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문제 정의
- 2). 또한 배무채가 지질과산화산물을 감소시키는 기전을 연구하기위해 생체방어기전인 phage I, II 해독화 효소와 항산화효소에 관하여 평가하였다. Phage I 해독화 효소인 XO, AO, AD 와 AH 는정상군에 비해 GalN에 의해 활성이 증가하였고, 이를 배무채가 감소시킴을 확인하였다(Fig.
- 진행되고 있다11-13). 본 연구에서는 무와 배추의 교배와 약 배양을 통해 육성된 새로운 속간식물인 배무채를 이용하여 간독성에 대한 보호효과를 살펴보았다.
- 이에 배추와 무의 자연교잡종인 배무채도 보다 효과적인 보간 효과가 기대 되지만 이를 확인하는 연구는 아직 이루어 지지 못하였다. 이에 배무채의 보간효과를 평가하기 위하여 D-galactosamine 으로 간 독성을 유발한 흰쥐의 in vivo 실험에서, 혈청중의 ALT, AST, SDH, -GT, ALP, LDH, 간조직의 lipid peroxide 및 phase I, II 해독화효소 등의 활성을 평가하여 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0.1 M KP buffer (pH 7.5)에 효소액을 가하고 기질로서 sodium xanthine 을 가한후 반응시키고 20% TCA 로 제단백한 후 생성된 uric acid를 292 nm에서 측정하고 표준검량선에 준하여 활성도를 산정하였다.
- 40 mmol glycylglycine 을 함유하는 완충액 (pH 8.2) 의 반응액에 효소원을 가하여 405 nm 에서 흡광도를 측정하여 p-nitroaniline 형성율을 관찰하여 효소활성을 측정하였다.
- 그 후에 potassium periodate 10 ㎕를 넣어주고 상온에서 5분 동안 인큐베이션 후에 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 catalase 의 활성을 측정하였다. Catalase 표준품을 사용하여 검량표준곡선을 작성하고, 이를 이용하여 피조직내 catalase의 양을 계산하였다.
- D-galactosamine 간염 - 실험동물에 생리식염수로 용해시킨 D-galactosamine - HCl (GaIN)을 400 ㎎/㎏씩 복강내로 투여하고 24시간 경과후 채혈하여 원심분리후 혈청을 취하여 ALT, AST, -GT, SDH 및 LDH의 활성을 측정하였다. 각시험 물질은 GaIN 투여하기전 2주일전에 10% tween 80용액에 용해시켜 경구투여하였다.
- GalN 으로 간독성을 유발한 흰쥐에서 간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD효소가 각각 13.
- GalN 으로 간독성을 유발한 흰쥐에서 간조직의 효소원을 분리하여 phase II 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.
- Tris. HCl 완충액 (pH 7.4)에 기질인 1 mM aniline HCl, 0.5 mM NADPH 및 효소액 (300-400 g 의 단백질)을 가하여 이액을 37℃ 에서 20분간 반응 시킨 다음 반응을 종료시킬 목적으로 20% trichloroacetic acid 를 가한후 10분간 원심분리 하여 상징액에 발색의 목적으로 10% Na2CO3 와 0.2 N-NaOH (2% phenol 함유)를 넣고 37C 에서 30분간 반응 시킨 후 파장 640 nm 에서 그 흡광도를 읽고 표준곡선에서 활성도를 산정하였다.
- 5) 에 2 mM aminopyrine . HCl, 0.5 mM NADPH, 10 mM MgCL, 150 mM KCl, 1 mM semicarbaizide 및 효소액 (30-400 i g의 단백 질) 을 가해 이 반응액을 37C 에서 30분간 반응시킨 다음 15% ZnSO4 와 포화 Ba(OH)2 를 가하여 반응을 종료 시키고 5분간 방치 후 10분간 원심분리하여 여기서 얻은 상등액 5 ml 에 발색의 목적으로 Nash reagent를 첨가하고 60C 에서 30분간 반응 시킨 후 다시 원심분리하여 상징액을 취하여 파장 415 nm 에서 그 흡광도를 측정하고 표준곡선에 준하여 활성도를 산정하였다.
