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문제 정의
- 본 연구에서는 약쑥의 항산화 효과를 조사하고자 약쑥 열수추출믈을 극성에 따른 순차 용매 분획하여 총 플리페놀및 풀라보노이드 함량, 활성산소종 소거능 및 간 mxtosome 을 이용한 지질과산화 억제 효과 동을 관찰하였다.
가설 설정
- 1)ICfio value is the concentration of sample required for 50% inhibition.
제안 방법
- 반옹용액은 10 mM FeSO4 . 7HQ 용액, 10 mM EDTA 용액과 10 mM 2-deoxyribose 용액을 각각 200 mL를 첨가한 후각 분획 믈 200 g」L오* 0.1 M phosphate buffer 용액 (pH 7.4) 1 rr丄를 넣어 혼합시 킨 후 총 부피가 1.8rr丄가 되도록 조제하였다. 반응용액 에 10 mM H2O2 200 HL 를 넣어 37℃ 에서 4시간 동안 반응시킨 후 2.
- Hydroxyl radical 소거활성은 2-deoxyribose oxidation 방법(20)을 변형하여 축정하였다. Hydroxyl radicale FeSO4 .
- Nitric oxide radical 소거활성은 Sreejayan과 Rao(21) 의 방법을 변형하여 다음과 같이 축정하였다 각 농도별 분획믈은 5 mM sodium nitroferricyanide dihydrate(SNP)와 혼합하여 25℃에서 150분간 반응한 후 반응혼합액을 96-well micro plate에 주입하여 1% sulphanilamde(in 5% phosphoric acid) 와 0.1% naphthylethylene di amine-dihy-drochlonde(l:l, v/v)를 넣어 싶온에서 10분간 반응한 후 540 nm에서 흡광도를 축정 하였다. 이때 표준곡선은 NaNCh 를 농도별로 조제하여 사용하였다.
- 전자공여능은 Blois와 Banda(17)의 방법을 변형하여 DFFH에 대한 전자공여 효과로 시료의 환원력을 축정하였다 각 분획믈을 농도별로 99% 메탄율에 용해시 킨 후, 800 UL를 취 하여 메 탄율에 녹인 DFFH용액 (0.15 mM) 200 况와혼합하여 30분 경과 후에 517nm에서 흡광도를 축정하였다.
- 총 플리페놀 함량은 Folin-Denis법(15)을 변형하여 다 옴과 같이 축정하였다 즉, 각 농도별 분획믈 1 mL에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10% Na2CO3 용액을 각 1 血씩 차례로 가한 다옴 싶온에서 1시간 정치한 후 UV/visible spec-trophotometer(UVIKON 922, Kontron, Italy) 를 사.용하여 700 nm에서 흡광도를 축정하였다.
대상 데이터
- 사용하였다. Tannic acid, quercetin, 1, 1-di-phenyl-2-picrylhy drazyl(DPPH), 2-de oxyrib os e, peroxidase , ABTS (2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline) -6-sulfonic acid), thiobarbituric acid(TBA), trichloroacetic acid(TCA)는 Sigma 회사(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하여 사용하였다 그 외 모든 시약은 분석용 특급 시약을 사용하였다
- 약쑥은 2006년 7웧 중순에 대구 약령시장에서 구입하여싶험재료로 사용하였다. Tannic acid, quercetin, 1, 1-di-phenyl-2-picrylhy drazyl(DPPH), 2-de oxyrib os e, peroxidase , ABTS (2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline) -6-sulfonic acid), thiobarbituric acid(TBA), trichloroacetic acid(TCA)는 Sigma 회사(St.
데이터처리
- 농도인 I&값으로 나타내었다. 모든 싶험결과에 대한 통계처리는 각 싶험군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 분산분석 결과 유의성이 발견된 경우 군간의 유의도는 Tukey's HSD test에 의해 분석하였다
이론/모형
- 사용하였다. FeSO" 7H2O/L-ascorbic acid(23)에 의해 유도된 쥐 간 microsome의 지 질과산화믈을 Ohkawa 동의 TBA방법 (24) 으로 TBARS를 축정하였다. 즉, 쥐 간 mkrosome(2 mg/rriL 0.
- Sprague-Dawley 종 수컷으로부터 간 microsome 분획을 Slater와 Sawyer(22)의 방법에 따라 분리하여 사용하였다. FeSO" 7H2O/L-ascorbic acid(23)에 의해 유도된 쥐 간 microsome의 지 질과산화믈을 Ohkawa 동의 TBA방법 (24) 으로 TBARS를 축정하였다.
- Superoxide anion 소거활성은 축정은 Kweon 동(18)의 방법 에 따라 Xanthine/xanthine oxidase 에 의해 발생되는 superoxide anion radical를 항산화제가 제거시키는 정도를 확인하는 싶험으로써 nitro Hue tetrazDlium(NBT) 의 감소 정도를 통하여 항산화능을 축정 하였다. 시료 100 UL, 0.
- 총 풀라보노이드 함량은 Moreno 동(16)의 방법에 의해축정하였다. 각 농도별 분획믈 100 此를 취하여 10% alumnum nitrate와 1 yM potassium acetate를 함유하는 80% ethanol 4.
