실크단백질의 식이 공급이 아토피 피부염 동물 모델 NC/Nga Mice 피부의 세라마이드 함량 및 관련인자 발현에 미치는 영향 Dietary Effect of Silk Protein on Ceramide Synthesis and the Expression of Ceramide Metabolic Enzymes in the Epidermis of NC/Nga Mice원문보기
본 연구에서는 아토피 피부염 동물 모델인 NC/Nga mice에 실크단백질 sericin과 fibroin을 식이 공급 후 피부의 세라마이드 함량 및 관련인자 발현 변화를 정상대조군인 BALB/c mice 및 아토피 피부염 대조군과 비교 분석하였다. 세라마이드 함량은 아토피 대조군인 CA군이 정상대조군 C군보다 현저히 낮았으나, 정제된 건조 분말을 별다른 처리 없이 그대로 실크단백질 sericin을 식이공급한 S군은 정상대조군인 C군 이상의 수준으로 높였으며, 실크단백질 fibroin(F군)은 세라마이드 함량을 정상대조군 수준이상으로 올려주지는 못하였다. 세라마이드 합성효소인 SPT의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상대조군인 C군보다 높았으나, 실크단백질 공급군인 S군 및 F군은 모두 정상대조군 C군보다 현저히 낮았다. 반면, 세라마이드 분해효소인 ceramidase의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상대조군인 C군보다 높았으나, 실크단백질을 식이섭취한 S군 및 F군에서는 정상대조군인 C군과 유사한 수준으로 CA군에 비해서는 유의적으로 낮았다. 결론적으로 실크단백질 sericin의 10주간 식이섭취는 아토피 피부염 동물모델 NC/Nga mice 표피의 세라마이드 함량을 정상대조군 수준 이상으로 증가시켰으며, 궁극적으로 표피의 장벽기능을 정상대조군의 수준으로 변화시켰다. 이는 serine이 다량 함유되어있는 실크단백질 sericin을 공급에 의해 증가되었는데, serine은 그 자체로서 보습기능을 하여 표피의 장벽기능을 보완하였기 때문에 SPT에 의한 생합성은 불필요하였으며 또한, ceramidase에 의한 세라마이드 분해를 정상수준이하로 억제하여 세라마이드의 생성보다는 분해억제에 의한 것으로 여겨진다.
본 연구에서는 아토피 피부염 동물 모델인 NC/Nga mice에 실크단백질 sericin과 fibroin을 식이 공급 후 피부의 세라마이드 함량 및 관련인자 발현 변화를 정상대조군인 BALB/c mice 및 아토피 피부염 대조군과 비교 분석하였다. 세라마이드 함량은 아토피 대조군인 CA군이 정상대조군 C군보다 현저히 낮았으나, 정제된 건조 분말을 별다른 처리 없이 그대로 실크단백질 sericin을 식이공급한 S군은 정상대조군인 C군 이상의 수준으로 높였으며, 실크단백질 fibroin(F군)은 세라마이드 함량을 정상대조군 수준이상으로 올려주지는 못하였다. 세라마이드 합성효소인 SPT의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상대조군인 C군보다 높았으나, 실크단백질 공급군인 S군 및 F군은 모두 정상대조군 C군보다 현저히 낮았다. 반면, 세라마이드 분해효소인 ceramidase의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상대조군인 C군보다 높았으나, 실크단백질을 식이섭취한 S군 및 F군에서는 정상대조군인 C군과 유사한 수준으로 CA군에 비해서는 유의적으로 낮았다. 결론적으로 실크단백질 sericin의 10주간 식이섭취는 아토피 피부염 동물모델 NC/Nga mice 표피의 세라마이드 함량을 정상대조군 수준 이상으로 증가시켰으며, 궁극적으로 표피의 장벽기능을 정상대조군의 수준으로 변화시켰다. 이는 serine이 다량 함유되어있는 실크단백질 sericin을 공급에 의해 증가되었는데, serine은 그 자체로서 보습기능을 하여 표피의 장벽기능을 보완하였기 때문에 SPT에 의한 생합성은 불필요하였으며 또한, ceramidase에 의한 세라마이드 분해를 정상수준이하로 억제하여 세라마이드의 생성보다는 분해억제에 의한 것으로 여겨진다.
