배무채 에탄올층의 D-galactosamine 간손상에 대한 보호효과 Hepatoprotective Effect of Ethanol Extract of xBrassicaraphanus on Liver Injury in Rats Treated by D-galactosamine원문보기
The protective effect of xBrassicoraphanus (BR) on liver inhury was evaluated in the rats with liver injury induced by i.p. injection of D-galactosamine (GalN) following 2 week oral treatment of ethanol extract of xBrassicoraphanus (EBR). EBR (200 mg/kg) significantly suppressed the levels of ALT, A...
The protective effect of xBrassicoraphanus (BR) on liver inhury was evaluated in the rats with liver injury induced by i.p. injection of D-galactosamine (GalN) following 2 week oral treatment of ethanol extract of xBrassicoraphanus (EBR). EBR (200 mg/kg) significantly suppressed the levels of ALT, AST, SDH, ${\gamma}-GT$, ALP, LDH and lipid peroxidation compared with GalN treated control, while EBR at 100 mg/kg significantly suppressed AST and ${\gamma}-GT$. Similarly, EBR at 200 mg/kg significantly attenuated the levels of Phase I enzymes such as XO, AO, AH and AD as well as significantly increased the levels of Phase II enzymes such as SOD, catalase and GSH-Px in the GalN treated rats. Taken together, these results indicate that the ethanol extract of xBrassicoraphanus may have a hepatoprotective effect against GalN induced liver injury, suggesting the ethanol extract of xBrassicoraphanus can be applied as hepatoprotective functional food. However, its mechanism should be further studied in molecular and cellular view points.
The protective effect of xBrassicoraphanus (BR) on liver inhury was evaluated in the rats with liver injury induced by i.p. injection of D-galactosamine (GalN) following 2 week oral treatment of ethanol extract of xBrassicoraphanus (EBR). EBR (200 mg/kg) significantly suppressed the levels of ALT, AST, SDH, ${\gamma}-GT$, ALP, LDH and lipid peroxidation compared with GalN treated control, while EBR at 100 mg/kg significantly suppressed AST and ${\gamma}-GT$. Similarly, EBR at 200 mg/kg significantly attenuated the levels of Phase I enzymes such as XO, AO, AH and AD as well as significantly increased the levels of Phase II enzymes such as SOD, catalase and GSH-Px in the GalN treated rats. Taken together, these results indicate that the ethanol extract of xBrassicoraphanus may have a hepatoprotective effect against GalN induced liver injury, suggesting the ethanol extract of xBrassicoraphanus can be applied as hepatoprotective functional food. However, its mechanism should be further studied in molecular and cellular view points.
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문제 정의
2). 또한 배무채가 지질과산화산물을 감소시키는 기전을 연구하기위해 생체방어기전인 phage I, II 해독화 효소와 항산화효소에 관하여 평가하였다. Phage I 해독화 효소인 XO, AO, AD 와 AH 는정상군에 비해 GalN에 의해 활성이 증가하였고, 이를 배무채가 감소시킴을 확인하였다(Fig.
진행되고 있다11-13). 본 연구에서는 무와 배추의 교배와 약 배양을 통해 육성된 새로운 속간식물인 배무채를 이용하여 간독성에 대한 보호효과를 살펴보았다.
이에 배추와 무의 자연교잡종인 배무채도 보다 효과적인 보간 효과가 기대 되지만 이를 확인하는 연구는 아직 이루어 지지 못하였다. 이에 배무채의 보간효과를 평가하기 위하여 D-galactosamine 으로 간 독성을 유발한 흰쥐의 in vivo 실험에서, 혈청중의 ALT, AST, SDH, -GT, ALP, LDH, 간조직의 lipid peroxide 및 phase I, II 해독화효소 등의 활성을 평가하여 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.
제안 방법
0.1 M KP buffer (pH 7.5)에 효소액을 가하고 기질로서 sodium xanthine 을 가한후 반응시키고 20% TCA 로 제단백한 후 생성된 uric acid를 292 nm에서 측정하고 표준검량선에 준하여 활성도를 산정하였다.
40 mmol glycylglycine 을 함유하는 완충액 (pH 8.2) 의 반응액에 효소원을 가하여 405 nm 에서 흡광도를 측정하여 p-nitroaniline 형성율을 관찰하여 효소활성을 측정하였다.
