선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
제안 방법
- USA)에 아래로부터 고농도 순으로 넣어준 다음, 그 위에 BT-1, BT-2 균주의 최종 펠렛 5 ml을 조심스럽게 피펫팅하였다. 25, 000 X g, 4°C 조건으로 2시간 동안 원심분리 (himac CP70MX, Japan)를 한 후, 원심분리 튜브에 형성된 균주의 내독소 밴드 위치를 확인하고, ice상에서 20 ml syringe를 이용하여 밴드를 회수하였다. Sucrose 성분을 제거하기 위해 회수한 내독소 결정체량의 3배 정도의 ethanol (4E)을 넣고, -20E에서 10시간 정도 방치한 후, 13, 000 rpm, 4°C 조건으로 15분간 원심 분리하여 최종 내독소 밴드를 회수하였다.
- 65%, 70%, 75%, 80%, 85%(w/v) sucrose sol- ution을 제작하여 filtering(pore size: 0.45 μm, Millipore, France)하고, 4°C 에서 10시간 방치한 후, 투명한 밀도구배 튜브(Nalgene Co. USA)에 아래로부터 고농도 순으로 넣어준 다음, 그 위에 BT-1, BT-2 균주의 최종 펠렛 5 ml을 조심스럽게 피펫팅하였다. 25, 000 X g, 4°C 조건으로 2시간 동안 원심분리 (himac CP70MX, Japan)를 한 후, 원심분리 튜브에 형성된 균주의 내독소 밴드 위치를 확인하고, ice상에서 20 ml syringe를 이용하여 밴드를 회수하였다.
- BT-1, BT-2 균주에 대해서 85%는 5 ml, 80%는 5 ml, 75% 는 6 ml, 70%는 5 ml, 65%는 5 ml을 각각 첨가하였다. 밀도구배 튜브 각각에 동일 농도로 서로 다른 양의 sucrose sol- ution을 고농도 순으로 넣어준 후, 25, 000 x g, 4°C 조건으로 2시간 동안 원심 분리한 결과, 65%와 70%사이의 sucrose 농도 위치에서 내독소 밴드가 형성되었다.
- BT-l, BT-2 내독소 결정체 단백질을 알칼리 완충용액 [50 mM NazCCh (pH10), 10 mM dithiotheritol (DTT) 1 mM EDTA] 으로 37°C 에서 각각 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 동안 용해한 후, solubilization activity를 멈추기 위 해서 동일량의 Laemmli sample buffer를 첨가하였고, 3분간 95°C에서 가열한 후, 다시 약 30초 동안 10, 000 rpm에서 원심 분리하여 얻어진 상등액으로 SDS-PAGE 분석을 실시하였다 [6, 7].
- 2)로 15분씩 3회 세척하는 후고정 (post-fixation) 을 수행하였다. Ethanolpropylene series를 이용하여 탈수 과정을 수행하였고, Epon 812 resin mixture를 이용하여 60°C 에서 28시간 이상 incubation(제이오텍, Korea)하였다[17]. Ultrathin section 은 LKB (BROMMA 2088 ultramicrotome) 를 이용하여 수행하였고, uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 후 투과전자현미경(JEOL CXn Japan)으로 관찰, 촬영하였다.
- 분석하였다. SDS-PAGE는 Laemmli[8] 방법에 의한 불연속 완충용액 시스템을 응용하였고, 12% seperating g이과 5% stacking 용이을 이용하여 100 V에서 3시 간 동안 수행하였으며, SDS-PAGE용 sample은 분리된 내독소 결정체 현탁액과 Laemmli sample buffe호 [0.125M Tris/HCl buffer (pH 6.8), 4%(w/v) SDSZ 10% sucrose, 10% 2-mercaptoetha- nolz 0.004% bromophenol blue]를 동일량으로 혼합한 후, 약 3분간 95°C 에서 가열하고, 다시 약 30초 동안 10, 000 rpm에서 원심 분리하여 여기서 얻어진 상등액을 취하여 사용하였다. 전기영동이 끝난 후 Coomassie brilliant blue로 1시간 동안 염색, 탈색을 거친 후, 45°C에서 60분간 건조시켜 보관하였다.
- 2)에 넣고, 1시간 고정한 후, phos phate buffer (pH 72)로 고정된 sample을 15분씩 3회 세척하는 전고정 (pre-fixation)을 수행하였다. Sample에 1% Osmium tetraxide (OsO4)를 넣고 2시간 동안 고정한 후, phosphate buffer (pH 7.2)로 15분씩 3회 세척하는 후고정 (post-fixation) 을 수행하였다. Ethanolpropylene series를 이용하여 탈수 과정을 수행하였고, Epon 812 resin mixture를 이용하여 60°C 에서 28시간 이상 incubation(제이오텍, Korea)하였다[17].
