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문제 정의
- 본 실험에서는 실험에 앞서 현재 문제시되고 있는 약물의 안전성을 확보하기 위하여 CDT의 독성검사를 in vitro, in vivo에서 실시하였다. 먼저 세포독성검사에서는 250 ug 이하에서 90% 이상의 세포생존율을 보였으며(Table 2), in vivo 실험 종료 후에 측정한 간 기능 검사 수치에서도 독성이 없음이 입증되었다(Table 3).
- 본 연구에서 plasma 내 알도스테론 농도는 CDT 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하는 효과를 나타내었다(Table 8). 이는 CDT가 알도스테론를 감소시켜 미네랄 대사 조절과 전해질 밸런스 유지에 효과가 있음을 입증하는 결과라 하겠다.
제안 방법
- 150mM DPPH/EtOH 450 에 CDT를 1000, 500, 250, 125, 62.5 ㎍/ml 농도로 희석하여 50 ㎕씩 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이를 흡광도 517 nm에서 측정하여 아래의 방법으로 계산하였다.
- Sprague-Dawley (SD) rat 을 무작위로 6마리씩 나누어 정상군 (Normal), 대조군(Control) 그리고 실험군 (CDT)으로 설정 하였다. 대조군과 CDT 투여군은 deoxycorticosterone acetate (DOCA) 25 ㎎/㎏을 주 3회씩 8주간 피하 주사와 함께 1% NaCl을 식수로 제공 하였고, 실험군은 CDT를 성인 기준 하루두 첩 분량 (77 ㎎/㎏)으로 매일 투여하였다.
- 25 ㎎/㎏). The treatment group were injected subcutaneous with DOCA and orally administered with CDT extract for 8 weeks (once a day. 77 ㎎/㎏/ 200 μl). Normal : Normal SD rat.
- & Cheung 의 방법15)으로 측정하였다. 각 농도 (1000, 500, 250, 125, 62.5 ㎍/ml)의 CDT 10 ㎕ 기질 Hip-His-Leu 110 < 그리고 ACE 용액 30 ㎕을 혼합하여 37℃에서 60분 동안 반응시킨 후 IN HC1 110 ㎕를 넣어 반응을 정지시켰다. 이 반응액에 1 ml의 ethyl acetate를 넣고 교반 후 3, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액 750 ㎕ 를 95℃에서 10분 동안 건조하여 용매를 완전히 제거하고, 1 ml의 증류수로 용해시켜 228 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리하였다. 나머지 6 ml의 혈액을 EDTA 첨가 튜브에 넣어 혈장을 분리하였다 분리한 혈청은 생화학 기기 (AU400, Olimpus, U.S.시를 이용하여 GOT, GPT, BUN, creatinine, uric acid를 측정하였고, Na\ K+, Cl* 측정은 전해질 즉정기 (NOVA5, Japan)를 이용하였다. 혈장 성분은 감마 카운터기 (WIZARD 1470, Finland)# 이용하여 핵의학적 방법으로 aldosterone, dopamine, norepinephrine, epinephrine을 측정하였다.
- 대조군과 CDT 투여군은 deoxycorticosterone acetate (DOCA) 25 ㎎/㎏을 주 3회씩 8주간 피하 주사와 함께 1% NaCl을 식수로 제공 하였고, 실험군은 CDT를 성인 기준 하루두 첩 분량 (77 ㎎/㎏)으로 매일 투여하였다.
- A)를 사용하여 측정하였다. 동물들의 안정을 위해 측정 전에 3회 이상 흘더에 적응을 시켰고, 혈압과 심박수는 10회 이상 측정하여 평균을 결과로 사용하였다.
- 몸무게는 실험 종료 하루 전에 전자저울 (CAS, Korea)을 이용하여 측정하였다.
- 세포독성 측정은 MTT assay로 하였다. 배양한 human fibroblast cells를 96 well plate에 2X104 cell 씩 분주한 후 배양하고, 24시간 후 CDT를 500, 250, 125, 625, 31.25 ㎍/ml 농도로 투여하였다. 다시 48시간 배양 후 부유액을 제거하고, 각 well에 MTT solution (0.