그 후에 potassium periodate 10 ㎕를 넣어주고 상온에서 5분 동안 인큐베이션 후에 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 catalase 의 활성을 측정하였다. Catalase 표준품을 사용하여 검량표준곡선을 작성하고, 이를 이용하여 피조직내 catalase의 양을 계산하였다.
D-galactosamine 간염 - 실험동물에 생리식염수로 용해시킨 D-galactosamine - HCl (GaIN)을 400 ㎎/㎏씩 복강내로 투여하고 24시간 경과후 채혈하여 원심분리후 혈청을 취하여 ALT, AST, -GT, SDH 및 LDH의 활성을 측정하였다. 각시험 물질은 GaIN 투여하기전 2주일전에 10% tween 80용액에 용해시켜 경구투여하였다.
GalN 으로 간독성을 유발한 흰쥐에서 간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD효소가 각각 13.
GalN 으로 간독성을 유발한 흰쥐에서 간조직의 효소원을 분리하여 phase II 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.
Tris. HCl 완충액 (pH 7.4)에 기질인 1 mM aniline HCl, 0.5 mM NADPH 및 효소액 (300-400 g 의 단백질)을 가하여 이액을 37℃ 에서 20분간 반응 시킨 다음 반응을 종료시킬 목적으로 20% trichloroacetic acid 를 가한후 10분간 원심분리 하여 상징액에 발색의 목적으로 10% Na2CO3 와 0.2 N-NaOH (2% phenol 함유)를 넣고 37C 에서 30분간 반응 시킨 후 파장 640 nm 에서 그 흡광도를 읽고 표준곡선에서 활성도를 산정하였다.
5) 에 2 mM aminopyrine . HCl, 0.5 mM NADPH, 10 mM MgCL, 150 mM KCl, 1 mM semicarbaizide 및 효소액 (30-400 i g의 단백 질) 을 가해 이 반응액을 37C 에서 30분간 반응시킨 다음 15% ZnSO4 와 포화 Ba(OH)2 를 가하여 반응을 종료 시키고 5분간 방치 후 10분간 원심분리하여 여기서 얻은 상등액 5 ml 에 발색의 목적으로 Nash reagent를 첨가하고 60C 에서 30분간 반응 시킨 후 다시 원심분리하여 상징액을 취하여 파장 415 nm 에서 그 흡광도를 측정하고 표준곡선에 준하여 활성도를 산정하였다.
Meister 와 Richman 의 방법에 준하여 반응액 3.5 ml 중 0.1 M tris HCl buffer(pH 8.0), 8.9 mM L-glutamic acid, 0.94 mM EDTA, 3.2 mM MgCL, 1.35 mM ATP와 효소액 (100-300 g 단백질)을 가하여 37'C 에서 10분 반응시킨 후 spectrophotometer 를 이용하여 흡광도 600 nm 에서 효소의 활성을 측정하였다.
530 nm 에서 흡광도를 측정하였다. SOD 표준품을 사용하여 검량표준곡선을 작성하고, 이를 이용하여 피조직내 SOD 의 활성을 계산하였다.
-GT, SDH 및 LDH의 활성을 측정하였다. 각시험 물질은 GaIN 투여하기전 2주일전에 10% tween 80용액에 용해시켜 경구투여하였다.
간 조직 1 g 당 9배량의 생리식염수를 가해 마쇄하고 이 마쇄액에 8.1% sodium dodecyl sulfate와 20% acetate buffer (pH 3.5) 및 발색의 목적으로 0.8% thiobarbituric acid 를 가한후 95 C 에서 1시간 동안 반응 시킨후 실온에서 냉각시켜 n-BuOH: Pyridine(15:1) 을 첨가하여 15분간 원심분리 시킨후 홍색의 n-BuOH : pyridine층을 취하여 파장 532 nm에서 그 흡광도를 측정하여 표준곡선에서 그 함량을 표시하였다.
간조직으로 효소원을 분리하고, glutathione함량 및 -GCS 과 GR 효소 활성을 측정하였다. 결과 Fig.
GalN 으로 간독성을 유발한 흰쥐에서 간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD효소가 각각 13.
그후 10 M potassium hydroxide (KOH) 30 ㎕를 첨가 한후에 30 成의 purpald solution 을 넣고 상온에서 10분간 흔들어 주었다. 그 후에 potassium periodate 10 ㎕를 넣어주고 상온에서 5분 동안 인큐베이션 후에 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 catalase 의 활성을 측정하였다. Catalase 표준품을 사용하여 검량표준곡선을 작성하고, 이를 이용하여 피조직내 catalase의 양을 계산하였다.
