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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천연자원으로부터 신경세포 보호 효과를 갖는 물질을 탐색하기 위한 목적으로 파고지의 추출물을 이용하여 항산화 작용에 의한 신경세포 보호 효과를 밝히고자 하였다.
제안 방법
- H2O2로 유도된 스트레스 상태의 각 세포주에서 파고지 추출물이 세포의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 광학현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 3). Fig.
- - 총 페놀 함량은 Gutfinger의 방법16) 변형하여 측정하였다. 즉, 파고지 추출물 1 mL를 취하여 2%(w/ V)NaKQ용액 1 mL를 가하고 3분간 방치한 후, 50% Folin-Ciocalteu 시약 0.
- - 파고지 추출물의 신경세포 보호효과를 측정하기 위한 방법으로 LDH release assay kit를 이용하여 실시하였다. 각 세포주를 1×10, cells/ mL로 맞춘 후, 100 µL씩 96 well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
- A: PC12 cells, B: N18-RE-105 cells. After MTT assay, the MTT reduction rate (mean±S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of H2O2 and PCE. ***significant vs.
- 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 각각을 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포 독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조구와 비교한 값을 나타내었다.
- 각 세포주를 96-well plate에 1×105 cells/mL 의 농도로 100 µL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹인 파고지 추출물을 각각 1, 5, 10 ㎍/mL의 농도로 처리하였다. 그리고 30분 동안 배양한 후, 0.
- 반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 µL 첨가하여 ELISA reader(Model 680, BioRad, USA)로 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조구 세포수를 100%로 하여 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 2로 나타내었다. 먼저 H2O2에 의해 유도되는 세포주의 손상에 대한 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 MTT reduction assay 방법을 이용하여 아무것도 처리하지 않은 정상군과 HQ를 처리한 대조군 그리고 H2O2 와 파고지 추출물을 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다. Fig.
- 6)에 1 ㎎ 파고지 추출물과 1%(w/v) potassium ferricyanide 용액 1 mL을 가하고 이 혼합물을 50℃, 20분간 반응을 시킨 후, 10%(w/v) trichloroacetic acid 용액 1 mL을 넣었다. 반응이 끝난 혼합물을 13,400×g에서 원심분리하여 얻은 상징액 1 mL과 증류수 1 mL을 넣고 0.1% 염화철 용액 0.1 mL 을 가하여 700㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 파고지 corylifolia Linne) 추출물의 항산화 작용에 의한 신경세포 보호효과를 확인하기 위하여 총 페놀 함량, 라디칼 소거능, 환원력 측정, MTT-dye reduction assay와 LDH release assay를 이용하였다. 총 페놀 함량, 라디칼 소거능, 환원력을 측정한 결과, 파고지 추출물 100㎍에서 각각 125.
- - 본 실험에서 사용한 세포주는 rat pheochromocytoma PC12, 신경세포계 hybridoma N18-RE105 cell로써 한국세포주은행(KCLB)과 한국생명공학연구원에서 분양받아 사용하였다. 사용된 배지로는 PC12 세포주는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 100unit/mL의 penicillin, 100 ㎍/mL의 streptomycin을 첨가하여 사용하였으며, N18-RE-105 세포주는 DMEM medium에 10% FBS과 5% HS, IxHAT supplement를 첨가하여 습도 95%의 37℃, 5% CO2 incubator (Sanyo, Japan)에서 배양하였다.
- 본 연구팀에서는 국내 . 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 항산화 작용에 의한 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 파고지 (Psoralea corylifolia Linne) 추출물로부터 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다.
- - 파고지 추출물에 대한 각 세포주의 형태학적인 관찰을 위해 6-well plate에 2×105 cells/mL로 24시간 동안 배양하였다. 파고지 추출물을 5, 10 ㎍/mL의 농도로 처리하여 30분 배양 후, 0.5 mM의 dq를 2시간 노출시켜 phase-contrast microscope(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)제품을 구입 하였으며, LDH(Lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industies, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입 하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다.
- (St Louis, MO, USA)에서 구입 하였고, Folin-Ciocalteu 시약은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 신경세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 H2O2(Hydrogen peoxide solution)와 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co.
- - 본 실험에서 사용한 세포주는 rat pheochromocytoma PC12, 신경세포계 hybridoma N18-RE105 cell로써 한국세포주은행(KCLB)과 한국생명공학연구원에서 분양받아 사용하였다. 사용된 배지로는 PC12 세포주는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 100unit/mL의 penicillin, 100 ㎍/mL의 streptomycin을 첨가하여 사용하였으며, N18-RE-105 세포주는 DMEM medium에 10% FBS과 5% HS, IxHAT supplement를 첨가하여 습도 95%의 37℃, 5% CO2 incubator (Sanyo, Japan)에서 배양하였다.
