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문제 정의
- 또한 식물성 섬유도 풍부하게 함유되어 있어 변비 개선이나 대장암 예방, 동맥경화 개선 등에도 효과가 있다. 본 실험에서는 자연 친화적인 항균제나 의약용 제품의 개발에 대한 높은 가능성을 가지는 실용성 식물로서 강낭콩의 기능성을 연구하기 위한 목적의 일환으로, 강낭콩을 발아시켜 얻은 유식물로부터 lectin을 분리하고, 이의 분자량, 적혈구 응집반응, 열 안정성, 최적 온도 및 최적 pH 등의 생화학적 특성을 조사하였다.
제안 방법
- Lectin의 분리과정은 0.15 M NaCl을 함유한 PBS buffer를 이용하여 추출하고, 이렇게 얻은 crude extract를 (NHO2SO4를이용해 밤새 침적시킨 후 정제하였다 Lectin의 정제 방법으로는 gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, absorbant chromatography등이 있는데, affinity chromatography는 탄수화물의 특이성을 이용하여 single step 으로 lectin을 분리하는 가장 표준이 되는 방법으로서(21), 본 실험에서는 Sepadex~G100을 이용한 affinity chromatography로 glucose에 대한 친화력을 이용하여 lectin을 분리하였다.
- 2) 25 以를 넣고 분리된 lectin 25 或를 첨가하여 2배수로 단계적 희석한 후, 2% 토끼 적혈구 용액을 25 以를 가하였다. Microtiter plate를 37 ℃ 에서 반응시킨 후, 육안과 현미경 (100 X)으로 관찰하여 lectin 활성의 유무와 효과의 정도를 판정하였다. 이때 소량의 heparin을 처리한 혈액은 0.
- pH 변화에 따른 lectin의 활성을 조사하기 위해서, 분리된 lectin을 2배 연속 회석법으로 희석한 다음, pH 2.2에서 10.0 사이의 buffer를 사용하여 혈구 응집 반응을 이용한 잔존하는 상대적인 lectin의 활성을 조사하였다. 사용한 완충액은 glycine-HCl buffer (pH 2.
- 강낭콩 유식물로부터 PBS에 의한 추출, (NH4)2SO4 침전, Sepadex G-100 column chromatography 에 의해 lectin을 분리한 다음, 이들의 생화학적 특성으로서 분자량, 적혈구 응집반응, 열 안정성, 최적 온도 및 최적 pH를 연구하였다. 이 과정에 토끼 혈액의 적혈구를 이용하여 활성을 측정하였다.
- 강낭콩 유식물로부터 crude extract를 0.15 M NaCl을 함유한 PBS 용액으로 얻고, (NH4)2SO4 를 이용하여 침전시킨 후, 투석에 의해 얻은 단백질을 Sepadex G-100 affinity gel 에 통과시키면서 gel에 결합된 lectin을 0.1 M D-glucose로 유출시켜 가장 높은 활성을 보인 분획을 얻었다(Fig. 1). 이 분획을 사용하여 lectin의 분자량, 최적반응온도, 열 안정성 및 pH 안정성을 측정하였다.
- 상등액은 모아두고 침전물은 다시 소량의 PBS에 녹여 6시간 교반한 후, 동일 조건으로 원심분리하여 상등액을 또 한번 얻었다. 모아진 상등액에 25~50%의 (NH4)2SO4 분말을 서서히 가하면서 교반 하여 용해시킨후, 160, 000 g에서 30분간 원심분리하여 얻은 침전물을 PBS에 녹인 다음, 12시간마다 교환하면서 증류수에서 48 시간, PBS에 24시간 연속적으로 투석하였다.
- 또한 혈액형에 대해 특이적 또는 비특이적인 "ctin의 성질을 이용하여 다당류, 당단백질 및 당지질 등의 분리 및 특성연구에 사용되고 있다(14). 본 실험에서는 토끼의 정상적혈구를 사용하였으며 (, 24) 이 혈구 웅집 반응 측정은 2배 연속 희석한 다음, 응집 여부를 육안으로 확인한 후 현미경하에서 최종 확인하여 최종점을 측정하였다.
- 따른 활성을 측정하였다. 분리된 lectin을 2배 연속 회석법으로 회석한 다음, 20笆에서 70℃ 범위에서 혈구 웅집반응을 측정하여 잔존하는 상대 적인 lectin의 활성을 조사하였다' 이때 최대 희석 배수를 100%의 residual activity로 하였다.
- 2 mL/min 유속으로 유출시켜 분획하였다. 분리된 분획들은 280 nm에서 흡광도를 측정하였으며, lectin의 활성은 2% 토끼 적혈구를 통한 혈구 응집반응으로 확인하였다.
- 생화학적 특성을 연구하기 위해서는 적혈구의 응집 반웅을 이용하여 측정한다. 응집 반응은 lectin의 활성 측정을 위한 중요한 과정으로, 정상 적혈구나 trypsiii을 처리한 적혈구를 사용한다(22).