동물을 CO2 gas 로 가볍게 마취시킨 후, 복부 정중선을 따라 개복하고 복부 대동맥에서 혈액을 채취한 전혈을 실온에서 30분간 방치하여 응고시킨 다음, 원심분리기로 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리시켜 실험에 사용하였다.
여과하고, rotary evaporator로 농축하였다. 배무채 시료는 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 실험동물에 100, 200 ㎎/㎏ 을 투여하였다. 대조군은 동일량의 상기의 용매를 사용하였다.
배무채 에탄올충이 간손상 보호효과가 있는지 평가하기위해 배무채 에탄올 추출액을 2주간 경구투여하고 D-galactosamine (GalN)으로 흰쥐에 간독성을 유발하였다. 이후 혈청을 분리하여간기능 수치를 측정한 결과, GalN 은 정상군에 비해 유의하게 모든 간기능검사 수치를 증가시켜 간독성을 유발함을 확인하였다.
배무채 에탄올층이 간손상 보호효과가 있는지 평가하기위해 D-galactosamine (GalN) 으로 흰쥐에 간독성을 유발하였다. 이후 혈청을 분리하여 효소활성을 측정한 결과, ALT, SDH, ALP와 LDH 는 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을 나타내었고, ASL와 γ-GT 는 배무채 에탄올층 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다 (Fig.
실험동물을 CO2 gas로 가볍게 마취시킨 후, 복부 대동맥에서 채혈하여 실혈사 시키고 간장을 생리식염수로 관류시켜 조직내 혈액을 제거하고 간장을 적출하여 생리식염수로 씻은 다음 여지로 간에 남아 있는 혈액 및 기타 이물질을 제거한 다음 간조직 1 g 당 4배 양의 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) 를 가하여 빙냉상에서 glass teflon homogenizer 로 마쇄하였다. 이 마쇄액을 냉장 원심분리기로 600 xg 에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상징액을 고속 원심분리기로 10, 000 xg 에서 20분간 원심분리한 후, 그 침전물은 동량의 0.
5 ml ninhydrin 시약을 가한후 10분간 가열하여 냉수에 냉각하고서 560 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이곳에서 non-protein-SH 에서 cysteine 을 재한값을 glutathione 의 양으로하였다.
Kind 와 King 의 방법에 따라 kit 시약으로 측정하였다. 즉 기질인 phenyl phosphate가 함유된 0.05 M carbonate buffer(pH 10.0) 2.0 ml 를 37C 에서 3분간 preincubation 한 후 혈청 0.05 ml 를 가한 후 37C 에서 15분간 반응시킨 후 발색 및 반응 종료의 목적으로 발색시약을 첨가하고서 500 nm 에서 흡광도를 읽고 표준검량선에 준하여 효소의 활성도를 산정하였다.
즉기질액 (100 ml 당 lithium lactate 2.31 g 및 tris (hydroxymethyl) aminomethane 2.42 g 함유)과 정 색시 액 (100 ml당 NAD 574 mg 및 1-methylphenassium metalsulfate 3.4 ml 함유)을 1:1 로 혼합하여 37C 에서 5분간 preincubation 후에 시료를 가하여 잘 혼합하고 37C 에서 10분간 방치하여 염산으로 반응을 종료시켜 파장 570 nm 에서 흡광도를 읽고 표준곡선에 준해 그 활성도를 측정하였다.
대상 데이터
(주) BioLink로부터 분양받아 동물사내의 명암 (12시간 light/dark cycle), 습도 (55~60%) 및 온도 (24±2℃)는 자동으로조절되는 Environmental controlled rearing system (대종기기)을 사용하여 2주 가량 충분하게 적응시켜 사육한 체중 20±2 g의 ICR계 웅성 생쥐 및 체중 200±10 g의 Sprague-Dawley계 웅성흰쥐를 사용하였고, 실험 시간 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다. 이때 효소 활성의 일중 변동을 고려하여 실험동물을 일정시간 (오전 10:00-12:00) 내에서 처치하였다.
배무채 시료는 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 실험동물에 100, 200 ㎎/㎏ 을 투여하였다. 대조군은 동일량의 상기의 용매를 사용하였다.