- - 본 실험에서 사용한 파고지는 2006년 11월 경남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출하여 실험에 사용하였다. 항산화력 측정에 사용된 l,l-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH)은 Sigma Chemical Co.
- , Tokyo, Japan)에서 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 메탄올 추출물은 5㎎/mL로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였으며 이 추출물을 PCE라고 명명하였다.
- 그 결과 파고지 (Psoralea corylifolia Linne) 추출물로부터 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 본 연구에서 사용된 파고지는 콩과 Leguminosae의 씨로써 형태는 콩팥모양이며 성분으로는 psoralen, psoralidin, corylifolin, angelicin, bavachin, bavachinin가 함유되어 있으며, 약리 작용으로는 면역기능 항진작용, 심혈관 확장 작용, 항균 작용, 항 돌연변이 작용, 멜라닌 대사 촉진 작용 등이 알려져 있지만15) 파고지에 관한 생리활성물질의 연구는 아직 초보적인 단계에 불과하다.
- 본 연구팀에서는 국내 . 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 항산화 작용에 의한 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다.
- (Osaka, Japan)로부터 구입 하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)에서 구입하였다. 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다
데이터처리
- - 모든 자료의 처리는 SPSS-PC+통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의 성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의 성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
이론/모형
- - DPPH 라디칼 소거능은 Jeong 등의 방법17)에 준하여 시료 0.1 mL에 4.1×10-5 M의 DPPH 용액 0.9 mL를 가한 후 상온에서 30분간 반응시켜 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거능은 아래의 식에 의해 전자 공여능으로 계산하여 백분율로 나타내었다.
- - 파고지 추출물의 수소 공여능을 DPPH 라디칼의 소거법을 이용하여 측정하였다. DPPH(2, 2-diphenyl- l-picrylhydrohydrazyl)는 안정한 라디칼을 갖는 물질로 항산화 활성이 있는 물질과 반응하면 라디칼이 소거되어 짙은 자색이 탈색되어 흡광도가 감소하는 원리를 이용하여 항산화 물질의 수소공여능을 측정하는데 널리 이용되고 있다.
- - 파고지 추출물의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay 를'실시하였다. 각 세포주를 96-well plate에 1×105 cells/mL 의 농도로 100 µL씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹인 파고지 추출물을 각각 1, 5, 10 ㎍/mL의 농도로 처리하였다.
- - 환원력은 Oyaizu의 방법18)에 따라 측 정하였으며, 항산화 물질에 대한 철 이온의 환원력을 측정한 것이다. 즉, 1 ㎎ 인산염 완충 용액(0.
성능/효과
- 결과를 Table I에 나타내었다. 5, 10, 50 및 100 ㎍의 파고지 추출물을 첨가하여 실험한 결과, 와 10 ㎍에서는 각각 0.38, 9.60%의 소거 효과를 보였고, 50 ㎍에서는 41.30%, 그리고 100 ㎍에서는 63.81%의 높은 라디칼 소거능을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 추출물의 양이 증가함에 따라 라디칼의 소거 효과도 유의성 있게 증가함을 알 수 있는데 , 이는 파고지 추출물이 항산화 활성을 가지고 있음을 의미한다.
- 먼저 H2O2에 의해 유도되는 세포주의 손상에 대한 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 MTT reduction assay 방법을 이용하여 아무것도 처리하지 않은 정상군과 HQ를 처리한 대조군 그리고 H2O2 와 파고지 추출물을 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다. Fig. 1의 결과와 같이, 대조군의 세포 생존율은 PC12 세포주 47.2%, N18-RE-105 세포주 53.1%로 나타났으나, 이때 파고지 추출물을 1, 5, 10㎍/mL의 농도로 각 세포주에 처리했을 때 PC12 세포주의 생존율은 71.8, 83.6, 90.8%로(Fig. 1A), N8-RE-105 세포주는 88.0, 88.2, 95.4%로써 (Fig. 1B) 농도 의존적으로 세포가 회복되는 수준을 확인할 수 있었다.
- 3). Fig. 3의 결과와 같이, 각 세포주의 정상군에서는 건강하게 뻗은 신경돌기의 모습을 관찰할 수 있었지만 대조군은 산화적 스트레스로 인하여 신경 돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포의 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 파고지 추출물을 5, 10 ㎍/mL를 처리했을 때 농도 의존적으로 신경세포 손상정도가 대부분 회복되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 항산화 작용에 의한 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 파고지 (Psoralea corylifolia Linne) 추출물로부터 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 본 연구에서 사용된 파고지는 콩과 Leguminosae의 씨로써 형태는 콩팥모양이며 성분으로는 psoralen, psoralidin, corylifolin, angelicin, bavachin, bavachinin가 함유되어 있으며, 약리 작용으로는 면역기능 항진작용, 심혈관 확장 작용, 항균 작용, 항 돌연변이 작용, 멜라닌 대사 촉진 작용 등이 알려져 있지만15) 파고지에 관한 생리활성물질의 연구는 아직 초보적인 단계에 불과하다.
