돼지 난자의 체외 수정에 있어서 난구 세포의 존재가 정자 침투율 및 배 발육에 미치는 영향 Presence of Intact Cumulus Cells during In Vitro Fertilization Inhibits Sperm Penetration but Improves Blastocyst Formation In Vitro원문보기
본 연구는 체외 성숙된 난자와 동결 융해 정자를 이용한 돼지의 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 정자 침투율, 웅성전핵 형성률 그리고 후기배로의 체외 발육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epidermal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간 배양하여 체외 성숙을 유도하였다. 성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결 융해정액을 이용하여 5mM caffeine과 10mM calcium chloride를 함유한 mTBM배양액에서 8시간 체외 수정하였다. 체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵 형성률을 조사하였고(실험 $1{\sim}3$) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3). 실험 1에서는 정자 농도를 $7.5{\times}10^5/ml$로 조정하여 나화 난자와 난구 세포 부착난자에서 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 $5{\times}10^6/ml$의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 $7.5{\times}10^5/ml$의 정자 농도로 체외 수정한 후 후기배로의 발육률을 조사하였다. 실험 1의 결과 정자 침투율은 나화 난자에 비해 난구 세포 부착 난자에서 유의적으로 감소되었다(35.2% vs. 77.4%; p<0.01). 실험 2에서 다양한 정자 농도에 의한 정자 침투율과 정상 수정률을 바탕으로 판단했을 때 $4.6{\times}10^6/ml$의 정자 농도가 다른 정자 농도에 비해 난구 세포부착 난자의 체외 수정에 적합한 것으로 나타났다. 체외 수정과정에서 난구 세포 부착된 상태로 수정된 난자는 나화 난자에 비해 유의적으로(p<0.05) 높은 분할률(48.8% vs. 58.9%), 배반포 형성률(11.0% vs. 22.8%)과 배반포 세포수$(22{\pm}2\;vs.\;29{\pm}2)$를 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 돼지의 체외 수정과정에서 난구 세포의 존재는 정자 침투를 저해하지만 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.
본 연구는 체외 성숙된 난자와 동결 융해 정자를 이용한 돼지의 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 정자 침투율, 웅성전핵 형성률 그리고 후기배로의 체외 발육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epidermal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간 배양하여 체외 성숙을 유도하였다. 성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결 융해정액을 이용하여 5mM caffeine과 10mM calcium chloride를 함유한 mTBM배양액에서 8시간 체외 수정하였다. 체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵 형성률을 조사하였고(실험 $1{\sim}3$) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3). 실험 1에서는 정자 농도를 $7.5{\times}10^5/ml$로 조정하여 나화 난자와 난구 세포 부착난자에서 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 $5{\times}10^6/ml$의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 $7.5{\times}10^5/ml$의 정자 농도로 체외 수정한 후 후기배로의 발육률을 조사하였다. 실험 1의 결과 정자 침투율은 나화 난자에 비해 난구 세포 부착 난자에서 유의적으로 감소되었다(35.2% vs. 77.4%; p<0.01). 실험 2에서 다양한 정자 농도에 의한 정자 침투율과 정상 수정률을 바탕으로 판단했을 때 $4.6{\times}10^6/ml$의 정자 농도가 다른 정자 농도에 비해 난구 세포부착 난자의 체외 수정에 적합한 것으로 나타났다. 체외 수정과정에서 난구 세포 부착된 상태로 수정된 난자는 나화 난자에 비해 유의적으로(p<0.05) 높은 분할률(48.8% vs. 58.9%), 배반포 형성률(11.0% vs. 22.8%)과 배반포 세포수$(22{\pm}2\;vs.\;29{\pm}2)$를 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 돼지의 체외 수정과정에서 난구 세포의 존재는 정자 침투를 저해하지만 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.
This study was conducted to examine the role of intact cumulus cells during in vitro fertilization (IVF) on sperm penetration, male pronuclear (MPN) formation and subsequent embryo development of oocytes matured and fertilized in vitro. Cumulus-oocyte complexes obtained from the slaughtered gilt ova...