본 시험에 사용된 배무채(X Brassicoraphanus; BR)는 중앙대학교 Biobreed Institute 에서 공급받아 에탄올로 실온에서 추출하여 여과하고, rotary evaporator로 농축하였다. 배무채 시료는 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 실험동물에 100, 200 ㎎/㎏ 을 투여하였다.
시약중 NAD, NADH, NADPH, aminopyrine, aniline HCl, D-galactosamine, silymarine 및 bovine serum albumin 은 Sigma 제, malondialdehyde 는 Aldrich 제, reduced glutathione, oxidized glutathione 은 Fluka 제, p-aminophenol, 및 thiobarbituric acid 는 Katayama 제, 또한 kit 시약 중 aminotransferase, γ -glutamyltransferase는 영동제약제, sorbitol dehydrogenase, lactate dehydrogenase 는 Sigma 제를 사용하였으며, 그외 시약은 특급 및 일급을 사용하였다.
실험에 사용한 기구는 생화학 분석장비 (Hitachi 7600-110), 혈액 분석기 (Coulter GEN-S), UV-spectrophotometer(Shimadzu, UV-240), refrigerated centrifuge(Beckman J2-21), ultracentrifuge(Hitachi, 65-P7) 및 cold laboratory chamber(Korean manhattan, KMC-8512) 등이었다.
데이터처리
for eight experiments. Data followed by different superscript are statistically significant by Duncan's multiple range test (p<0.05).
for eight experiments. Data followed by different superscript are statistically significant by Duncan's new multiple range test (p<0.05).
모든 데이터는 평균 土 S.D.로 표시하였고, ANOVA test를 통하여 통계적 유의성은 Duncan's multiple rage test로서 검정하였으며, p<0.05 일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
Berga 와 Boida 의 방법에 따라 조제된 kit 를 사용하였다. 즉기질액 (100 ml 당 lithium lactate 2.
Kind 와 King 의 방법에 따라 kit 시약으로 측정하였다. 즉 기질인 phenyl phosphate가 함유된 0.
단백질의 함량은 Lowry 등10)의 방법에 준하여 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 측정하였다.
성능/효과
평가하였다. GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.23±0.77, 18.40±3.17, 5.28±0.24로 정상군에 비해 유의적으로 감소하였는데, 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 을 처리하였을 때 각각 43.75±0.49, 27.75±1.45, 7.96±0.55로 GalN 처리대조군에 비해 유의하게 증가되었다. GST효소활성은 GalN 처리대조군과 배무채처리군과는 아무런 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (Fig.
간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD 효소가 모두 정상군에 비해 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏을 처리하였을 때 각각 9.6±2.16, 43.27±6.11, 3.46±0.21, 8.12±0.68로 GalN 처리대조군에 비해 유의적으로 저해함을 확인하였다. 또한 간조직의 효소원에서 phase II 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가한 결과 GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.
평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD효소가 각각 13.30±3.42, 56.78±7.03, 3.87±0.13, 9.26±0.58로 정상군에 비해 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 을 처리하였을 때 각각 9.6±2.16, 43.27±6.11, 3.46±0.21, 8.12±0.68로 GalN 처리대조군에 비해 유의적으로 저해함을 확인하였다 (Fig. 4).
또한 배무채가 지질과산화산물을 감소시키는 기전을 연구하기위해 생체방어기전인 phage I, II 해독화 효소와 항산화효소에 관하여 평가하였다. Phage I 해독화 효소인 XO, AO, AD 와 AH 는정상군에 비해 GalN에 의해 활성이 증가하였고, 이를 배무채가 감소시킴을 확인하였다(Fig. 4). 또한 phage II 해독화 효소인 GST, SOD, catalase 와 GSH-Px 는 항산화효소로 잘 알려져 있는데, 이 효소들은 GalN 에 의해 활성이 정상군보다 감소하였으며, 배무채는 SOD, catalase 와 GSH-Px 의 효소활성을 현저히 증가시켰다.
37으로 유의적으로 억제되었다. 간조직으로 효소원을 분리하고, glutathione함량 및 -GCS과 GR효소 활성을 측정한 결과 GalN 처리대조군과 배추채 에탄올 처리군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다.
이상의 결과로써 배무채가 phageⅠ과 Ⅱ에 관여하는 해독화 효소들의 활성을 조절함으로써 지질과산화물의 생성을 저해함을 알 수 있었다. 따라서 배무채는 GalN으로 유도된 간독성을 감소시켜 보간효능이 있음을 확인하였다.
