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문제 정의
- 보고된 분석법은 5-FU를 분석하는 방법들이 주로 보고 되었고1,5) doxifluridine과 5-FU을 동시에 LC/MS/MS로 분석한 방법이 소개되었으나, 시료전처리 방법이 Doxifluridine과 5-Fluoroiiracil의 극성차이로 인하여 많은 종류의 유기용매를 사용하여 여러과정을 거치는 고상주줄법을 사용하며 한 시료 당 LC/MS/MS 분석 시간이 약 20분정도 길게 소요되었다. 6, 7)그러므로 본 연구에서는 비글견 혈액에 존재하는 doxifluridine과 5-FU을 동시에 분석할 수 있는 선택적이고 감도가 높은 LC/MS/MS방법을 이용하였고, 물질구조상 극성차이가 많이 나는 doxifluridine과 5-FU를 동시에 전처리하여 분석 효율을 높이기 위해 액상추출법을 개발하였다. 또한, LC 분석시간을 5분 이내로 단축하여 신속하고 정확하게 두 가지 물질을 동시에 정량할 수 있는 분석법을 개발하였다.
- 이 실험은 시료의 분석에 앞서 정량범위를 초과하는 시료에 대한 정확성을 평가하기 위한 것으로 표준혈장시료를 공혈장을 이용하여 희석하고 분석하여 영향을 평가하였다.
제안 방법
- Agilent HPLC system, Centrifuge(GS-6R, Beckman, USA), Evaporator(SPD2010-220, Thermo Electron corporation, USA) 과 API 4000 MS/MS(Applied Biosystems, USA) 를 이용하여 분석하였고, 세부조건은 ESI negative mode, curtain gas 16, nebulizing gas 60, turbo gas 50, source temperature 500℃, gas of CAD 5, entrance potential -10 Y MRM ion transfer(m/z) 및 collisional energy(CE)는 각각 doxifluridine :244.8F07.6(CE:-30V), 5-FU: 129.0^42.0(CE:-20 V), 5- CU(intemal standard): 144.9t42.1(CE:-20V)B로 분석 하였다 . 또한, 이동상은 Methanol/H, 0=20/80 (v/v), 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB-C18(2.
- Doxifluridine, 5-FU 및 내부표준물질의 농도가 각각 1.0 및 4.0 μg/ml의 표준원액을 준비하여 실온에서 24 시간 방치 후, 분석하여 얻은 피이크의 면적비를 이용하여 안정성을 평가하였다 (n=3).
- Doxifluridine과 5-FU의 농도 40, 400, 1600ng/mL의 QC시료를 전처리가 끝난 후, 냉각기(4℃)가 장착된 자동 시료 주입 장치에서 24 시간 보관 한 후에 분석하였다. 별도로 위와 같은 세농도의 QC시료를 조제하여 실온 및 - 80℃에서 보관하며 예정한 기간 후 2 set 씩을 분석하여 안정성을 평가하였다.
- u, **r o u, m o40, 400, 1600 ng/mL 농도의 doxifluridine 및 5-FU 혈장 표준액을 상기의 검체 처리방법으로 처리하여 분석하였다(n=5). 각 성분과 내부표준물질의 측정치의 표준편차를 평균값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다.
- 각 성분과 내부표준물질의 측정치의 표준편차를 평균값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(%, CV로 표시)을 구하였고 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성(%, CV로 표시)을 구하였다.
- 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(%, CV로 표시)을 구하였고 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성(%, CV로 표시)을 구하였다. 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다.
- 6, 7)그러므로 본 연구에서는 비글견 혈액에 존재하는 doxifluridine과 5-FU을 동시에 분석할 수 있는 선택적이고 감도가 높은 LC/MS/MS방법을 이용하였고, 물질구조상 극성차이가 많이 나는 doxifluridine과 5-FU를 동시에 전처리하여 분석 효율을 높이기 위해 액상추출법을 개발하였다. 또한, LC 분석시간을 5분 이내로 단축하여 신속하고 정확하게 두 가지 물질을 동시에 정량할 수 있는 분석법을 개발하였다.
- 1(CE:-20V)B로 분석 하였다 . 또한, 이동상은 Methanol/H, 0=20/80 (v/v), 컬럼은 Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1 x 100 mm, 3.5 pm), 유속은 0.2 mL/min, 주입량은 lOmia로 하여 분석하였다.
- 24 시간 보관 한 후에 분석하였다. 별도로 위와 같은 세농도의 QC시료를 조제하여 실온 및 - 80℃에서 보관하며 예정한 기간 후 2 set 씩을 분석하여 안정성을 평가하였다. 안정성의 평가는 각 혈장시료의 초기 농도값을 100%로 하고 이에 대한 상대 농도값으로 나타내었으며 ±20% 미만의 상대농도값을 나타내는 가를 기준으로 평가하였다.