This study was conducted to examine the role of intact cumulus cells during in vitro fertilization (IVF) on sperm penetration, male pronuclear (MPN) formation and subsequent embryo development of oocytes matured and fertilized in vitro. Cumulus-oocyte complexes obtained from the slaughtered gilt ovaries were matured for 44 h in TCM199 containing 10% porcine follicular fluid, epidermal growth factor and hormones. After maturation culture, denuded oocytes or oocytes with intact cumulus cells were coincubated with frozen-thawed boar semen for 8h in a modified tris-buffered medium containing 5mM caffeine and 10mM calcium chloride. Putative zygotes were fixed and examined for sperm penetration and MPN formation (Experiments $1{\sim}3$), or cultured in North Carolina State University-23 medium fo. 156 h (Experiment 3). In Experiment 1, sperm penetration was examined after insemination of denuded oocytes and oocytes with intact cumulus cells at the concentration of $7.5{\times}10^5$ sperm/ml. Optimal sperm concentration for IVF of cumulus-intact oocytes was determined in Experiment 2 by inseminating intact oocytes with $2{\sim}5{\times}10^6$ sperm/ml. In Experiment 3, denuded or intact oocytes were inseminated at the concentrations of $7.5{\times}10^5$ and $4.0{\times}10^6$ sperm/ml, respectively, and in vitro embryo development was compared. Sperm penetration was significantly (p<0.01) decreased in cumulus-intact oocytes compared to denuded oocytes (35.2% vs. 77.4%). Based on the rates of sperm penetration and normal fertilization, the concentration of $4.0{\times}10^6$ sperm/ml was optimal for the IVF of intact oocytes compared to other sperm concentrations. The presence of intact cumulus cells during IVF significantly (p<0.05) improved embryo cleavage (48.8% vs. 58.9%), blastocyst (BL) formation (11.0% vs. 22.8%) and embryo cell number $(22{\pm}2\;vs.\;29{\pm}2\;cells)$ compared to denuded oocytes. In conclusion, these results suggest that intact cumulus cells during IVF inhibit sperm penetration but improve embryo cleavage, BL formation and embryo cell number of porcine embryos produced in vitro.
This study was conducted to examine the role of intact cumulus cells during in vitro fertilization (IVF) on sperm penetration, male pronuclear (MPN) formation and subsequent embryo development of oocytes matured and fertilized in vitro. Cumulus-oocyte complexes obtained from the slaughtered gilt ovaries were matured for 44 h in TCM199 containing 10% porcine follicular fluid, epidermal growth factor and hormones. After maturation culture, denuded oocytes or oocytes with intact cumulus cells were coincubated with frozen-thawed boar semen for 8h in a modified tris-buffered medium containing 5mM caffeine and 10mM calcium chloride. Putative zygotes were fixed and examined for sperm penetration and MPN formation (Experiments $1{\sim}3$), or cultured in North Carolina State University-23 medium fo. 156 h (Experiment 3). In Experiment 1, sperm penetration was examined after insemination of denuded oocytes and oocytes with intact cumulus cells at the concentration of $7.5{\times}10^5$ sperm/ml. Optimal sperm concentration for IVF of cumulus-intact oocytes was determined in Experiment 2 by inseminating intact oocytes with $2{\sim}5{\times}10^6$ sperm/ml. In Experiment 3, denuded or intact oocytes were inseminated at the concentrations of $7.5{\times}10^5$ and $4.0{\times}10^6$ sperm/ml, respectively, and in vitro embryo development was compared. Sperm penetration was significantly (p<0.01) decreased in cumulus-intact oocytes compared to denuded oocytes (35.2% vs. 77.4%). Based on the rates of sperm penetration and normal fertilization, the concentration of $4.0{\times}10^6$ sperm/ml was optimal for the IVF of intact oocytes compared to other sperm concentrations. The presence of intact cumulus cells during IVF significantly (p<0.05) improved embryo cleavage (48.8% vs. 58.9%), blastocyst (BL) formation (11.0% vs. 22.8%) and embryo cell number $(22{\pm}2\;vs.\;29{\pm}2\;cells)$ compared to denuded oocytes. In conclusion, these results suggest that intact cumulus cells during IVF inhibit sperm penetration but improve embryo cleavage, BL formation and embryo cell number of porcine embryos produced in vitro.