- Meister 와 Richman 의 방법에 준하여 반응액 3.5 ml 중 0.1 M tris HCl buffer(pH 8.0), 8.9 mM L-glutamic acid, 0.94 mM EDTA, 3.2 mM MgCL, 1.35 mM ATP와 효소액 (100-300 g 단백질)을 가하여 37'C 에서 10분 반응시킨 후 spectrophotometer 를 이용하여 흡광도 600 nm 에서 효소의 활성을 측정하였다.
- 530 nm 에서 흡광도를 측정하였다. SOD 표준품을 사용하여 검량표준곡선을 작성하고, 이를 이용하여 피조직내 SOD 의 활성을 계산하였다.
- -GT, SDH 및 LDH의 활성을 측정하였다. 각시험 물질은 GaIN 투여하기전 2주일전에 10% tween 80용액에 용해시켜 경구투여하였다.
- 간 조직 1 g 당 9배량의 생리식염수를 가해 마쇄하고 이 마쇄액에 8.1% sodium dodecyl sulfate와 20% acetate buffer (pH 3.5) 및 발색의 목적으로 0.8% thiobarbituric acid 를 가한후 95 C 에서 1시간 동안 반응 시킨후 실온에서 냉각시켜 n-BuOH: Pyridine(15:1) 을 첨가하여 15분간 원심분리 시킨후 홍색의 n-BuOH : pyridine층을 취하여 파장 532 nm에서 그 흡광도를 측정하여 표준곡선에서 그 함량을 표시하였다.
- 간조직으로 효소원을 분리하고, glutathione함량 및 -GCS 과 GR 효소 활성을 측정하였다. 결과 Fig.
- GalN 으로 간독성을 유발한 흰쥐에서 간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD효소가 각각 13.
- 그후 10 M potassium hydroxide (KOH) 30 ㎕를 첨가 한후에 30 成의 purpald solution 을 넣고 상온에서 10분간 흔들어 주었다. 그 후에 potassium periodate 10 ㎕를 넣어주고 상온에서 5분 동안 인큐베이션 후에 540 nm 에서 흡광도를 측정하여 catalase 의 활성을 측정하였다. Catalase 표준품을 사용하여 검량표준곡선을 작성하고, 이를 이용하여 피조직내 catalase의 양을 계산하였다.
- 동물을 CO2 gas 로 가볍게 마취시킨 후, 복부 정중선을 따라 개복하고 복부 대동맥에서 혈액을 채취한 전혈을 실온에서 30분간 방치하여 응고시킨 다음, 원심분리기로 3, 000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리시켜 실험에 사용하였다.
- 여과하고, rotary evaporator로 농축하였다. 배무채 시료는 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 실험동물에 100, 200 ㎎/㎏ 을 투여하였다. 대조군은 동일량의 상기의 용매를 사용하였다.
- 배무채 에탄올충이 간손상 보호효과가 있는지 평가하기위해 배무채 에탄올 추출액을 2주간 경구투여하고 D-galactosamine (GalN)으로 흰쥐에 간독성을 유발하였다. 이후 혈청을 분리하여간기능 수치를 측정한 결과, GalN 은 정상군에 비해 유의하게 모든 간기능검사 수치를 증가시켜 간독성을 유발함을 확인하였다.
- 배무채 에탄올층이 간손상 보호효과가 있는지 평가하기위해 D-galactosamine (GalN) 으로 흰쥐에 간독성을 유발하였다. 이후 혈청을 분리하여 효소활성을 측정한 결과, ALT, SDH, ALP와 LDH 는 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을 나타내었고, ASL와 γ-GT 는 배무채 에탄올층 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다 (Fig.
- 실험동물을 CO2 gas로 가볍게 마취시킨 후, 복부 대동맥에서 채혈하여 실혈사 시키고 간장을 생리식염수로 관류시켜 조직내 혈액을 제거하고 간장을 적출하여 생리식염수로 씻은 다음 여지로 간에 남아 있는 혈액 및 기타 이물질을 제거한 다음 간조직 1 g 당 4배 양의 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) 를 가하여 빙냉상에서 glass teflon homogenizer 로 마쇄하였다. 이 마쇄액을 냉장 원심분리기로 600 xg 에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상징액을 고속 원심분리기로 10, 000 xg 에서 20분간 원심분리한 후, 그 침전물은 동량의 0.