- 시험방법의 회수율을 조사하기 위하여 doxifluridine 및 5- FU이 포함된 혈장시료를 우선 전처리 후, 내부표준물질을 가하여 각 성분의 회수율을 구하였고, 내부표준물질도 동일한 방법으로 혈장에 첨가하여 우선 전처리를 한 다음 농도를 알고 있는 표준물질용액을 가하여 분석하고 얻어진 크로마토그람의 피이크 면적비를 이용하여 회수율을 구하였다.
- 얻어 진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피이크 면적에 대한 doxifluridine 및 5-FU의 면적비를 구하여 미리 작성한 검량선으로 부터 혈장 중 doxifluridine 및 5-FU의 농도를 구하였다. 검량선은 선형회귀 방법으로 구하였으며 가중치는 1/x 을 이용하였다.
- 상등액 4mL를 취하여 깨끗한 test tube에 옮겨 vacuum evaporator(60oC, Ihr)에서 증발건조 시킨 다음, 잔사를 이동상 500μL에 녹여 이 중 10μL 를 LC/MS"에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피이크 면적에 대한 doxifluridine 및 5-FU의 피이크 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였으며, 40, 400, 1600ng/mL 농도의 혈장 표준시료를 이용하여 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하였고 연속하여 5일간 실험하여 일간 재현성을 구하였다.
- 2-40 μg/mL의 표준용액을 조제하였다. 이 용액을 냉동 보관하였던 blank 혈장으로 희석하여 doxifluridine 및 5-FU의 혈장 중 농도가 각각 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000ng/mL가 되도록 표준혈장시료를 만들었다. 각각의 표준혈장 100 μL에내부표준액 (5-CU, 4 μg/mL, 물) 25μL와 0.
- 따라서 대체 조제를 위한 항암제의 생물학적 동등성시험의 경우 제한적으로 동물을 사용하여 생물학적 동등성시험을 하는 것이 허용되고 있다. 이러한 약물동태/생물학적 동등성 연구를 위해서는 약물을 분석 할 수 있는 분석법이 필요함에 따라, 본연구에서는 비글견의 혈액 중 존재하는 doxifluridine과 5- FU을 동시에 즉정할 수 있는 분석법을 LC/MS/MS를 이용하여 개발하였고 실제 전임상연구, 생물학적동등성 연구에 적용할 수 있도록 생체시료분석법 validation을 실시하여 개발한 방법의 적합성을 나타내었다.
- 각 성분과 내부표준물질의 측정치의 표준편차를 평균값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다. 하루에 5번 시행하여 일내 정밀성(%, CV로 표시)을 구하였고 5일간 실험을 반복 시행하여 일간 정밀성(%, CV로 표시)을 구하였다. 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였다.
대상 데이터
- 공급받았다. 내부표준물질로 사용한 5-CU (chlorou- racil)는 Sigma-Aldrich(MA, USA)에서 구입하였고, 이동상 용매로 사용된 메탄올은 J. T. Baker(HPLC grade, USA)에서 구입하였다. 3차 증류수는 Milipore-Milli Q1M(Tokyo, JAPAN)를 이용하여 제조하였다.
- 본 연구에서 사용한 표준물질인 doxifluridine은 신풍제약(주)에서 공급받았다. 내부표준물질로 사용한 5-CU (chlorou- racil)는 Sigma-Aldrich(MA, USA)에서 구입하였고, 이동상 용매로 사용된 메탄올은 J.
데이터처리
- 구하였다. 검량선은 선형회귀 방법으로 구하였으며 가중치는 1/x 을 이용하였다.
- 별도로 위와 같은 세농도의 QC시료를 조제하여 실온 및 - 80℃에서 보관하며 예정한 기간 후 2 set 씩을 분석하여 안정성을 평가하였다. 안정성의 평가는 각 혈장시료의 초기 농도값을 100%로 하고 이에 대한 상대 농도값으로 나타내었으며 ±20% 미만의 상대농도값을 나타내는 가를 기준으로 평가하였다.
성능/효과
- 1. 내부표준물질을 5-CU로 하여 LC/MS/MS 분석한 결과 혈장 성분 등 내인성 물질의 간섭 없이 doxifluridine, 5-FU 및 5-CU가 각각 약 2.7분, 약 1.5분 및 야 1.8분에 양호하게 분리 되었다.
- 2. 혈장 시료로부터 구한 doxifluridine과 5-FU의 검량선은 각각 R2=0.99957와 R2=0.99857로 20〜2000 ng/mL에서 양호한 직선성을 나타내었고 최저 정량한계는 20 ng/mL이었다. 확립한 분석법을 검증한 결과 일내 및 일간 정확성 및 정밀성이 모두 15% 이내로 나타나 이 분석법은 충분한 감도, 정확성, 정밀성 및 안전성이 있음을 확인할 수 있었다.