- 시료 추출 방법은 CDT 5첩을 한약 약탕기 (DWP-1800T, 대웅)에 넣고, 정제수 1500 ml와 같이 혼합하여 3시간 열탕하여 추출한 후 여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator (Biichi 461, EYEL시에서 감압 농축하여 CDT를 분리한 후, 다시 동결건조기 (EYELA, FDU-540, Japan)에서 24시간 동결 건조하여 분말 35 g을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저온냉동고 (-80℃)에서 보관하면서, 실험에 따라 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 실험 종료 후 적출한 신장, 심장, 부신을 10% 포르말린 용액에 48시간 고정한 다음 12시간 수세하여 조직 내 고정액을 제거하였다. 조직은 알코올 농도를 60%에서 100%로 상승시키며 탈수하고 xylene에 투명과정을 거친 후 파라핀 블록을 제작하여 microtome을 이용하여 절편을 제작하였다 절편은 탈 파라핀 과정을 거친 후 H&E 염색을 실시하고 광학현미경을 이용하여 분석 촬영을 하였다.
- 심장과 신장은 ether로 마취 후 채혈한 다음에 적출하여 지방과 다른 조직들을 제거 하였다. 그리고 10% 포르말린에 넣어서 3시간 정도 방치 후 무게를 측정하여 몸무게에 대한 무게를 나타내었다.
- ), antibiotics (penicillinm 104 U/ml, streptomycin 10 mg/ml, amphotericin B 25 ㎍/ml)}를 넣고 3 7℃ CO2 배양기에서 hFCs를 2 시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5% trypsin-0.2% EDTA를 첨가하여 30 분간 배양하고, 인산완충생리식염수 (PBS)로 약 2회 lz500 rpm에서 원심분리한 후 RPMI 1640-10% FBS로 1주일 동안 배양하였다. 이를 다시 0.
- 이에 본 실험에서는 EBM(Evidence Based Medicine) 구축과 신규 처방 개발을 위하여 현재 임상 활용 처방인 청열도담탕을 시료로 고혈압 병태 모델13,14)을 통하여 다양한 혈압 관여 인자들의 변화를 살펴보고, 고혈압의 발병 기전과 유관한 활성산소 활성에 미치는 영향 등을 측정하였다.
- 조직은 알코올 농도를 60%에서 100%로 상승시키며 탈수하고 xylene에 투명과정을 거친 후 파라핀 블록을 제작하여 microtome을 이용하여 절편을 제작하였다 절편은 탈 파라핀 과정을 거친 후 H&E 염색을 실시하고 광학현미경을 이용하여 분석 촬영을 하였다.
- 청열도담탕(CDT)이 고혈압에 미치는 효과를 검증하기 위하여 항산화 효능, ACE 저해능, 체중과 해당 장기 무거), 혈압, 심박수, aldosterone, catecholamine 함량, 전해질, 그리고 uric acid, BUN, creatinine 변화 등을 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 혈압과 심박수는 혈압측정기 (CODA6, Kent, U.S.A)를 사용하여 측정하였다. 동물들의 안정을 위해 측정 전에 3회 이상 흘더에 적응을 시켰고, 혈압과 심박수는 10회 이상 측정하여 평균을 결과로 사용하였다.
- 시를 이용하여 GOT, GPT, BUN, creatinine, uric acid를 측정하였고, Na\ K+, Cl* 측정은 전해질 즉정기 (NOVA5, Japan)를 이용하였다. 혈장 성분은 감마 카운터기 (WIZARD 1470, Finland)# 이용하여 핵의학적 방법으로 aldosterone, dopamine, norepinephrine, epinephrine을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 실험용 쥐는 7주령, 체중 200-220 g의 雄 性 SD (Sprague- Dawley Rat, 대한바이오링크, 충주, Korea)은 실험 당일까지 고형사료 (슈퍼피드, 강원도, Korea)를 자유식이 하면서 물을 충분히 공급하였다. 실온 22 ± 2℃, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (07:00 ~ 19:00), 조도 150 ~ 300 Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 쥐만을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 청열도담탕 (Chungyeoldodam-tang 이하 CDT로 지칭함)의 구성 약물은 대전대학교 부속한방병원에서 구입 후 정선하여 사용하였다. 약물 구성은 다음과 같다(Table.
- 물을 충분히 공급하였다. 실온 22 ± 2℃, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (07:00 ~ 19:00), 조도 150 ~ 300 Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 쥐만을 선별하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과를 ANOVA multi t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구하였다. 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p<0.
이론/모형
- Cushman & Cheung 의 방법15)으로 측정하였다. 각 농도 (1000, 500, 250, 125, 62.