- 열 안정성을 조사하기 위해, 분리된 lectin을 2배 연속 회석법으로 회석한 다음, 40℃에서 90℃ 범위에서 각각 10분간 열처리하고 식힌 후, 혈구 응집 반응을 이용하여 잔존하는 상대적인 lectin의 활성을 조사하였다.
- 연구하였다. 이 과정에 토끼 혈액의 적혈구를 이용하여 활성을 측정하였다. 어 lectin의 분자량은 46 kDa와 44 kDa로서, 각각 2 개의 subunit를 갖는 tetramer이다.
- 1). 이 분획을 사용하여 lectin의 분자량, 최적반응온도, 열 안정성 및 pH 안정성을 측정하였다.
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최적 반응 온도의 측정
정제된 lectin의 최적 반응 온도를 조사하고자 온도 변화에 따른 활성을 측정하였다. 분리된 lectin을 2배 연속 회석법으로 회석한 다음, 20笆에서 70℃ 범위에서 혈구 웅집반응을 측정하여 잔존하는 상대 적인 lectin의 활성을 조사하였다' 이때 최대 희석 배수를 100%의 residual activity로 하였다.
대상 데이터
- Separating gel 12%, stacking gel 6%로 하였으며 100 V에서 2시간 전개시켰다. Gel의 염색은 Coomassie brilliant blue R-250을, 탈색은 7.5% acetic acid 용액을 사용하였다. Weber와 Osbom(19) 의 방법에 따라 전기영동한 lectin의 분자량은 표준 단백질에 대한 상대이동도 (Rf)와 단백질 분자량에 대한 대수 값으로 부터 계산하였다.
- Lane: M, molecular weight markes; A, purified lectin. The molecular weight markers were β-galactosidase (124.0 kDa), bovine serum albumin (80.0 kDa), ovalbumin (49.1 kDa), carbonic anhydrase (34.8 kDa), soybean trypsin inhibitor (28.9 kDa), lysozyme (20.6 kDa), and aprotinin (7.1 kDa).
- Closed black circles (●) indicate lectin purified by affinity chromatography on Sephadex G-100. The molecular weight markers were β-galactosidase (A, 124.0 kDa), bovine serum albumin (B, 80.0 kDa), ovalbumin (C, 49.1 kDa), carbonic anhydrase (D, 34.8 kDa), soybean trypsin inhibitor (E, 28.9 kDa), lysozyme (F, 20.6 kDa), and aprotinin (G, 7.1 kDa).
- 시장에서 구입한 강낭콩 (Phase시ns vulgaris) 종자를 발아시킨 4주째의 유식물을 본 실험의 재료로 사용하였다. Roh와 Park(15)의 방법에 따라, 강낭콩 종자를 vermiculite, perlite 및 peat moss가 4 : 1 : 1로 들어있는 화분에 파종하여 27 土 rc 암조건 하의 배양실에서 발아시켰다.
- Weber와 Osbom(19) 의 방법에 따라 전기영동한 lectin의 분자량은 표준 단백질에 대한 상대이동도 (Rf)와 단백질 분자량에 대한 대수 값으로 부터 계산하였다. 표준 단백질로서는 f-galactosidase (124.0 kDa), bovine serum albumin (80.0 kDa), ovalbumin (49.1 kDa), carbonic anhydrase (34.8 kDa), soybean trypsin inhibitor (28.9 kDa), lysozyme (20.6 kDa) 및 aprotinin (7.1 kDa)을 사용하였다.
이론/모형
- Laemmli(18)의 방법에 따라 전기영동을 하였다. Separating gel 12%, stacking gel 6%로 하였으며 100 V에서 2시간 전개시켰다.
- Lectine Gupta와 Srivastava(16)의 방법에 따라 분리하였으며, 모든 정제과정은 4℃에서 수행하였다. 강낭콩 유식물을 이의 질량에 3배나 되는 PBS에 넣어 마쇄한 다음, 이를 거즈로 여과한 후, 40, 000 g에서 30분간 원심분리를 하였다.
- Lectin의 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Bradford(17) 방법에 의해 595 nm에서 측정하여 계산하 였다';
- 사용하였다. Roh와 Park(15)의 방법에 따라, 강낭콩 종자를 vermiculite, perlite 및 peat moss가 4 : 1 : 1로 들어있는 화분에 파종하여 27 土 rc 암조건 하의 배양실에서 발아시켰다.
- Takatsy(20)의 방법에 따라, microtiter well plate에 0.01 M PBS (pH 7.2) 25 以를 넣고 분리된 lectin 25 或를 첨가하여 2배수로 단계적 희석한 후, 2% 토끼 적혈구 용액을 25 以를 가하였다. Microtiter plate를 37 ℃ 에서 반응시킨 후, 육안과 현미경 (100 X)으로 관찰하여 lectin 활성의 유무와 효과의 정도를 판정하였다.