Ceramide rich intercellular lipid lamellae are thought to be particularly important in maintaining the structural integrity of epidermal barrier. Ceramide is synthesized de novo by serine palmitoyltransferase (SPT) phospholipid intermediates, serine and palmitic acid persist within the stratum corne...
Ceramide rich intercellular lipid lamellae are thought to be particularly important in maintaining the structural integrity of epidermal barrier. Ceramide is synthesized de novo by serine palmitoyltransferase (SPT) phospholipid intermediates, serine and palmitic acid persist within the stratum corneum. The ceramide which is synthesized is degraded with fatty acid and sphingosine by degradative enzyme ceramidase. The depletion of ceramide in stratum corneum was reported in the atopic dermatitis. As an effort to search for the dietary source for improving the level of ceramide in epidermis, the dietary effects of various-typed silk protein were compared. Seventy male NC/Nga mice, an animal model of atopic dermatitis, were divided into seven groups: group CA as an atopic control with control diet, group S: 1% crude sericin diet, group F: 1% crude fibroin diet, group PS : peptide pattern of sericin(Mw 5000), group PF: peptide pattern of fibroin (Mw 1500), group AS: manufactured the same as amino acid profile of sericin and group AF: manufactured the same as amino acid profile of fibroin. Ten male BALB/c mice were served as group C (control group) control diet. All mice were fed on diet and water ad libitum for 10 weeks. Dry skin condition was established in group CA as ceramide content was decreased. Despite a marked decrease of mRNA and prorein expression of SPT, enzyme do novo synthesis, ceramide content of group S was dramatically increased by inhibiting the mRNA and protein expression of degradative enzyme ceramidase. However, dietary supplementation of crude silk fibroin protein (group F) and in other groups that were supplemented with either amino acid or peptide type of sericin or fibroin did not increase the level of ceramide. Together, our data demonstrate that dietary supplementation of crude sericin is more effective at improving ceramide level in epidemis of NC/Nga mice.
Ceramide rich intercellular lipid lamellae are thought to be particularly important in maintaining the structural integrity of epidermal barrier. Ceramide is synthesized de novo by serine palmitoyltransferase (SPT) phospholipid intermediates, serine and palmitic acid persist within the stratum corneum. The ceramide which is synthesized is degraded with fatty acid and sphingosine by degradative enzyme ceramidase. The depletion of ceramide in stratum corneum was reported in the atopic dermatitis. As an effort to search for the dietary source for improving the level of ceramide in epidermis, the dietary effects of various-typed silk protein were compared. Seventy male NC/Nga mice, an animal model of atopic dermatitis, were divided into seven groups: group CA as an atopic control with control diet, group S: 1% crude sericin diet, group F: 1% crude fibroin diet, group PS : peptide pattern of sericin(Mw 5000), group PF: peptide pattern of fibroin (Mw 1500), group AS: manufactured the same as amino acid profile of sericin and group AF: manufactured the same as amino acid profile of fibroin. Ten male BALB/c mice were served as group C (control group) control diet. All mice were fed on diet and water ad libitum for 10 weeks. Dry skin condition was established in group CA as ceramide content was decreased. Despite a marked decrease of mRNA and prorein expression of SPT, enzyme do novo synthesis, ceramide content of group S was dramatically increased by inhibiting the mRNA and protein expression of degradative enzyme ceramidase. However, dietary supplementation of crude silk fibroin protein (group F) and in other groups that were supplemented with either amino acid or peptide type of sericin or fibroin did not increase the level of ceramide. Together, our data demonstrate that dietary supplementation of crude sericin is more effective at improving ceramide level in epidemis of NC/Nga mice.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 아토피 피부염 동물 모델인 NC/Nga mice에서 (14,22) 실크단백질 sericin 및 fibroin의 식이 공급에 따른 피부의 세라마이드 함량 및 관련 효소의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
제안 방법
0% agar ose gel에서 확인하였다. PCR 생성물의 양은 housekeeping gene인 GAPDH를 기준으로 정량하였으며 imaging densi- tometer(Labwork version 4.6 UVP, CA)를 사용하여 측정하였다.