- Ethanolpropylene series를 이용하여 탈수 과정을 수행하였고, Epon 812 resin mixture를 이용하여 60°C 에서 28시간 이상 incubation(제이오텍, Korea)하였다[17]. Ultrathin section 은 LKB (BROMMA 2088 ultramicrotome) 를 이용하여 수행하였고, uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 후 투과전자현미경(JEOL CXn Japan)으로 관찰, 촬영하였다.
- 멸균한 GBY 배지(0.2% 이ucose, 0.2% yeast extract, 0.2% bacto peptone, pH 7.0) 50 ml에 BT-1 균주를 접종하여 30°C, 170 rpm(비전과학, Korea) 조건으로 16시간 동안 1차 회전 진탕 배양한 후, 동일 배지 250 ml에 1차 배양액 5 ml 을 접종하고, 1차 배양과 같은 조건으로 완전히 포자가 형성되어 autolysis가 일어날 때(일반적으로 72시간 이상) 까지광학현미경으로 일정 시간마다 관찰하면서 배양하였다. 그런 다음, 배양액을 13, 000 rpm, 4°C, 15분간 원심 분리 (BECKMAN, USA)하여 펠렛(pellet)을 얻었다.
- 돼지분변으로부터 분리하여 사용하였다. 배지의 선택은 내독소 생산이 B. thnringiensis에 따라 차이가 있고, 영양분이 고갈되어야만 포자 및 내독소가 생성되는 점을 고려하여, GBY 배지(0.2% glucose, 0.2% yeast extract, 0.2% bac- to peptone, pH 7.0)를 제조하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 내독소(6-endotoxin)를 분비하는 두 개의 B. thuringiensis 균주(여기서는 BT-1, BT-2라고 명명함) 로부터내독소 단백질을 분리하고, 전자현미경(SEM, TEM)과 SDS- PAGE 방법을 통하여 내독소결정체의 구조와 활성을 분석하였다.
- 분리된 BT-1 과 BT-2의 내독소 결정체 단백질을 알칼리 완충용액 (alkaline buffer)으로 37°C 에서 각각 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE 방법으로 분석하였다. BT-1 의 내독소 결정체 단백질은 알칼리 완충용액에 반응시킨 후, 시간이 경과함에 따라 점차로 용해되며, 3시간 후에는 거의 완전하게 용해되어 밴드를 관찰할 수 없었다(Fig.
- 불연속적 농도구배 원심분리를 통해 분리된 BT-1Z BT-2 균주의 내독소 결정체 현탁액을 aluminium mounts에 떨어뜨리고 실온에 방치하여 건조한 후, Ion sputter (HITACHI E-1010z Japan)를 이 용하여 15 mA, 15분 동안 gold coating 하였고, 주사전자현미경 (HITACHI S-3000N, Japan)을 이용하여 20 kv, working distance 6.7 mm에서 20, 000거]]로 관찰, 촬영하였다[9].
- 그런 다음, 배양액을 13, 000 rpm, 4°C, 15분간 원심 분리 (BECKMAN, USA)하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 펠렛을 washing buffer (IM NaCl, 0.01% Triton X-100, 멸균증류수)로 13, 000 rpm, 4°C, 15분간 원심 분리하여 3회 반복 세척하였으며, 최종 펠렛은 멸균증류수 5 m에 혼합한 후, 2시간마다 5 ml씩 채취하여 분광광도계 (Spectronic Genesys, USA)를 이용하여 OD580에서 흡광도를 측정하여 BT-1 과 BT-2의 생장을 측정하였다.
대상 데이터
- Bacillus thuringiensis BT-1, BT-2 균주는 경 기도의 한 축산농가의 돼지분변으로부터 분리하여 사용하였다. 배지의 선택은 내독소 생산이 B.
이론/모형
- 내독소 결정체 단백질의 분리는 불연속적 농도구배 원심분리 (discontinuous gradient centrifugation)를 이용하여 수행하였디] 13]. 65%, 70%, 75%, 80%, 85%(w/v) sucrose sol- ution을 제작하여 filtering(pore size: 0.
- 분리된 내독소 결정체 단백질 분리는 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 방법을 이용하여 분석하였다. SDS-PAGE는 Laemmli[8] 방법에 의한 불연속 완충용액 시스템을 응용하였고, 12% seperating g이과 5% stacking 용이을 이용하여 100 V에서 3시 간 동안 수행하였으며, SDS-PAGE용 sample은 분리된 내독소 결정체 현탁액과 Laemmli sample buffe호 [0.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.