- 5 ml ninhydrin 시약을 가한후 10분간 가열하여 냉수에 냉각하고서 560 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이곳에서 non-protein-SH 에서 cysteine 을 재한값을 glutathione 의 양으로하였다.
- Kind 와 King 의 방법에 따라 kit 시약으로 측정하였다. 즉 기질인 phenyl phosphate가 함유된 0.05 M carbonate buffer(pH 10.0) 2.0 ml 를 37C 에서 3분간 preincubation 한 후 혈청 0.05 ml 를 가한 후 37C 에서 15분간 반응시킨 후 발색 및 반응 종료의 목적으로 발색시약을 첨가하고서 500 nm 에서 흡광도를 읽고 표준검량선에 준하여 효소의 활성도를 산정하였다.
- 즉기질액 (100 ml 당 lithium lactate 2.31 g 및 tris (hydroxymethyl) aminomethane 2.42 g 함유)과 정 색시 액 (100 ml당 NAD 574 mg 및 1-methylphenassium metalsulfate 3.4 ml 함유)을 1:1 로 혼합하여 37C 에서 5분간 preincubation 후에 시료를 가하여 잘 혼합하고 37C 에서 10분간 방치하여 염산으로 반응을 종료시켜 파장 570 nm 에서 흡광도를 읽고 표준곡선에 준해 그 활성도를 측정하였다.
대상 데이터
- (주) BioLink로부터 분양받아 동물사내의 명암 (12시간 light/dark cycle), 습도 (55~60%) 및 온도 (24±2℃)는 자동으로조절되는 Environmental controlled rearing system (대종기기)을 사용하여 2주 가량 충분하게 적응시켜 사육한 체중 20±2 g의 ICR계 웅성 생쥐 및 체중 200±10 g의 Sprague-Dawley계 웅성흰쥐를 사용하였고, 실험 시간 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다. 이때 효소 활성의 일중 변동을 고려하여 실험동물을 일정시간 (오전 10:00-12:00) 내에서 처치하였다.
- 배무채 시료는 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 실험동물에 100, 200 ㎎/㎏ 을 투여하였다. 대조군은 동일량의 상기의 용매를 사용하였다.
- 본 시험에 사용된 배무채(X Brassicoraphanus; BR)는 중앙대학교 Biobreed Institute 에서 공급받아 에탄올로 실온에서 추출하여 여과하고, rotary evaporator로 농축하였다. 배무채 시료는 10% Tween 80에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 실험동물에 100, 200 ㎎/㎏ 을 투여하였다.
- 시약중 NAD, NADH, NADPH, aminopyrine, aniline HCl, D-galactosamine, silymarine 및 bovine serum albumin 은 Sigma 제, malondialdehyde 는 Aldrich 제, reduced glutathione, oxidized glutathione 은 Fluka 제, p-aminophenol, 및 thiobarbituric acid 는 Katayama 제, 또한 kit 시약 중 aminotransferase, γ -glutamyltransferase는 영동제약제, sorbitol dehydrogenase, lactate dehydrogenase 는 Sigma 제를 사용하였으며, 그외 시약은 특급 및 일급을 사용하였다.
- 실험에 사용한 기구는 생화학 분석장비 (Hitachi 7600-110), 혈액 분석기 (Coulter GEN-S), UV-spectrophotometer(Shimadzu, UV-240), refrigerated centrifuge(Beckman J2-21), ultracentrifuge(Hitachi, 65-P7) 및 cold laboratory chamber(Korean manhattan, KMC-8512) 등이었다.
데이터처리
- for eight experiments. Data followed by different superscript are statistically significant by Duncan's multiple range test (p<0.05).
- for eight experiments. Data followed by different superscript are statistically significant by Duncan's new multiple range test (p<0.05).