, Korea)를 4℃에서 overnight incubation 한 후 PBST로 15분씩 3회 세척하였다. Peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하고 발색은 ECL hyperfilm으로 확인하였다. 각 band의 intensity는 β-actin의 발현을 기준으로 % control하여 imaging densi-tometer(Labwork version 4.
Rabbit polyclonal 1차 항체 SPT는 primer sequence (GeneBank accession no. D19271)를 기준으로 하여 whole protein(560 amino acids)의 hydrophobicity와 antigenicity를 확인한 결과 547~560 amino acid인 DRPFDETTYEETED (14mer)부분이 c-term 끝 부분에 위치하고 있고 anti- genicily와 hydrophobicity가 상대적으로 높아 항원으로 사용할 peptide로 제작하였고, rabbit polyclonal 항체 ce- ramidase는 primer sequence(GeneBank accession no. AI662009)를 기준으로 SPT와 같은 방법으로 진행하여 167 amino acid인 RTEYKKIRDDDLRH 부분에 carrier protein과의 conjugation을 위해 임의로 cystine을 첨가하여 RTEYKKIRDDDLRH-C(15mer)< 항원으로 사용할 pep-tide로 제작하여 rabbit에 주입하였다. 항체 생성여부는 효소면역측정법으로 확인하고 심장 채혈 후 얻은 total serum IgG를 affinity column(Affi-gel, Bio-Rad)을 사용하여 정제한 후 항체로 사용하였다(Lab Frontier, Korea).
1% diethylpyrocarbonate(DEPC) 증류수를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 가열하여 cDNA를 합성하였다. SPT(GeneBank accession no. D19271)(10 pmol/uL)의 sense primer(5/ GACTGAGCCTTTCTGGTGCT 3') 및 an tisense primer(5z AATGCCATTTGGAGTGAAGG 3')와 ceramidase(GeneBank accession no. AI662009)(10 pmol/uL) 의 sense primer(5, TGTGGAGCAGAAAATCAAGC 3') 및 antisense primer(5, CAACATCATGGGGCACTTAG 3') 를 각각 합성 된 cDNA(l μL)에 0.1% DEPC-Water와 함께 PCR-premix에 첨가하여 denaturation은 94℃에서 1분, annealing은 65℃에서 1분, extension은 72℃에서 1분 동안 35~38 cycle(SPT: 35 cycle, ceramidase: 38)로 진행하였다. SPT와 ceramidase의 fragment size는 각각 159 bp (SPT), 103 bp(ceramidase)이며 PCR 생성물은 3.
1% DEPC-Water와 함께 PCR-premix에 첨가하여 denaturation은 94℃에서 1분, annealing은 65℃에서 1분, extension은 72℃에서 1분 동안 35~38 cycle(SPT: 35 cycle, ceramidase: 38)로 진행하였다. SPT와 ceramidase의 fragment size는 각각 159 bp (SPT), 103 bp(ceramidase)이며 PCR 생성물은 3.0% agar ose gel에서 확인하였다. PCR 생성물의 양은 housekeeping gene인 GAPDH를 기준으로 정량하였으며 imaging densi- tometer(Labwork version 4.
분리된 표피 조직 에 tri- zol reagent(Gibco BRL)를 이용하여 RNA를 분리 정제하고 파장 260 nm에서 정량하였다. Total RNA(1 μg/nL)를 65℃ 에서 10분간 가열하고, 4℃에서 10분 동안 방치한 후 1 11L oligo(dT) 15 primer(0.5 yg/pL), 1 liL M-MLV RT(10 unit/ μL: promega, USA), 1 pL RNase inhibitor(20~40 unit/μL: promega, USA), 10 μL 5 X RT buffer(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KC1, 15 mM MgCh), 5 pL 2.5 mmol/L dNTP mixture, 0.1% diethylpyrocarbonate(DEPC) 증류수를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 가열하여 cDNA를 합성하였다. SPT(GeneBank accession no.