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문제 정의
돼지에서는 난자에 부착되어 있는 팽대된 난구 세포의 존재가 정자의 침투 및 정상 수정 미치는 영향에 대하여 주로 연구가 진행되어 왔으나 체외수정 후의 발생능에 미치는 영향에 관한 연구 결과는 많지 않다. 따라서 본 연구에서는 체외 성숙 난자 및 동결 정액을 이용하여 수정 과정 중 난자에 부착되어 있는 난구 세포의 존재 여부에 따른 돼지 난자의 수정, 전핵 형성 및 체외 발육을 조사함으로써 체외 수정 과정 중 난구 세포의 역할에 대하여 검토하였다.
본 연구는 체외 성숙된 난자와 동결 융해 정자를 이용한 돼지의 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 정자 침투율, 웅성전핵 형성률 그리고 후기배로의 체외 발육에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epider-mal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간배양하여 체외 성숙을 유도하였다.
가설 설정
a,b Values with different superscripts within each column are significantly different (p<0.05).
제안 방법
난소를 멸균 생리식염수로 3회 세정한 후 난소 표면에 존재하는 직경 3—8 mm의 난포로부터 18-guage 주사침이 연결된 주사기를 이용하여 난자 및 난포액을 채취하였다. 난구 세포가 3층 이상으로 치밀한 난자를 선발하여 체외 성숙에 공여하였다.
후에 배반포 수정란을 검사하여 수정란의 세포수를 관찰하였다. 난자 및 수정란을 whole mount 방법으로 glass slide 에 위치시킨 후 25% (v/v) acetic acid in ethanol 용액에 침지하여 10분간 고정하였으며, 1% (w/v) orcein 용액으로 염색한 후 위상차 현미경 하에서 관찰하였다. 하나 또는 그 이상의 정자두부 또는 웅성 전핵 및 미부가 관찰되는 난자를 수정된 것으로, 하나의 정자가 침투한 난자를 정상 수정된 것으로 판정하였다.
알아보기 위하여 수행되었다. 돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epider-mal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간배양하여 체외 성숙을 유도하였다. 성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결융해정액을 이용하여 5 mM caffeine과 10 mM calcium chlo-ride를 함유한 mTBM 배양액에서 8시간 체외 수정하였다.
하나 또는 그 이상의 정자두부 또는 웅성 전핵 및 미부가 관찰되는 난자를 수정된 것으로, 하나의 정자가 침투한 난자를 정상 수정된 것으로 판정하였다. 배반포의 세포수는 orcein으로 염색된 핵의 수를 관찰하여 산정하였다.
돼지 난소로부터 난자-난구세포 복합체를 채취하여 eCG/hCG, 10% 돼지 난포액, epider-mal growth factor 등이 첨가된 TCM 199 배양액에서 44시간배양하여 체외 성숙을 유도하였다. 성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결융해정액을 이용하여 5 mM caffeine과 10 mM calcium chlo-ride를 함유한 mTBM 배양액에서 8시간 체외 수정하였다. 체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵형성률을 조사하였고(실험 1 ~3) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3).
체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵형성률을 조사하였고(실험 1 ~3) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3). 실험 1에서는 정자 농도를 7.5xl05/ml로 조정하여 나화 난자와 난구 세포부착 난자에서 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 5xl06/ml의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다.
실험 1에서는 체외 성숙 후 난구 세포를 제거한 나화난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 0.75xl06/ml의 정자 농도로 체외 수정한 후 정자 침투율, 정상 수정률 및 웅성전핵형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포가 부착된 난자에 적합한 체외 수정 정자 농도를 결정하기 위하여 2~5xl0*7ml 의 정자 농도로 난구 세포가 부착된 난자를 체외 수정한 후수 정률, 정상 수정률 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다.
