분 15%를 섞어서 사용하였다.
성능/효과
- 천연 추출물의 단회 경구투여 독성시험, 단회 흡입투여 독성시험, 반복 흡입 투여 독성시험 및 안점막 자극시험의 결과 독성은 관찰되지 않았다. 따라서 황벽나무, 두충나무, 귀룽나무 추출물 등을 포함한 천연 추출물은 뛰어난 항균 활성과 안전성을 확인 할 수 있었다.
- Pseudomonas aeruginosa의 경우 추출물 50% 이상의 농도에서 향균활성을 보였고, 원내감염의 주요 원인균으로서 폐감염, 요로감염, 혈액감염, 창상감염 등을 일으킨다[12]. 또한 흔히 알려진 대장균인 Escherichia coli와 구강, 식도, 생식기 및 각종 피부에 감염을 일으키는 Candida albicans에서도 70%이상의 추출물 농도에서 향균활성을 확인하였다.
- 자동 분사기를 이용하여 15분마다 한번씩 분사가 이루어 졌으며 하루 총 분사량은 약 5~6 mL이었다. 매일 6시간 흡입 후 실험동물들의 무게를 측정하고 60일 동안 실험동물들의 행동 및 이상징후를 관찰한 결과는 Table 3과 Fig. 3에 나타냈고 뚜렷한 이상 징후 및 사망개체는 발생하지 않은 것으로 보아 반복적으로 흡입 시에도 본 추출물은 안전성이 우수하였다.
- Table 1의 결과를 보면 단회 경구투여 독성시험은 추출물 100%농도 2 mL/kg로 5마리의 Mouse에 경구투여 하였다. 실험 후 2주 동안 실험군 및 대조군을 관찰하였고 실험 2주 후에도 특별한 이상 증후 및 사망개체는 발생하지 않았으며 실험동물군의 평균무게도 2주 후 증류수를 투여한 대조군과 비교하였을 시 뚜렷한 차이가 없는 것으로 보아 특별한 독성은 관찰되지 않았다.
- 4에서 확인 할 수 있듯 안점막에서는 이상 징후를 확인 할 수 없었다. 위의 결과로 보아 추출물이 안점막을 자극하지 않는 물질임을 확인할 수 있었다.
- 세포독성실험에서도 별다른 세포독성이 나타나지 않았다. 천연 추출물의 단회 경구투여 독성시험, 단회 흡입투여 독성시험, 반복 흡입 투여 독성시험 및 안점막 자극시험의 결과 독성은 관찰되지 않았다. 따라서 황벽나무, 두충나무, 귀룽나무 추출물 등을 포함한 천연 추출물은 뛰어난 항균 활성과 안전성을 확인 할 수 있었다.
- 본 연구에서는 황벽나무, 두충나무, 귀룽나무 추출물 등을 포함한 천연 추출물에서 항균력시험과 안전성 시험을 실시하여 천연추출물의 안전성과 살균능력을 확인 하였다. 항균력효과시험 결과 추출물은 Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans에 대한 우수한 항균활성을 보여주었다. 세포독성실험에서도 별다른 세포독성이 나타나지 않았다.
- 시험 당시 실험군, 대조군 동물들의 평균무게는 175 g 이었으며 각각 50 mL의 추출물을 4시간 동안 총 15 mL을 챔버 안에서 흡입투여 하였다. 흡입투여 후 14일간 몸무게 측정은 Table 2를 통해 확인 할 수 있었고 상태변화를 관찰한 결과 대조군과 비교했을 때 큰 차이는 없었으며 특이사항 및 사망개체는 발생하지 않았다.
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