5)와 함께 polytron으로 분쇄하고 동량의 folch 용으g (chlrofomi:methanol=2:l v/v)을 가한 후 3, 000X g, 5분 동안 원심분리하였다. 2회 반복 후 모아진 하층액을 N? gas로 건조시킨 후 2% isopropanol을 함유한 hexane을 첨가하여 필터링 (0.45 um, Sartorius, Germany)하였다. 이후 sample을 HPLC(waters 1525, Waters Co.
45 pm, Sartorius, Germany)을 하여 잔유물을 제거한 후 평균분자량(Mw)이 1,500 내외인 실크단백질 fibroin을 얻었다(PF군). 각각의 분자량은 gel permeation chromatography(GPC) 장치 (Viskotec, USA)를이용하였으며, 0.2 N NaOH를 완충용액으로 사용하여 re fractive index(RI)로 환산하였다. 이러한 과정을 거쳐 얻어진 모든 sericin과 fibroin 시료는 -5℃ 내외를 유지하는 감압건조 장치 (model: Vacuum Freeze Dryer, 삼원 냉열사)를 이용하여 수용성 분말의 형태로 얻었다(23).
공기청정시설이 없는 일반 환경에서 자연적으로 아토피피부염 이 발병하는 5주령의 수컷 NC/Nga mice(14,22) 30 마리 와 5주령의 수컷 BALB/c mice 10마리를 (주)중앙실험동물(서울)로부터 공급받아 실험 식이로 사육하기 전 1주 동안 고형배합 사료로 적응시킨 후 난괴법으로 군을 나누어 각 식이와 물을 마음껏 섭취하도록 하였다. 면역 질환 연구에 상용되고 NC/Nga mice에 대한 정상대조군으로 자주 이용되는 BALB/c mice를 본 연구에서도 정상 대조군으로 하였다.
또한 이 sericin에 단백질 분해효소 (Novo, Denmark)를 3%(v/v) 첨가한 후, 질소가스 충진 조건 및 55℃에서 12시간 처리하였다. 그 후 불활성 처리를 하여 필터 링 (0.45 iim, Sartorius, Germany) 및 동결 건조의 과정을 거쳐 평균 분자량(Mw) 5,000 내외의 실크단백질 sericin을 회수하였다(PS군).
본 연구에서는 아토피 피부염 동물 모델인 NC/Nga mice에 실크단백질 sericin과 fibroin을 식 이 공급 후 피부의 세라마이드 함량 및 관련인자 발현 변화를 정상대조군인 BALB/c mice 및 아토피 피부염 대조군과 비교·분석하였다. 세라마이드 함량은 아토피 대조군인 CA군이 정상 대조군 C군보다 현저히 낮았으나, 정제된 건조 분말을 별다른 처리 없이 그대로 실크단백질 sericin을 식이공급한 S 군은 정상 대조군인 C군 이상의 수준으로 높였으며, 실크단백질 fibroin(F군)은 세라마이드 함량을 정상대조군 수준 이상으로 올려주지는 못하였다.
정제된 건조 분말을 별다른 처리 없이 그대로 첨가한 sericin군(S군)과 fibroin군(F군), sericin 분자량을 5,000(PS군) 및 fibroin 분자량을 l,500(PF 군)으로 조절한 저분자량의 펩타이드 형태로 식이에 첨가한 구 sericin과 fibroin의 아미노산 조성비율과 동일하게 제조하여 아미노산 형태의 sericin(AS군)과 fibroin(AF군)을 식이 에 첨가하여 공급한 군으로 실험군을 나누었다. 실크 단백질을 첨가하지 않은 정상식이를 10주간 공급받은 NC/Nga mice(control A군: CA군) 및 BALB/c mice(control 군: C군)는 각각 아토피 피부염대조군 및 정상대조군이었다. C군과 CA군은 전체 식이무게 중 23%에 상응하는 단백질을 casein 으로부터 공급받았다.