5xl05/ml로 조정하여 나화 난자와 난구 세포부착 난자에서 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 5xl06/ml의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 7.
75xl06/ml의 정자 농도로 체외 수정한 후 정자 침투율, 정상 수정률 및 웅성전핵형성률을 조사하였다. 실험 2에서는 난구 세포가 부착된 난자에 적합한 체외 수정 정자 농도를 결정하기 위하여 2~5xl0*7ml 의 정자 농도로 난구 세포가 부착된 난자를 체외 수정한 후수 정률, 정상 수정률 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 실험 1 및 2의 결과를 바탕으로 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 0.
실험 2에서는 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 적합한 정자 농도를 구하기 위해 2, 3, 4, 및 5xl06/ml의 농도로 난자를 수정한 후 정자 침투율 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 7.5x 와 4.0x106/mlSl 정자 농도로 체외 수정한 후 후기배로 의 발육률을 조사하였다. 실험 1의 결과 정자 침투율은 나 화난 자에 비해 난구 세포 부착 난자에서 유의적으로 감소되었다(35.
실험 2에서는 난구 세포가 부착된 난자에 적합한 체외 수정 정자 농도를 결정하기 위하여 2~5xl0*7ml 의 정자 농도로 난구 세포가 부착된 난자를 체외 수정한 후수 정률, 정상 수정률 및 웅성전핵 형성률을 조사하였다. 실험 3에서는 실험 1 및 2의 결과를 바탕으로 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 각각 0.75xl06/ml 및 4xl06/mi의 정자 농도로 체외 수정한 후 정자 침투율, 정상 수정률, 웅성전핵 형성률을 조사하였고, 일부의 난자를 체외 배양하여 분할 및 배반포로의 체외 발육률을 산정함으로써 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구의 실험 결과는 SAS 통계프로그램의 categorical data modeling (CATMOD)procedure를 이용하여 통계학적 유의성을 검정하였다.
인공 수정 및 자연 교배를 통하여 수태 능력이 확인된 웅돈으로부터 정자가 풍부한 분획을 수압법으로 채취하였다. 정액의 동결은 기 발표된 본 실험실의 방법에 준하여 실시하였다(Yoon 등, 2000).
체외 수정 16시간 후 난자를 검사하여 정자 침투율, 정상 수정률 및 웅성전핵형성률을 조사하였으며, 체외 수정 156시간 후에 배반포 수정란을 검사하여 수정란의 세포수를 관찰하였다. 난자 및 수정란을 whole mount 방법으로 glass slide 에 위치시킨 후 25% (v/v) acetic acid in ethanol 용액에 침지하여 10분간 고정하였으며, 1% (w/v) orcein 용액으로 염색한 후 위상차 현미경 하에서 관찰하였다.
체외 수정 종료 후 난자를 새로운 체외 수정 배양액으로 3회 세정하였으며, 체외 배양액으로 1회 세정한 후 30 μl 용량의 배양액 미소적에 15~20개의 난자를 넣어 5% CO2, 5% 6 및 90% N2의 기상 조건 하에서 배양하였다. 체외 수정 48시간 및 156시간 후에 수정란을 관찰하여 각각 분할 여부 및 배반포로의 발육을 관찰하였다. 분할률은 할구가 균일한 크기로 분할된 난자만을 선별하여 산정하였다.
(NCSU-23) medium을 이용하였K(Betters와 Wells, 1993). 체외 수정 종료 후 난자를 새로운 체외 수정 배양액으로 3회 세정하였으며, 체외 배양액으로 1회 세정한 후 30 μl 용량의 배양액 미소적에 15~20개의 난자를 넣어 5% CO2, 5% 6 및 90% N2의 기상 조건 하에서 배양하였다. 체외 수정 48시간 및 156시간 후에 수정란을 관찰하여 각각 분할 여부 및 배반포로의 발육을 관찰하였다.