- 세포독성 측정은 MTT assay로 하였다. 배양한 human fibroblast cells를 96 well plate에 2X104 cell 씩 분주한 후 배양하고, 24시간 후 CDT를 500, 250, 125, 625, 31.
성능/효과
- ACE 저해능을 측정한 결과, 1000, 500, 250, 125, 62.5 (㎍ /ml) 농도에서 각각 62+0.9, 52.1 ±1.0, 41.5+0.6, 14.8±4.0, 5.0+1.7 (%)의 저해효과를 나타내었다(Table 5).
- 아울러 전해질 코르티코이드를 분비하는 세포들의 수가 정상과 비교하여 상대적으로 적게 관찰 되었다. CDT 투여군(Fig. IF)에서는 토리층을 이루는 세포들의 배열 형태는 뚜렷하지는 않지만 정상군(Fig. ID)과 유사한 배열을 하였고, 실험 대조군에 비해서는 세포의 배열이 다소 뚜렷하였으며, 세포들 사이 모세혈관의 뚜렷한 확장은 관찰할 수 없었다. 심장은 정상군(Fig.
- 8 (mEq/1)로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았고. CDT 투여군은 144.4±2.0 (mEq/1)로 나타나 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 없었다 혈청 중의 potassium (K) 농도는 대조군이 5.8±0.2 (mEq/1), 정상군이 4.9+0.3 (mEq/1)로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있는 (* : P <0.05) 증가를 나타내었으며, CDT 투여군은 5.4±0.3 (mEq/1)로 나타나 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다. 혈청 중의 Chloride (Cl) 농도를 측정한 결과, 대조군은 104.
- DOCA-salt 고혈압 쥐의 plasma aldosterone에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 11Z2±24.2 (pg/ml), 정상군은 44.1+9.9' (pg/ml)로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있는 (*** : P <0.001) 증가를 나타내었다. 반면 CDT 투여군은 71.
- DOCA-salt 고혈압 쥐의 몸무게에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 420.8+27.9 (g), 정상군은 488.3±12.1 (g)으로 나타나, 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있는 (*** : P <0.001) 감소를 나타내었다. CDT 투여군은 470.
- DOCA-salt 고혈압 쥐의 혈압에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 175.2±5.4 (mmHg), 정상군은 129.1±L2 (mmHg)로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있는 (*** : P <0.001) 증가를 나타내었다. CDT 투여군은 142.
- DOCA-salt 고혈압 쥐의 혈청 중의 sodium (Na)의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 150.1土L0 (mEq/1), 정상군은 140.1±0.8 (mEq/1)로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았고. CDT 투여군은 144.
- hFCs에 대한 세포독성을 관찰한 결과, 대조군의 세포 생존율이 100±2.4 (%)인데 비하여, CDT 투여군 500, 250, 125, 62.5, 31.25 Qg/ml)의 농도에서는 각각 86.2±9.7f 91.1+9.1, 93.4+1.8, 97.1 ±8.9, 97.0±2.8 (%)로 나타났다(Table 2).
- 1)로 분석하여 p값을 구하였다. 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p<0.05 일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- U/1)로 큰 차이가 없었다. 결과적으로 CDT 투여군은 GOT와 GPT의 수치가 정상 범위로 나타나 약물에 의한 간 독성은 발견되지 않았다(Table 3).
- 고혈압 자연발병 rat (SHR), Dahl-salt rat 식염부하고혈압 rat 등 동물 모델에서 고혈압을 동반한 심장, 신장, 혈관 등에 조직 장해를 보였으며 심혈관계 장기에서는 염증과 함께 세포증식에 관한 유전자인 COX-2, IL-lb, IL-6, MCP-1 등과 관련 인자 등의 발현이 확인 되었다(Fig. 2)19,20).
- 5(mmHg)로 나타나 유의성있는 강압 효과를 나타내었다. 또한 대조군에 비하여 CDT 투여군에서 심박 수도 낮추는 효과를 나타내었다(Table 7).
- 반면 CDT의 투여군에서는 정상군과 유사한 몸무게의 유지를 보임으로써 신체 상태를 통한 간접적인 효과를 증명하였다. 또한 몸무게에 대한 심장과 신장의 무게는 정상군에 비하여 대조군에서 증가하였으며, CDT의 투여를 통해 정상군에 가깝게 유지하는 것으로 나타났다(Table 6).