실험동물에서 채취된 피부 생검 조직의 단백질 정량은 bovine serum albumin (BSA)-S- 표준으로 한 bio-rad pro tein assay를 이용하여 595 nm에서 홉광도를 측정하여 정량한 다음 10% PAGE/SDS gel에서 전기 영동시킨 후 nitro cellulose membiaie에 흡착시켰다. 위의 방법으로 제작된 1차 항체 (SPT, ceramidase: Lab Frontier.
따라 제조하였다(F군). 이 용액을 sephadex G-25 gel filtration chromatography(Pharmacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 fibroin과 염을 완전히 분리하였으며, 아울러 이 fibroin 용액에 3%(v/v)의 단백질분해효소(Nove, Denmark)를 첨가하여 질소가스 충진 조건 및 55℃에서 24시간 가수분해하고, 100℃에서 5분간 효소의 불활성 처리를 한 후, 필터링(0.45 pm, Sartorius, Germany)을 하여 잔유물을 제거한 후 평균분자량(Mw)이 1,500 내외인 실크단백질 fibroin을 얻었다(PF군). 각각의 분자량은 gel permeation chromatography(GPC) 장치 (Viskotec, USA)를이용하였으며, 0.
이렇게 얻어진 수용성 분말의 형태의 시료를 아미노산 sodium citrate loading buffer(0.2 M, pH 2.2, Biochrom Ltd.)에 녹인 후 필터링(0.45 ym, Sartorius, Germany) 하여자동 아미노산 분석 장치 (Pharmacia Biotec. Biochrom 20 Plus)를 이용하여 18종 아미노산 표준 샘플에 대한 아미노산 함량을 분석하였다.
45 um, Sartorius, Germany)하였다. 이후 sample을 HPLC(waters 1525, Waters Co., USA)를 이용하여 분석하였다. 분석에 이용한 column은 type UG 120(250 mm X 4.
혼합하여 10주간 공급하였다. 정제된 건조 분말을 별다른 처리 없이 그대로 첨가한 sericin군(S군)과 fibroin군(F군), sericin 분자량을 5,000(PS군) 및 fibroin 분자량을 l,500(PF 군)으로 조절한 저분자량의 펩타이드 형태로 식이에 첨가한 구 sericin과 fibroin의 아미노산 조성비율과 동일하게 제조하여 아미노산 형태의 sericin(AS군)과 fibroin(AF군)을 식이 에 첨가하여 공급한 군으로 실험군을 나누었다. 실크 단백질을 첨가하지 않은 정상식이를 10주간 공급받은 NC/Nga mice(control A군: CA군) 및 BALB/c mice(control 군: C군)는 각각 아토피 피부염대조군 및 정상대조군이었다.
대상 데이터
실크 단백질을 첨가하지 않은 정상식이를 10주간 공급받은 NC/Nga mice(control A군: CA군) 및 BALB/c mice(control 군: C군)는 각각 아토피 피부염대조군 및 정상대조군이었다. C군과 CA군은 전체 식이무게 중 23%에 상응하는 단백질을 casein 으로부터 공급받았다. 반면, S군과 F군 그리고 PS군, PF군 및 AS군, AF군은 22%의 단백질은 casein으로 나머지 1%는 형태를 달리한 실크단백질 sericin과 fibroin으로부터 각각 공급받았다.
PCR-premix는 (주)바이오니아에서 구입하였고 AMV re verse transciptase, RNasin ribonuleas inhibitor는 (주)서린바이오사이 언스에서 구입 하였다. Random primer(50 pmol/μL), 100 bp DNA ladder marker는 (주)대명사이언스에서 구입하였고, protein marker는 (주)큐어바이오에서 구입하여 별다른 정제과정 없이 그대로 사용하였다.
언스에서 구입 하였다. Random primer(50 pmol/μL), 100 bp DNA ladder marker는 (주)대명사이언스에서 구입하였고, protein marker는 (주)큐어바이오에서 구입하여 별다른 정제과정 없이 그대로 사용하였다.
누에고치는 가잠(Bcmbyx mori)을 상엽으로 사육하여 얻은 누에고치를 정련하여 준비하였다. 실크단백질 sericin은 정련 과정에 의해 추출되었는데, 먼저 누에고치에 30배량의 물을 첨가하고 110℃에서 5시간 가열한 후 필터 링(Whatman No.