성숙 배양 후 난구 세포를 제거한 난자와 난구 세포가 부착되어 있는 난자를 돼지 동결융해정액을 이용하여 5 mM caffeine과 10 mM calcium chlo-ride를 함유한 mTBM 배양액에서 8시간 체외 수정하였다. 체외 수정 후 난자를 고정, 염색하여 정자 침투율과 웅성전핵형성률을 조사하였고(실험 1 ~3) 일부 수정란을 North Carolina State University-23 배양액에서 체외 수정 후 156시간 배양하여 후기배로의 발육능을 검토하였다(실험 3). 실험 1에서는 정자 농도를 7.
체외 수정을 위한 정자 처리에는 마그네슘 및 칼슘이 들어있지 않은 phosphate-buffered saline(PBS)을, 체외 수정에는 modified tris-buffered medium(mTBM; Hong 등, 2004)을 사용하였다. 동결 정액을 39℃의 온수에 1분간 침지하여 융해한 후 0.
1% (w/v) hyaluronidase 용액에 넣어 부드럽게 피펫팅함으로써 난구 세포를 제거하였다. 최종 용량이 50 ul인 수정용 배양액 미소적에 20~30개의 난자를 넣고 실험 설계에 따라 7.5x10: 2xl06, 3xl06, 4xl06 또는 5xl06 sperm/ml의 정자 농도로 하여 39℃, 5% 탄산가스 인큐베이터 내에서 8시간 동안 체외 수정하였다.
난자 및 수정란을 whole mount 방법으로 glass slide 에 위치시킨 후 25% (v/v) acetic acid in ethanol 용액에 침지하여 10분간 고정하였으며, 1% (w/v) orcein 용액으로 염색한 후 위상차 현미경 하에서 관찰하였다. 하나 또는 그 이상의 정자두부 또는 웅성 전핵 및 미부가 관찰되는 난자를 수정된 것으로, 하나의 정자가 침투한 난자를 정상 수정된 것으로 판정하였다. 배반포의 세포수는 orcein으로 염색된 핵의 수를 관찰하여 산정하였다.
대상 데이터
난소를 멸균 생리식염수로 3회 세정한 후 난소 표면에 존재하는 직경 3—8 mm의 난포로부터 18-guage 주사침이 연결된 주사기를 이용하여 난자 및 난포액을 채취하였다. 난구 세포가 3층 이상으로 치밀한 난자를 선발하여 체외 성숙에 공여하였다. 체외 성숙 배양액으로는 TCM199에 10% (v/v) 돼지 난포액(pFF), 15 ng/ml EGF, 5 IU/ml eCG, 5 lU/ml hCG, 0.
도축장으로부터 미 성 숙돼 지 의 난소를 채 취 하였다. 난소를 멸균 생리식염수로 3회 세정한 후 난소 표면에 존재하는 직경 3—8 mm의 난포로부터 18-guage 주사침이 연결된 주사기를 이용하여 난자 및 난포액을 채취하였다.
데이터처리
75xl06/ml 및 4xl06/mi의 정자 농도로 체외 수정한 후 정자 침투율, 정상 수정률, 웅성전핵 형성률을 조사하였고, 일부의 난자를 체외 배양하여 분할 및 배반포로의 체외 발육률을 산정함으로써 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재가 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구의 실험 결과는 SAS 통계프로그램의 categorical data modeling (CATMOD)procedure를 이용하여 통계학적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
정액의 동결은 기 발표된 본 실험실의 방법에 준하여 실시하였다(Yoon 등, 2000). 즉, 채취한 정액을 2시간 이상에 걸쳐 17℃ 까지 냉각하였다.
성능/효과
결론적으로 본 연구 결과로부터 돼지의 체외 수정 과정에서 난구 세포의 존재는 정자의 침투를 저해하지만 체외 수정 난자의 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.