- 모든 데이터는 평균 土 S.D.로 표시하였고, ANOVA test를 통하여 통계적 유의성은 Duncan's multiple rage test로서 검정하였으며, p<0.05 일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- Berga 와 Boida 의 방법에 따라 조제된 kit 를 사용하였다. 즉기질액 (100 ml 당 lithium lactate 2.
- Kind 와 King 의 방법에 따라 kit 시약으로 측정하였다. 즉 기질인 phenyl phosphate가 함유된 0.
- 단백질의 함량은 Lowry 등10)의 방법에 준하여 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 측정하였다.
성능/효과
- 평가하였다. GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.23±0.77, 18.40±3.17, 5.28±0.24로 정상군에 비해 유의적으로 감소하였는데, 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 을 처리하였을 때 각각 43.75±0.49, 27.75±1.45, 7.96±0.55로 GalN 처리대조군에 비해 유의하게 증가되었다. GST효소활성은 GalN 처리대조군과 배무채처리군과는 아무런 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (Fig.
- 간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD 효소가 모두 정상군에 비해 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏을 처리하였을 때 각각 9.6±2.16, 43.27±6.11, 3.46±0.21, 8.12±0.68로 GalN 처리대조군에 비해 유의적으로 저해함을 확인하였다. 또한 간조직의 효소원에서 phase II 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가한 결과 GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.
- 평가하였다. GalN 처리대조군은 XO, AO, AH, AD효소가 각각 13.30±3.42, 56.78±7.03, 3.87±0.13, 9.26±0.58로 정상군에 비해 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 을 처리하였을 때 각각 9.6±2.16, 43.27±6.11, 3.46±0.21, 8.12±0.68로 GalN 처리대조군에 비해 유의적으로 저해함을 확인하였다 (Fig. 4).
- 또한 배무채가 지질과산화산물을 감소시키는 기전을 연구하기위해 생체방어기전인 phage I, II 해독화 효소와 항산화효소에 관하여 평가하였다. Phage I 해독화 효소인 XO, AO, AD 와 AH 는정상군에 비해 GalN에 의해 활성이 증가하였고, 이를 배무채가 감소시킴을 확인하였다(Fig. 4). 또한 phage II 해독화 효소인 GST, SOD, catalase 와 GSH-Px 는 항산화효소로 잘 알려져 있는데, 이 효소들은 GalN 에 의해 활성이 정상군보다 감소하였으며, 배무채는 SOD, catalase 와 GSH-Px 의 효소활성을 현저히 증가시켰다.
- 37으로 유의적으로 억제되었다. 간조직으로 효소원을 분리하고, glutathione함량 및 -GCS과 GR효소 활성을 측정한 결과 GalN 처리대조군과 배추채 에탄올 처리군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 간조직의 효소원을 분리하여 phase I 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다.
- 이상의 결과로써 배무채가 phageⅠ과 Ⅱ에 관여하는 해독화 효소들의 활성을 조절함으로써 지질과산화물의 생성을 저해함을 알 수 있었다. 따라서 배무채는 GalN으로 유도된 간독성을 감소시켜 보간효능이 있음을 확인하였다.
- 68로 GalN 처리대조군에 비해 유의적으로 저해함을 확인하였다. 또한 간조직의 효소원에서 phase II 해독화 효소 활성에 미치는 영향을 평가한 결과 GalN 처리대조군은 SOD, catalase, GSH-Px 효소가 각각 2.23±0.77, 18.40±3.17, 5.28±0.24로 정상군에 비해 유의적으로 감소하였는데, 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 을 처리하였을 때 각각 43.75±0.49, 27.75±1.45, 7.96±0.55로 GalN 처리대조군에 비해 유의하게 증가되었다. 한편 GST 효소활성은 GalN 처리대조군과 배무채 처리군과는 아무런 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
- 2에서 보듯 GalNe 정상군에 비해 지질과산화산물인 MDA의 형성을 유도하는더〕, 이 지질과 산화산물은 oxygen radical 과 반응하여 형성된 것으로 결국은 세포를 손상시켜 기능을 저하시키고 조직손상, 노화, 염증 및 발암 등여러 가지 병리적인 현상을 야기한다17-20). 본 연구결과에서는 배무채가 GalN 으로 유도된 지질과산화물의 함량을 현저히 감소시킴을 확인하여 세포의 손상보호에 효과적이라 사료된다(Fig. 2). 또한 배무채가 지질과산화산물을 감소시키는 기전을 연구하기위해 생체방어기전인 phage I, II 해독화 효소와 항산화효소에 관하여 평가하였다.