각 식이와 물을 마음껏 섭취하도록 하였다. 면역 질환 연구에 상용되고 NC/Nga mice에 대한 정상대조군으로 자주 이용되는 BALB/c mice를 본 연구에서도 정상 대조군으로 하였다. 사육실의 온도는 22±1℃, 습도는 60±5%를 유지하였고, 매일 광주기와 암주기가 12시간이 되도록 조절하였다.
데이터처리
0 program(Statistical package for social science)을 이용하여 통계 처리하였다. 결과는 각 군별 평균과 표준오차로 나타내었고, 각 실험 군 간의 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 general linear model(GLM) test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.
실험 결과의 자료는 SPSS, Ver 12.0 program(Statistical package for social science)을 이용하여 통계 처리하였다. 결과는 각 군별 평균과 표준오차로 나타내었고, 각 실험 군 간의 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 general linear model(GLM) test로 p<0.
이론/모형
또한, 위 과정 에서 남은 fibroin을 Madyarov 등(23)의 방법에 따라 제조하였다(F군). 이 용액을 sephadex G-25 gel filtration chromatography(Pharmacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 fibroin과 염을 완전히 분리하였으며, 아울러 이 fibroin 용액에 3%(v/v)의 단백질분해효소(Nove, Denmark)를 첨가하여 질소가스 충진 조건 및 55℃에서 24시간 가수분해하고, 100℃에서 5분간 효소의 불활성 처리를 한 후, 필터링(0.
성능/효과
10주간의 각 식이 공급 후 HPLC를 이용하여 측정된 CA 군의 세라마이드 총 함량은 정상대조군인 C군에 비해 유의적으로 낮았다(Fig. 2). 이는 아토피 피부염 발병 등 내·외부환경의 여러 자극에 의해 피부장벽기능이 손상되면 세라마이드 함량이 현저히 감소함을 보고한 여러 사전 보고들 (8, 10,15,26)과 일치하는 결과이었다.
반면, 세라마이드 분해효소인 ceramidase의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상대조군인 C군보다 높았으나, 실크 단백질을 식이섭취한 S군 및 F군에서는 정상대조군인 C군과 유사한 수준으로 CA군에 비해서는 유의적으로 낮았다. 결론적으로 실크단백질 sericin의 10주간 식이섭취는 아토피 피부염 동물모델 NC/Nga mice 표피의 세라마이드 함량을 정상대조군 수준 이상으로 증가시 켰으며, 궁극적으로 표피의 장벽기능을 정상대조군의 수준으로 변화시켰다. 이는 serine이 다량 함유되어있는 실크단백질 sericin을 공급에 의해 증가되었는데, serine은 그 자체로서 보습기능을 하여 표피의 장벽기능을 보완하였기 때문에 SPT에 의한 생합성은 불필요하였으며 또한, ceramidase에 의한 세라마이드 분해 를 정상수준 이하로 억제하여 세라마이드의 생성 보다는 분해억제에 의한 것으로 여겨진다.
31 g/kg diet) 보다 낮아 손상된 피부의 장벽기능을 완벽히 보완할 수준은 아니 었던 것으로 여겨진다. 또한, sericin과 fibroin을 저 분자량으로 조절하여 펩타이드 형 태로 식이공급한 군(PS, PF)과 sericin과 fibroin의 아미노산 비율대로 제조하여 아미노산 형태로 식이공급한 군(AS, AF)은 모두 정상대조군인 C군에 비해 세라마이드 총 함량이 현저히 낮았다.
세라마이드 합성효소인 SPT의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상 대조군인 C군보다 높았으나, 실크단백질 공급군인 S군 및 F 군은 모두 정상대조군 C군보다 현저히 낮았다. 반면, 세라마이드 분해효소인 ceramidase의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상대조군인 C군보다 높았으나, 실크 단백질을 식이섭취한 S군 및 F군에서는 정상대조군인 C군과 유사한 수준으로 CA군에 비해서는 유의적으로 낮았다. 결론적으로 실크단백질 sericin의 10주간 식이섭취는 아토피 피부염 동물모델 NC/Nga mice 표피의 세라마이드 함량을 정상대조군 수준 이상으로 증가시 켰으며, 궁극적으로 표피의 장벽기능을 정상대조군의 수준으로 변화시켰다.