난구 세포 부착 난자에서는 외부에 존재하는 난구 세포로 인해 난자가 해로운 환경에 직접 노출되지 않는다. 따라서 본 연구에서도 난구 세포의 이러한 난자 보호 작용으로 인해 난구 세포가 부착된 상태로 수정된 난자의 체외 발육능이 개선된 것으로 생각된다. 소에서도 난구 세포가 oxidative stress 로부터 난자를 보호하여 배 발육을 개선하였다는 연구 결과가 보고되었다(Fatehi 등, 2005).
얻을 수 있는 것으로 나타났다. 또한 수정 과정 중 난구 세포의 존재는 체외 수정 후 수정란의 체외 발육을 개선하고 세포수를 증가시키는 것으로 나타났다.
해결이 가능하였다. 본 연구실에서 제작한 동결융해 정액을 이용하여 2, 3, 4 및 의정자 농도로 수정하였을 때 4xl0%nl의 농도가 정자 침투율 및 정상 수정률에서 나화 난자에 필적하는 결과를 보임으로써 난구 세포 부착 난자의 체외 수정에 가장 적절한 것으로 나타났다. 돼지 체외 수정에 이용되는 정자 농도는 수정 배양액이나 사용되는 정액의 종류에 따라 다양하게 보고되고 있다(Suzuki 등, 2005; Wongsrikeao 등, 2005; Hong 등, 2004; Wang 등, 1994).
본 연구에서 난구 세포가 부착된 상태로 수정된 난자에서 분할 및 배반포로의 체외 발육이 증가하였으며 세포수도 증가하였다. 이는 난자가 정자와 함께 공배양되는 과정에서 난구 세포가 중요한 역할을 한다는 것을 의미하는 것으로서, 난구 세포가 부착된 상태에서 수정된 난자가 나화 난자 상태로 수정된 수정란에 비해 분할률 및 배반포 발생률이 유의적으로 증가하였다는 소(Fatehi 등, 2005) 및 돼지(Wongsrikeao 등, 2005)에서의 보고와 유사한 결과였으나, 난구 세포가 부착된 상태로 수정된 난자에서 배 발육능이 개선되지 않았다는 결과(Gil 등, 2004)와는 대조적이었다.
본 연구에서 돼지 체외 수정 과정 중 난자에 부착되어 있는 난구 세포의 존재가 정자의 난자 내 침투 및 수정란의 체외발육에 미치는 영향을 조사한 결과 난구 세포의 존재가 정자의 침입을 억제하였으나 정자 농도를 증가시켜 수정할 경우, 일정 수준 이상의 정자 침투율, 정상 수정률 및 웅성전핵 형성률을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 또한 수정 과정 중 난구 세포의 존재는 체외 수정 후 수정란의 체외 발육을 개선하고 세포수를 증가시키는 것으로 나타났다.
29±2)를 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 돼지의 체외 수정과정에서 난구 세포의 존재는 정자 침투를 저해하지만 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.
실험 1 및 2의 결과를 바탕으로 각각 0.75xl06/ml 및 4x106/ml의 정자 농도로 나화 난자 및 난구 세포 부착 난자를 체외 수정하고 그 중 일부의 난자를 체외 배양한 결과 정자 침투율(83.6% vs. 85.1%), 정상 수정률(37.7% vs. 35.7%) 및 웅성전핵 형성률(87.0% vs. 90.9%)에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았으나(Table 3), 체외 수정 란의 분할률, 배반포 형성률 및 세포수는 각각 나화 난자군과 난구 세포 부착 난자군에서 각각 48.8%와 58.9%, 11.0%와 22.8% 및 22±2와 29±2로 난구 세포가 부착된 상태로 수정한 난자가 나화 난자에 비해 유의적으로0<0.05) 높은 체외 발육능을 보였다(Table 4).