성능/효과
- 7由0兀-ascorbic acid에 의해 유도된 쥐 간 mxrosome의 지 질과산화로 억제효과를 축정한 결과는 Table 4와 같다. IC&값은 BHA가 82.27, n-HX충이 191.69, CHCM충이 176.88, EtOAc충이 163.71, n-BuOH충이 176.88 및 water 충이 194.97 &」g/mg으로 쥐 간 microsome의 지질과산화 억제 효과도 앞서 활성산소종 소거능처럼 EtOAc충이 분획믈 중에서 가장 우수하였다
- 일반적으로 페놀성 화합믈이 항산화작용을 하는 대표적인 믈질로 보고되어있어, 약쑥 분획믈의 페놀화합믈 및 풀라보노이드 함량을축정한 결과는 Table 2와 같다. n-HX충을 제외한 모든 분획믈에서 많은 페놀성 화합믈을 함유하고 있는 것으로 나타났으며, 그 중 EtOAc충이 311.35 蚣血g의 가장 높은 페놀화합믈을 함유하고 있었다. 산쑥0.
- 00 Ug/mg의 소거활성을 보였다. 그 중 EtOAc 분획충의 은 26.47 逐/mg으로, 합성 항산화제 인 BHAQCso: 面.78 회g/mg) 보다 항산화 효과가 우수한 것으로 나타났다.
- 또한, An 동(30)은 한약재의 항산화 활성을 검증한 싶험에서 높은 DFFH 소거능을 보이는 한약재는 플리페놀처럼 hydroxyl gr。司을 구조 중에 포함하며 DFFH와 반응하기에 적합한 입체구조를 가지는 화합믈이존재하기 때문으로 추정하였다. 본 연구에서도 플리페놀 함량이 높은 EtOAc 분획충이 DPPH 소거활성이 높은 것을 알 수 있었다.
- 유발하는 것으로 알려져 있다(32, 33). 약쑥 분획믈의 hydrogen peroxide 소거활성은 WBuOH충의 IC&이 166.44 Ug/mg로, 합성항산화제인 BHA의 소거활성보다 유의적으로 높옴을 알 수 있었다(Table 3).
- Free radicale 인체내에서 지 질 또는 단백질 동과 결합하여 노화를 일으키기 쉬운데 페놀성 화합믈의 경우 free radical 을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 강해 인체내에서 free radical에 의한 노화를 억제하는 척도로 이용할 수 있다(28). 약쑥분획믈의 DFFH free radical 소거활성은 Table 3과 같다 약쑥의 용매분획믈은 약 IC位 52.71 ~321.95 ng/mg의 우수한 소거활성을 보였으며, 이 중 EtOAc 분획충이 가장 높은 소거활성을 보였다. 일반적으로 쑥은 다양한 풀라보노이드를 함유하고 있으며 6-methoxy flavonoid의 공통적 인 구조를 가지고 있고 풀라보노이드는 항산화 효과가 대단히 커서, 효소적 또는 비효소적으로 지 질과산화를 효과적으로 억제한다고 보고되었다(29).
- 인진쑥의 에탄율 추출믈도 항산화성이 크며 인진쑥의 생리활성성분으로 scoparone, capilartemisin, capaillarisin 동이 있匸} 고 보고되었다(27). 풀라보노이드 화합믈 또한 n-HX충을제외한 모든 분획믈에서 많은 함량을 함유하고 있는 것으로 나타났으며, 그 중 EtOAc충이 92.73 运方ng의 가장 높은 풀라보노이드 화합믈을 함유하고 있었다.
- 생체 내에서 과량으로 생성된 NO는 미토콘드리아의 기능 억제, FeS 함유 효소 기능 저하, DNA 손상유발 및 각종 효소의 작용을 억제하는 것으로 알려져 있다(35). 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 소거활성을 관찰한 결과(Table 3) EtOAc충의 ICsoe 65.94 &」g/mg으로, 합성 항산화제 인 BHA 와 유의적인 차이가 없었다. 아질산염 소거능은 시료의 첨가량뿐만 아니라 반응계의 pH와 추출용매에 따라서도 달라지는데, pH 의존도가 매우 커 산성영역에 가까울수록 소거 능이 높으며 중성에 가까울수록 소거능이 낮아진다(36).
후속연구
- 이상의 결과로부터 약쑥 믈 추출믈을 용매 분획하여 얻어진 EtOAc 분획믈이 가장 높은 총 플리페놀 및 풀라보노이드함량을 가지고 있었으며, 아울러 활성산소종 소거능 및 쥐간 microsome 지질과산화 억제효과도 상당히 높옴을 알 수 있었기에 향후 이들 EtOAc 분획믈을 기능성 항산화 신소재로써 사용할 수 있을 것이며 나아가 认 迎"에서 그들의 항산화 작용을 축정할 필요성이 있다.
- 또한 참쑥, 약쑥, 인진쑥의에탄율 추출믈 중 인진쑥의 항산화성이 가장 큰 것으로 알려져 있으며 인진쑥의 생리활성믈질로서 xoparone, capilartemisin A와 B, capillarisin 뿐 아■니 라 cirsilineol, crisimaritin, genkwanin, rhamnocitrin 동 4종의 flavonoids가 보고되고 있다(14). 이처 럼 刀广广的姑也휴에는 caffeic acid, catechol, prot ocatechnnic acid, scoparone, capilartemisin A 와 B, capillarisin, cirsilineol, crisimaritin, genkwanin, rhamnocitrin 동(13, 14)의 풀라보노이드를 포함한 다양한 페놀휴화합믈이 다량으로 함유되어 있어 항산화 효과 및 생체 내지 질과 산화 억제 동 성인병에 대한 예방 효과가 있을 것으로 기대되나 항산화계의 구체적인 연구는 아직까지 미비한 싶정이다
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