68로 GalN 처리대조군에 비해 유의적으로 저해함을 확인하였다. 또한 간조직의 효소원에서 phase II 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가한 결과 GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.23±0.77, 18.40±3.17, 5.28±0.24로 정상군에 비해 유의적으로 감소하였는데, 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 을 처리하였을 때 각각 43.75±0.49, 27.75±1.45, 7.96±0.55로 GalN 처리대조군에 비해 유의하게 증가되었다. 한편 GST 효소활성은 GalN 처리대조군과 배무채 처리군과는 아무런 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
2에서 보듯 GalNe 정상군에 비해 지질과산화산물인 MDA의 형성을 유도하는더〕, 이 지질과 산화산물은 oxygen radical 과 반응하여 형성된 것으로 결국은 세포를 손상시켜 기능을 저하시키고 조직손상, 노화, 염증 및 발암 등여러 가지 병리적인 현상을 야기한다17-20). 본 연구결과에서는 배무채가 GalN 으로 유도된 지질과산화물의 함량을 현저히 감소시킴을 확인하여 세포의 손상보호에 효과적이라 사료된다(Fig. 2). 또한 배무채가 지질과산화산물을 감소시키는 기전을 연구하기위해 생체방어기전인 phage I, II 해독화 효소와 항산화효소에 관하여 평가하였다.
간독성을 유발한다14-161. 이는 GalN 처리대조군에서 ALT, AST, SDH, -GT, ALP 와 LDH 가 모두 정상군에 비해 유의적으로 증가하여 GalN이 간독성을 유발함을 확인하였다. 반면 배무채를 전처리한 군에서는 GalN 로 유발된 간독성을 현저히 감소시킴을 확인하였다(Fig.
또한 phage II 해독화 효소인 GST, SOD, catalase 와 GSH-Px 는 항산화효소로 잘 알려져 있는데, 이 효소들은 GalN 에 의해 활성이 정상군보다 감소하였으며, 배무채는 SOD, catalase 와 GSH-Px 의 효소활성을 현저히 증가시켰다. 이상의 결과로써 배무채가 phageⅠ과 Ⅱ에 관여하는 해독화 효소들의 활성을 조절함으로써 지질과산화물의 생성을 저해함을 알 수 있었다. 따라서 배무채는 GalN으로 유도된 간독성을 감소시켜 보간효능이 있음을 확인하였다.
이후 혈청을 분리하여간기능 수치를 측정한 결과, GalN 은 정상군에 비해 유의하게 모든 간기능검사 수치를 증가시켜 간독성을 유발함을 확인하였다. 이에 ALT, SDH, ALP 와 LDH 는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을나타내었고, ASL와 -GT는 배무채 에탄올충 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다. 정상군에 비해 GalN 처리대조군에서 지질과산화물의 함량이 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군에 비해 80.
이후 혈청을 분리하여 효소활성을 측정한 결과, ALT, SDH, ALP와 LDH 는 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을 나타내었고, ASL와 γ-GT 는 배무채 에탄올층 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다 (Fig. 1).
흰쥐에 간독성을 유발하였다. 이후 혈청을 분리하여간기능 수치를 측정한 결과, GalN 은 정상군에 비해 유의하게 모든 간기능검사 수치를 증가시켜 간독성을 유발함을 확인하였다. 이에 ALT, SDH, ALP 와 LDH 는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을나타내었고, ASL와 -GT는 배무채 에탄올충 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다.
이에 ALT, SDH, ALP 와 LDH 는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을나타내었고, ASL와 -GT는 배무채 에탄올충 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다. 정상군에 비해 GalN 처리대조군에서 지질과산화물의 함량이 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군에 비해 80.2±9.37으로 유의적으로 억제되었다. 간조직으로 효소원을 분리하고, glutathione함량 및 -GCS과 GR효소 활성을 측정한 결과 GalN 처리대조군과 배추채 에탄올 처리군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
한편 GST 효소활성은 GalN 처리대조군과 배무채 처리군과는 아무런 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이상의 결과로 보아 배무채 에탄올층의 전처치는 GalN 으로 야기한 간손상에 대해 유의한 보호효과가 인정되어 향후 보간 기능성소재로 활용될 수 있을 것으로 보이나, 보다 심도 있는 연구가 지속되어야 할 것으로 사료된다.
참고문헌 (20)
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