0x106/mlSl 정자 농도로 체외 수정한 후 후기배로 의 발육률을 조사하였다. 실험 1의 결과 정자 침투율은 나 화난 자에 비해 난구 세포 부착 난자에서 유의적으로 감소되었다(35.2% vs. 77.4%; p<0.01). 실험 2에서 다양한 정자 농도에의한 정자 침투율과 정상 수정률을 바탕으로 판단했을 때 4.
01). 실험 2에서 다양한 정자 농도에의한 정자 침투율과 정상 수정률을 바탕으로 판단했을 때 4.0x106/ml의 정자 농도가 다른 정자 농도에 비해 난구 세포부착 난자의 체외 수정에 적합한 것으로 나타났다. 체외 수정과정에서 난구 세포 부착된 상태로 수정된 난자는 나화 난자에 비해 유의적으로(p<0.
6%로 다른 군에 비해 높은 결과를 나타내었다. 실험에서 조사된 정자 농도 중에 4xl06/ml의 농도군이 정자 침투율, 정상 수정률 그리고 웅성전핵 형성률에서 각각 68.5%, 57.6% 및 61.2%로 나화난자군의 수정 결과와 유사한 결과를 보였다.
위한 실험 결과는 Table 2에 나타내었다. 정자 농도를 각각 2, 3, 4 및 5xl0x7ml로 하여 체외 수정한 결과 정자 농도가 증가할수록 정자 침투율(37.2 ~79.0%)은 유의적으로 증가하였으나 정상 수정률은 3x106/ml 및 4x106/ml 군에서 각각 50.9%와 57.6%로 다른 군에 비해 높은 결과를 나타내었다. 실험에서 조사된 정자 농도 중에 4xl06/ml의 농도군이 정자 침투율, 정상 수정률 그리고 웅성전핵 형성률에서 각각 68.
검사한 결과는 Table 1과 같다. 정자 침투율과 정상 수정률의 경우 난구 세포를 제거한 군과 난구 세포가 부착되어 있는 군에서 각각 77.4%와 35.2%, 40.7%와 60.8%의 성적을 보여 난구 세포의 존재 여부에 의해 유의적인(P<0.01) 차이가 나타났으나 웅성전핵 형성률에서는 각각 88.5%와 90.2%의 성적을 보여 유의적인 차이를 보이지 않았다.
0x106/ml의 정자 농도가 다른 정자 농도에 비해 난구 세포부착 난자의 체외 수정에 적합한 것으로 나타났다. 체외 수정과정에서 난구 세포 부착된 상태로 수정된 난자는 나화 난자에 비해 유의적으로(p<0.05) 높은 분할률(48.8% vs. 58.9 %), 배반포 형성률(11.0% vs. 22.8%)과 배반포 세포수(22±2 vs.29±2)를 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 돼지의 체외 수정과정에서 난구 세포의 존재는 정자 침투를 저해하지만 분할률, 배반포 형성률 및 배반포의 세포수를 증가시키는 것으로 사료된다.
후속연구
돼지 체외 수정에 이용되는 정자 농도는 수정 배양액이나 사용되는 정액의 종류에 따라 다양하게 보고되고 있다(Suzuki 등, 2005; Wongsrikeao 등, 2005; Hong 등, 2004; Wang 등, 1994). 따라서 일정 수준 이상의 체외 수정률 및 높은 정상 수정률을 얻기 위해서는 난구 세포의 부착 여부, 사용되는 정자의 활력 및 첨체의 정상성 등 실험 조건에 따라 적절한 정자 농도, 공 배양 시간 및 수정 방법을 검토하여 적용하는 것이 필요할 것으로 생각된다.
또한 난구 세포가 웅성 전핵 형성뿐만 아니라 그 이후 정상적인 수정란 발육을 유도할 수 있는 정상적인 정자를 선발해 주는 중요한 역할을 함으로써 배발육이 증가했을 가능성도 있다(Tanghe 등, 2002). 체외 수정과정에서 난자에 부착되어 있는 난구 세포의 이로운 영향을 구체적으로 규명하기 위해서는 수정란 이식을 통한 돼지 산자의 생산에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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