- Doxifluridine에 대한 정밀성 CV%는 일내 정밀성이 3.4%이하, 일간 정밀성은 10.3% 이하로 나타났다. 또한 일내 정확성은 87.
- Doxifluridine의 평균 회수율은 75.3%, 5-FU의 평균 회수율은 57.2% 및 내부표준물질인 5-CU의 평균 회수율은 74.4% 로 나타났다. 5-FU의 경우 다소 낮은 회수율을 나타내었다.
- 따라서 시험결과, doxifluridine과 5-FU 모두 희석(x 10)에 의하여 정량성이 유지됨을 알 수 있었다.
- 또한 반복된 3회의 냉/해동 시험에서 안정한 것으로 나타났다.
- 선형회귀분석에 있어 가중치로 1/X를 사용하였는데, 가중치를 사용하지 않은 회귀식에 비하여 낮은 농도범위까지 정확한 추세를 나타내는 것으로 확인되었다. 두 경우의 실험적으로 구해진 검량선의 데이터를 Table Ⅰ, Ⅱ에 비교하여 나타내었다.
- 또한, 혈장시료의 단기 실온(24 시간) 안정성과 장기 냉동(-80。(二 30일) 안정성 및 표준원액의 실온 (24 시간) 안정성이 확보되었다. 아울러 동결해동 및 전처리 후(4℃, 24 시간) 안정성시험 결과, 각 QC 시료에 대해 각각 3회 반복 측정하여 얻은 측정 초기치에 대한 변동 계수가 15% 이내로 안정함을 나타내었다.
- 이 실험은 시료의 분석에 앞서 정량범위를 초과하는 시료에 대한 정확성을 평가하기 위한 것으로, 각 혈장시료의 이론적인 농도값에 대하여 실험적으로 구한 농도값이 ±15% 이내의 변동계수(CV%)와 상대오차(RE%)를 나타내었다. 따라서 시험결과, doxifluridine과 5-FU 모두 희석(x 10)에 의하여 정량성이 유지됨을 알 수 있었다.
- 이로부터 혈장 중 doxifluridine 및 5-FU에 대한 본 LC/ MS/MS 분석법은 생체시료의 분석에 이용될 수 있는 충분한 정확성 및 정밀성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 전처리시료 및 혈장시료의 안정성 - 전처리시료는 자동 시료 주입기(4℃)에서 24 시간 동안 안정하였으며 혈장시료는 실온 24 시간, 냉동(-80℃)조건에서 30일간 안정성을 나타내었다. 또한 반복된 3회의 냉/해동 시험에서 안정한 것으로 나타났다.
- 하였다. 타당성 검증 결과, 초기에 설정한 lOng/mL 의 농도에서는 위의 기준을 벗어나는 것으로 나타나 본 분석법의 정량한계는 20ng/mL로 결정하였다. 각 검량 선으로부터 계산된 정량한계 농도에서의 정확성과 정밀성의 결과를 Table IV에 나타내었다.
- 5에 나타내었다. 투여 후 약 2.5 시간까지 혈장 중에서 doxifluridine^- 5-FU가 검출되었으며, 5-FU의 혈중농도는 doxifluridine의 혈중농도의 약 1/10 수준이었다.
- 표준원액의 안정성 - Doxifluridine, 5-FU 및 내부표준물질의 농도 모두가 방치 전시료들과 비교해서 15% 이내 이므로 실온에서 24 시간 동안 안정한 것으로 나타났다.
- 혈장 중 doxifluridine과 5-FU에 대한 본 LC/MS/MS 분석법은 비글견에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 중분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 99857로 20〜2000 ng/mL에서 양호한 직선성을 나타내었고 최저 정량한계는 20 ng/mL이었다. 확립한 분석법을 검증한 결과 일내 및 일간 정확성 및 정밀성이 모두 15% 이내로 나타나 이 분석법은 충분한 감도, 정확성, 정밀성 및 안전성이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 혈장시료의 단기 실온(24 시간) 안정성과 장기 냉동(-80。(二 30일) 안정성 및 표준원액의 실온 (24 시간) 안정성이 확보되었다.
후속연구
- 본 연구에서 확립된 방법은 비글견 혈액 시료에서 doxi- fluridine과 5-fluorouracil을 동시에 액상추출법을 사용하여분석함으로서 이전의 고상추출법에 비하여 전처리 과정을 간단하게 하였고, 또한 LC/MS/MS를 이용하여 분석 소요 시간을 이전의 20여분에서 5분 이내로 단축시켜 혈액 중의 do- xifluridine 및 대사체인 5-fluorouracil^ 간단하고 신속하게 선택적으로 확인하는데 유용하게 사용될 수 있으므로, 비글 견을 이용한 doxifluridine의 독성동태연구 및 생물학적 동등성 연구에도 적용 할 수 있을 것으로 기대된다.
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