세라마이드 함량은 아토피 대조군인 CA군이 정상 대조군 C군보다 현저히 낮았으나, 정제된 건조 분말을 별다른 처리 없이 그대로 실크단백질 sericin을 식이공급한 S 군은 정상 대조군인 C군 이상의 수준으로 높였으며, 실크단백질 fibroin(F군)은 세라마이드 함량을 정상대조군 수준 이상으로 올려주지는 못하였다. 세라마이드 합성효소인 SPT의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상 대조군인 C군보다 높았으나, 실크단백질 공급군인 S군 및 F 군은 모두 정상대조군 C군보다 현저히 낮았다.
세라마이드 함량은 아토피 대조군인 CA군이 정상 대조군 C군보다 현저히 낮았으나, 정제된 건조 분말을 별다른 처리 없이 그대로 실크단백질 sericin을 식이공급한 S 군은 정상 대조군인 C군 이상의 수준으로 높였으며, 실크단백질 fibroin(F군)은 세라마이드 함량을 정상대조군 수준 이상으로 올려주지는 못하였다. 세라마이드 합성효소인 SPT의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상 대조군인 C군보다 높았으나, 실크단백질 공급군인 S군 및 F 군은 모두 정상대조군 C군보다 현저히 낮았다. 반면, 세라마이드 분해효소인 ceramidase의 mRNA 및 protein 발현은 아토피 대조군인 CA군은 정상대조군인 C군보다 높았으나, 실크 단백질을 식이섭취한 S군 및 F군에서는 정상대조군인 C군과 유사한 수준으로 CA군에 비해서는 유의적으로 낮았다.
3에 나타내었다. 아토피 피부염이 유발되어 피부 보습 및 장벽기능이 손상되어있는 CA군이 정상 대조군인 C군에 비해 SPT의 mRNA와 protein의 발현이 유의적으로 증가하였다. 이는 중 파장자외선(UVB) 노출에 의한 표피손상 시 세라마이드 합성효소인 SPT mRNA와 protein 발현의 증가함을 보고한 Farrell 등(34)의 연구 보고와 일치하는 결과로서 아토피 피부염 유발로 인한 손상된 NC/Nga mice 피부의 장벽기능을 보완하기 위해 세라마이드의 합성이 일어나고 있음을 의미한다.
이상을 종합하면, 세라마이드 총 함량이 감소되어있는 아토피 피부염 동물모델에 serine이 다량 함유되어있는 실크 단백질 sericin을 공급에 의해 증가되었는데, 이는 serine이 그 자체로서 보습기능을 하여 표피의 장벽기능을 보완하여 SPT에 의한 생합성은 불필요하였으며, ceramidase에 의한 세라마이드 분해는 정상수준이 하로 억제하여 세라마이드의 생성보다는 분해 억제를 통한 것으로 보여진다. 증가된 세라마이드 함량에 대한 더 명확한 기전을 확립하기 위해서는 표피의 과립층에서 세라마이드 전환에 관여하는 주 효소인 SM deacylase와 sphingomyelinase 및 B-glucosylcere- brosidase에 대한 추후의 심도 깊은 연구가 필요할 것으로 생각되어지나, 본 연구에서 제시된 sericin의 식이 섭취 후증가된 세라마이드 함량은 sericin의 피부 보습 증진을 위한 건강기능식품 소재로의 개발 가능성을 제안한다.
이유는 단백질유래의 기능성 펩타이드는 protease류에 의해 분해되는데 활성부위 전후에 protease 절단부위가 없는 경우는 활성을 가지는 아미노산 서열과는 전혀 다른 아미노산 서열을 나타낼 수 있기 때문이다. 이와 같이 본 연구에서도 AS·AF군은 아미노산을 혼합하여 공급하였기 때문에 펩타이드 형태에 비해 체내 흡수가 불리하였고, 비록 PS·PF군은 저분자량의 펩타이드 형태로서 흡수는 용이하였을지 모르나 효소의 기질특이성에 기인한 규칙적인 아미노산 서열로 인해 생리활성을 지니는 아미노산 서 열을 가지지 못했기 때문에 세라마이드 함량을 정상 수준으로 올려주지 못한 것으로 여겨진다.