- 먼저 세포독성검사에서는 250 ug 이하에서 90% 이상의 세포생존율을 보였으며(Table 2), in vivo 실험 종료 후에 측정한 간 기능 검사 수치에서도 독성이 없음이 입증되었다(Table 3).
- 따라서 유효한 항산화 물질은 고혈압뿐만 아니라 순환기계 질병의 치료에 효과적이라 하겠다. 본 실험예서는 CDT 의 항산화 작용을 측정하기 위하여 DPPH 소거능과 SOD 유사 활성을 측정하였는데, 모두 농도 의존적으로 활성 억제 효과가 관찰됨으로써(Table 4), 본 시료가 고혈압으로 인한 혈관 장해에도 일정한 효과가 있음을 시사하였다.
- 혈압 상승의 원인이 되기도 한다28,29). 본 연구에서 plasma 내 알도스테론 농도는 CDT 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하는 효과를 나타내었다(Table 8). 이는 CDT가 알도스테론를 감소시켜 미네랄 대사 조절과 전해질 밸런스 유지에 효과가 있음을 입증하는 결과라 하겠다.
- 전해질 밸런스의 붕괴는 고혈압, 신장기능의 장해 등에 직접적인 원인으로 작용하고 있다. 본 연구에서 혈청 중에 전해질의 농도는 Na+, K+, Cf 모두 대조군에서 정상군에 비하여 높은 농도를 보였으며, CDT 투여군에서 대조군에 비하여 Na과 C1 이 유의성 있게 감소함으로써 (Table 9), CDT가 전해질의 밸런스를 유지시켜 혈압의 상승 억제함을 알 수 있었다.
- 원인이 되고 있음을 보고하고 있다. 신장 기능 관련 인자인 uric acid, BUN, creatinine 측정에서는 대조군에서 정상군에 비하여 유의성 있게 증가함으로써 신장 손상을 입증하였고, CDT 투여군에서는 상대적인 감소를 나타냄으로써 신장 기능조절을 통한 고혈압 억제 작용을 시사하였다(Table 10).
- 이 같은 결과는 조직 검사에서 증명되었는더〕, 신장은 대조군에서 신세동맥의 비후가 관찰 되었으나 CDT 투여군에서는 비후 정도가 완화된 것을 볼 수 있었고, 부신은 대조군에서 토리층 피막의 모세혈관 확장된 모세혈관을 관찰되었고 전해질 코르티코이드를 분비하는 세포들의 수가 정상과 비교하여 상대적으로 적게 관찰되었으나 CDT 투여군에서는 정상군과 유사하게 모세혈관의 확장이 관찰되지 않았다.
- 3 (mEq/1)로 나타나 대조군에 비하여 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다. 혈청 중의 Chloride (Cl) 농도를 측정한 결과, 대조군은 104.3±0.5 (mEq/1), 정상군은 95.6±1.1 (mEq/1)로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있는 (***: P <0.001) 증가가 나타난 반면, CDT 투여군은 101.1±2.6 (mEq/1)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (+ : P<0.05) 감소 효과를 나타내었다(Table 9).
- 01)감소 효과를 나타내었다. 혈청 중의 creatinine 농도는 대조군이 0.76±0.05 (mg/dl), 정상군이 0.62+0.04 (mg/dl)로 나타나 정상군에 비하여 대조군에서 유의성 있는 (*** : p <0.001) 증가를 나타내었으며, CDT 투여군은 0.68±0.04 (mg/dl)토 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (+ : P <0.05) 감소 효과를 나타내었다(Table 10).
후속연구
- 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 항산화 작용 결과는 본 시료가 혈관염 등의 다양한 질환에도 응용될 수 있음을 시사해주고 있어, 향후 개별 약물 혹은 약물간의 상호 작용에 관한 검색이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 청열도담탕의 항고혈압 작용이 실험적으로 검증되어, 향후 다양한 가감을 통하여 보다 폭 넓은 임상에서의 활용이 기대된다.
- 이상의 결과로 보아 고혈압의 주요 병리 기전에 본 시료가 유의성 있게 작용함을 실험적으로 입증됨으로써 EBM 구축에 기초적 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 또한 항산화 작용 결과는 본 시료가 혈관염 등의 다양한 질환에도 응용될 수 있음을 시사해주고 있어, 향후 개별 약물 혹은 약물간의 상호 작용에 관한 검색이 보완되어야 할 것으로 사료된다.
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