- 간독성을 유발한다14-161. 이는 GalN 처리대조군에서 ALT, AST, SDH, -GT, ALP 와 LDH 가 모두 정상군에 비해 유의적으로 증가하여 GalN이 간독성을 유발함을 확인하였다. 반면 배무채를 전처리한 군에서는 GalN 로 유발된 간독성을 현저히 감소시킴을 확인하였다(Fig.
- 또한 phage II 해독화 효소인 GST, SOD, catalase 와 GSH-Px 는 항산화효소로 잘 알려져 있는데, 이 효소들은 GalN 에 의해 활성이 정상군보다 감소하였으며, 배무채는 SOD, catalase 와 GSH-Px 의 효소활성을 현저히 증가시켰다. 이상의 결과로써 배무채가 phageⅠ과 Ⅱ에 관여하는 해독화 효소들의 활성을 조절함으로써 지질과산화물의 생성을 저해함을 알 수 있었다. 따라서 배무채는 GalN으로 유도된 간독성을 감소시켜 보간효능이 있음을 확인하였다.
- 이후 혈청을 분리하여간기능 수치를 측정한 결과, GalN 은 정상군에 비해 유의하게 모든 간기능검사 수치를 증가시켜 간독성을 유발함을 확인하였다. 이에 ALT, SDH, ALP 와 LDH 는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을나타내었고, ASL와 -GT는 배무채 에탄올충 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다. 정상군에 비해 GalN 처리대조군에서 지질과산화물의 함량이 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군에 비해 80.
- 이후 혈청을 분리하여 효소활성을 측정한 결과, ALT, SDH, ALP와 LDH 는 배무채 에탄올층 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을 나타내었고, ASL와 γ-GT 는 배무채 에탄올층 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다 (Fig. 1).
- 흰쥐에 간독성을 유발하였다. 이후 혈청을 분리하여간기능 수치를 측정한 결과, GalN 은 정상군에 비해 유의하게 모든 간기능검사 수치를 증가시켜 간독성을 유발함을 확인하였다. 이에 ALT, SDH, ALP 와 LDH 는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을나타내었고, ASL와 -GT는 배무채 에탄올충 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다.
- 이에 ALT, SDH, ALP 와 LDH 는 배무채 에탄올충 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군과 비교하여 유의적으로 저해활성을나타내었고, ASL와 -GT는 배무채 에탄올충 100과 200 ㎎/㎏ 처리군 모두에서 유의적으로 저해활성을 나타내었다. 정상군에 비해 GalN 처리대조군에서 지질과산화물의 함량이 유의적으로 증가하였고, 이는 배무채 200 ㎎/㎏ 처리군에서 GalN 처리대조군에 비해 80.2±9.37으로 유의적으로 억제되었다. 간조직으로 효소원을 분리하고, glutathione함량 및 -GCS과 GR효소 활성을 측정한 결과 GalN 처리대조군과 배추채 에탄올 처리군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
- 정상군의 간조직중의 MDA함량은 20.8±3.76로 나타났고, GalN 처리대조군에서는 119.5±21.5로 정상군에 비해 유의하게 증가하였으나, 배무채 200 ㎎/㎏ 처리군에서는 GalN 처리대조군에 비해 80.2±9.37으로 유의적으로 억제되었다(Fig. 2).
후속연구
- 한편 GST 효소활성은 GalN 처리대조군과 배무채 처리군과는 아무런 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이상의 결과로 보아 배무채 에탄올층의 전처치는 GalN 으로 야기한 간손상에 대해 유의한 보호효과가 인정되어 향후 보간 기능성소재로 활용될 수 있을 것으로 보이나, 보다 심도 있는 연구가 지속되어야 할 것으로 사료된다.
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