1에 나타내었다. 정련 과정을 통해 추출한 후 별다른 처리를 하지 않은 seiicin(S군)과 fibroin(F군)의 평균 분자량은 각각 65,000과 101,700이었고, 정련한 sericin 및 fibroin에 단백질 분해효소를 이용하여 분해한 펩타이드의 분자량은 5,410(PS군)과 l,490(PF군)이었다. 식품 단백질 유래의 기능성 펩타이드는 구조 및 아미노산 서열에 따라 다양한 생리활성을 지니고 있어(25) 단백질의 형태에 따라 생리활성에 미치는 영향이 다를 수 있기에 고분자의 펩타이드(S군, F군) 및 저분자의 펩타이드(PS군, PF군)를 제조하여 그 효능을 비교·분석하는 것은 의미있는 것으로 여겨진다.
Serine은 에너지 대사와 관련하여서는 glycine으로 전환(27)되어 에너지원으로 사용되나, 표피에서는 에너지원으로의 역할보다는 수분유지를 위한 자연보습인자로서의 기능을 우선 수행한다. 표피에서 serine의 농도가 glycine에 비해 월등히 높다는 본 연구의 사전보고(28) 및 기니피그 피부와 인간 피부에서 현저히 높은 serine의 함량을 보고한 Tabachnick와 Labadie(29)의 연구 결과로 볼 때 본 연구에 사용된 sericin에 다량 함유되어 있는 serine이 손상된 표피의 장벽기능을 보완한 것으로 여겨진다.
후속연구
31 g/kg diet)의 ser-ine의 함량에 비해 낮아, 아토피 피부염으로 인해 손상된 피부의 장벽기능을 완벽히 보완할 수준의 양은 아닌 것으로 여겨진다. 또한, 아토피 피부염환자의 손상된 표피에서 sphingomyelin deacylase(SM deacylase)의 활성을 유의적으로 높여 sphingomyelin 및 glucosylceramide가 세라마이드로 전환되는 것을 저해한다는 Hara 등(38)의 연구 결과는 본 연구에서 표피의 과립층에서 SM deacylase에 의해 세라마이드로의 전환이 저해되었을 가능성도 있어, 이에 대한 추후 연구를 통해 SM deacylase의 발현정도의 확인이 필요할 것으로 생각되어진다.
하지만, SPT에 의한 생합성이 일어나지 않았음에도 불구하고 S군의 세라마이드 총 함량이 증가하였다. 이는 생합성 경로 이외에 표피의 과립 층에 다량 존재하는 sphingomyelin과 glucosyl ceramide에서 sphingomyelinase 및 J3-glucosylcerebrosidase에 의해 전환될 수 있음을 보고한 Holleran 등(36)과 Takagi 등(37)의 연구와 특히, 각질층에 존재하는 대부분의 세라마이드는 sphingomyelin과 glucosylceramide에서 전환되어 축적된 것임을 보고한 여러 사전보고(36-39)에 따라 sphingomyelin과 glucosylceramide가 전환되어 축적된 것으로 생각할 수 있으나, 이에 대한 추후 연구가 필요할 것으로 사료된다.
분해 억제를 통한 것으로 보여진다. 증가된 세라마이드 함량에 대한 더 명확한 기전을 확립하기 위해서는 표피의 과립층에서 세라마이드 전환에 관여하는 주 효소인 SM deacylase와 sphingomyelinase 및 B-glucosylcere- brosidase에 대한 추후의 심도 깊은 연구가 필요할 것으로 생각되어지나, 본 연구에서 제시된 sericin의 식이 섭취 후증가된 세라마이드 함량은 sericin의 피부 보습 증진을 위한 건강기능식품 소재로의 개발 가능성을 제안한다.
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