성능/효과
- Lectin 활성능의 최적 반응 온도를 알아내기 위해, 항온수조 20~70℃의 범위에서 활성능을 측정한 결과, 20℃부터 활성어 높아지다 30℃에서 91%로 활성능이 가장 높아 최적 반응 온도임을 알 수 있었다. 일반적으로 40℃ 이상에서 불안정한 다른 l&ctin들(27)과는 달리, 본 시료의 lectin 활성은 40~50℃까지 안정하였으며, 60℃부터 점점 낮아져 70℃ 이상에서는 활성이 떨어져 응집반응이 전혀 나타나지 않았다.
- Lectin 활성의 최적 반응 온도를 알아내기 위해, 20-70℃ 의 범위에서 15분 반응시켜 활성을 측정한 결과, 정제된 lectin의 안정적인 반응온도는 20~6TC이며, 30℃에서 91% 로 가장 높은 활성을 나타내었다. 60℃ 이후에 활성 능이 현저히 떨어져 70℃에서는 혈구 응집반응을 보이지 않았다(Fig.
- Lectin의 pH에 대한 안정성을 조사하기 위해 정제된 lectin을 pH 2.0~10.0의 범위에서 적혈구 응집반응을 통한 활성을 측정한 결과, tris buffer■를 사용한 pH 8.2에서 활성 능이 가장 높았으며, phosphate buffer# 사용한 pH 6.2에서도 비교적 안정적이었다. Acetic-sodium acetate buffer# 사용한 pH 4.
- Lectin의 열 안정성을 측정하기 위하여, 40~90C를 각각 10분간 열처리한 다음, 냉각시킨 후 적혈구 응집반응을 통한 활성을 측정한 결과, lectine 40~80℃에서 열 안정성을 가졌으며, 80℃ 이상의 온도에서는 활성이 떨어지기 시작하여 90笆에서는 혈구 응집반응을 보이지 않았다(Fig. 5).
- 0 이상에서는 낮은 활성을 나타내었다. 따라서 강낭콩 유식물로부터 분리된 lecthie 약산성 및 약알칼리성에서는 안정적이나, 강산성과 강알칼리성에는 비교적 약한 단백질임을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 lectin의 분자량을 측정한 바, 12% SDS-PAGE 전기영동상에서 2개의 band로 나타났으며, 이의분자량을 표준 단백질로부터 확인한 결과, 각각 46 kDa와 44 kDa의 값을 갖는 것으로 계산되었다. 따라서 이 lectin 은 2개의 subunit으로 구성된 tetramer로서 180 kDa의 분자량을 갖는 단백질임을 확인하였다. 밀의 배로부터 분리된 germ agghitamine 분자량 36 kDa으로 oligomer이며, 열대 콩과 작두 concanavalin A는 분자량 104 kDa의 tetramer이다 (25) .
- 6). 따라서, lectine 약한 산성과 약한 알칼리성 사이에서는 안정성이 강한 것을 알 수 있었다.
- 고무나무의 bark lectine 60℃까지 열에 안정하며(28), 유럽산 겨우살이 lectine 50C까지는 활성이 유지되었으나, 60℃ 이상에서는 활성이 완전 소멸되었다(29). 본 실험의 강낭콩 유식물 lectin에서는 40~8戏에서 비교적 열안정성을 가졌는데, 이는 작두콩 신초 lectin의 5O~6(TC(15)보다 비교적 넓은 안정성을 나타냈으며, 80℃ 이상의 온도에서는 활성 능이 떨어지기 시작하여 90C에서는 활성을 보이지 않았다. 단백질은 높은 온도에서 쉽게 변성이 일어나지만, 본 lectin 은 비교적 열에 대한 안정성이 높은 단백질로 판단되었다.
- 0에서는 활성이 소멸하였다. 본 실험의 강낭콩 유식물 lectin에서는 pH 6.0~8.0에서 안정적으로, 작두콩 종자 lectin의 결과와 일치하였으나 최적 pH는 pH 8.0으로 다르게 나타났으며. pH 4.
- 본 연구에서 lectin의 분자량을 측정한 바, 12% SDS-PAGE 전기영동상에서 2개의 band로 나타났으며, 이의분자량을 표준 단백질로부터 확인한 결과, 각각 46 kDa와 44 kDa의 값을 갖는 것으로 계산되었다. 따라서 이 lectin 은 2개의 subunit으로 구성된 tetramer로서 180 kDa의 분자량을 갖는 단백질임을 확인하였다.
- 어 lectin의 분자량은 46 kDa와 44 kDa로서, 각각 2 개의 subunit를 갖는 tetramer이다. 정제된 이 lectin의 최적 반응 온도는 30℃이며, 40~80'C에서 열 안정성을 보였다. 또한 이 lectin의 최적 pH는 pH 8.
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