- 3의 결과와 같이, 각 세포주의 정상군에서는 건강하게 뻗은 신경돌기의 모습을 관찰할 수 있었지만 대조군은 산화적 스트레스로 인하여 신경 돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포의 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 파고지 추출물을 5, 10 ㎍/mL를 처리했을 때 농도 의존적으로 신경세포 손상정도가 대부분 회복되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 파고지 추출물은 H2O2에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 혹은 신경세포를 보호하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
- 이는 LDH release assay에서도 일치하는 결과를 확인하였다. 그리고 광학 현미경으로 형태학적 변화를 관찰한 결과에서도 H2O2를 처리한 대조군에서는 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 확인할 수 있지만 파고지 추출물을 처리한 각 세포주에서는 신경돌기의 출현 유도를 통한 신경세포 생존을 확인할 수 있었다.
- 138의 흡광도 수치를 나타내었다. 그리고 추출물의 양이 증가함에 따라 흡광도 수치도 유의적으로 증가하는 것도 확인할 수 있었다.
- 그러나 파고지 추출물을 5, 10 ㎍/mL를 처리했을 때 농도 의존적으로 신경세포 손상정도가 대부분 회복되어 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 파고지 추출물은 H2O2에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 혹은 신경세포를 보호하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
- 138의 수치를 얻을 수 있었다. 또한 MTT reduction assay 결과, 산화적 스트레스 상태에서 PC12 세포주와 N18-RE-105 세포주에서 47.2%, 53.1%의 생존율을 보이는 반면 파고지 추출물 10 ㎍/mL 농도로 처리하였을 때 각각 90.8%, 95.4%의 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 이는 LDH release assay에서도 일치하는 결과를 확인하였다.
- 81%의 높은 라디칼 소거능을 나타냄을 알 수 있었다. 또한 추출물의 양이 증가함에 따라 라디칼의 소거 효과도 유의성 있게 증가함을 알 수 있는데 , 이는 파고지 추출물이 항산화 활성을 가지고 있음을 의미한다. 따라서 파고지 추출물은 기능성 물질로 유용하게 활용할 가능성이 있을 것으로 생각된다.
- 4%로 세포사가 감소함을 보였다. 이 결과는 파고지 추출물이에 의해 유발된 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 나타낸다.
- 2와 같다. 정상군에 비해 대조군 PC12 세포주는 44.8%, N18-RE-105 세포주는 51.3% 정도의 LDH 방출을 확인 할 수 있는데 반해 0.5 mM와 파고지 추출물 1, 5, 10 ㎍/mL를 처리한 결과 PC12 세포주는 32.9, 24.7, 23.7%, N18-RE-105 세포주는 39.2, 38.2, 38.4%로 세포사가 감소함을 보였다. 이 결과는 파고지 추출물이에 의해 유발된 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 나타낸다.
- 본 연구에서는 파고지 corylifolia Linne) 추출물의 항산화 작용에 의한 신경세포 보호효과를 확인하기 위하여 총 페놀 함량, 라디칼 소거능, 환원력 측정, MTT-dye reduction assay와 LDH release assay를 이용하였다. 총 페놀 함량, 라디칼 소거능, 환원력을 측정한 결과, 파고지 추출물 100㎍에서 각각 125.93 μM, 63.81%, 0.138의 수치를 얻을 수 있었다. 또한 MTT reduction assay 결과, 산화적 스트레스 상태에서 PC12 세포주와 N18-RE-105 세포주에서 47.
- 파고지 추출물의 총 페놀 함량은 5와 10 ㎍에서는 각각 12.04, 20.74(1M GAE이었고, 50 ㎍게서는 71.85 μM GAE, 그리고 100 ㎍서는 125.93 μM GAE로 많은 양의 페놀 화합물을 가지고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 현재, 이러한 퇴행성, 신경 질환을 치료하기 위해서 항산화물 처리, 세포 이식, 외과적 수술 등 다양한 치료법이 제시되고 있지만 대부분이 위험요소와 부작용을 나타내고 있으며 손상 기전의 복잡성 등으로 신경세포의 손상을 보호하는 치료제는 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 각종 천연자원 등에서 보다 안전하고 신경세포 보호 효과가 뛰어난 치료제의 개발이 요구된다.
- 또한 추출물의 양이 증가함에 따라 라디칼의 소거 효과도 유의성 있게 증가함을 알 수 있는데 , 이는 파고지 추출물이 항산화 활성을 가지고 있음을 의미한다. 따라서 파고지 추출물은 기능성 물질로 유용하게 활용할 가능성이 있을 것으로 생각된다.
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