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문제 정의
- 하지만 현재 우슬의 항관절염에 대한 효과에 대해서는 알려지지 않고 있다. 따라서 본 연구에서는 우슬투여와 전침자극을 적용하여 부종율과 관절염지수평가 및 혈액학적인 분석과 병리조직학적 변화를 분석하여 알아보고자 한다.
- 본 연구에서는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 백서에 우슬투여 및 전침자극을 적용하여 관절염 지수, 족부종율, 혈액학적 분석 및 병리조직학적 변화 등을 관찰하였으며 이를 항관절염 질환에 응용하고자 하였다.
제안 방법
- 관절염이 유발되기 전에 측정한 용적(volume)을 대조용적 (control volume; 0 day)으로 하여, 매일 같은 시각에 측정한 용적을 대조용적과 비교하여 백분율로 나타내었다. 족부종 측정에는 water displacement 방법에 의하여, 콜라겐 유발물질을 투여한 오른쪽 부위의 족부종을 3회 반복 측정하여 평균치를 사용하였으며, 수치 단위는 ㎖를 사용하였다 치료 전, 치료7, 14, 21, 28일 후에 병태모델 흰쥐의 족부종을 측정하였다.
- 마지막으로/ 핵이 청명한 색이 되도록 5~10분 정도 충분히 세척한 후 탈수 및 투명과정을 거친 후 봉입하였다. 광학현미경을 이용하여 관찰 후 장착된 CCD 카메라로 슬관절의 염증세포의 침윤정도, 연골과 뼈의 파괴 유무, 세포 파괴 유무를 촬영하였다.
- 류마티스 관절염이 유발된 흰쥐에게 우슬투여와 인체의 족삼리(ST36)에 해당하는 부위에 전침자극을 실시하여 관절염의 병태 모델에 미치는 영향을 알아보기 위하여 관절염 지수 평가, 족부종율, 혈액학적 분석, 병리조직학적 분석을 실시한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험 종료 후 흰쥐를 경추탈골하고 심장천자로 약 3 ㎖ 정도의 혈액을 채취한 다음 원심분리기로 10분간 3, 500rpm에서 원심분리하여 혈청을 분리한 후 AST(asparatate transaminase), ALT(alanine transaminase) 활성도는 검사 분석 측정을 위한 시약 (ELITECH, Division of SEPPIM SA. France)으로 생화학분석기 (RM 2060-18, Eltec Co. Italy)를 사용하였으며, C-reactive protein(CRP) 은 CRP-S(Htoboz Japan) 를 사용하여 INTEGRA 800(Roche Diagnostics, USA)으로 측정하였고, WBC(white blood cell)는 improved neubauer7s counting chamber를 사용하여 측정하였다.
- 최종적으로 얻은 우슬 추출 용액을 -80 ℃에서 동결건조하여 분말로 얻었다. 우슬추출물 500 mg/kg을 0.9 % 생리식염수에 녹여 0.5 ㎖의 양을 매일 1회씩 28일 동안 경구 투여하였다.
- 대조용적과 비교하여 백분율로 나타내었다. 족부종 측정에는 water displacement 방법에 의하여, 콜라겐 유발물질을 투여한 오른쪽 부위의 족부종을 3회 반복 측정하여 평균치를 사용하였으며, 수치 단위는 ㎖를 사용하였다 치료 전, 치료7, 14, 21, 28일 후에 병태모델 흰쥐의 족부종을 측정하였다. 족부종율(%)은 콜라겐 유발물질 투여 직후의 발 용적의 변화를 이용하여 다음 식으로 구하였다.
- 결정하였다20). 침은 1회용 stainless steel 멸균 호침(동방침구제작소, 0.25><40 bud) 을 이용하여 5 mm 깊이로 직자하고, 전침기는 Point F-3형(ITO Co. ltd, Japan)을 사용하여 전기자극(2 Hz, 0.3 ms)을 가시적 근수축이유발되는 정도의 강도로 매일 1회씩 30분간 주 5회 실시하였다.
- 희생된 흰쥐의 슬관절을 적출 즉시, Bouin액에 침지하여 24 시간 이상 고정하였으며, 5~7 % 질산(Nitric acid) 용액에서 3일간 매일 질산액을 교환하면서 탈회를 실시한 후 10 % 중성완충포르말린에 24시간 이상 고정시켰다. 슬관절은 safranin O-fast green 염색을 실시하였는데, 그 과정은 우선 탈 파라핀 과정을거친 후 Weigert's iron hematoxylin 용액에 10분간 반응시킨 후 10분간 흐르는 물에 세척하고, fast green solution에 5분간 염색하였다.
- 5군으로 분류하여 사용하였다. 흰쥐를 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료(Samyang Co, Korea)와 물을 충분히 자유급식하면서 실험실 환경(실내온도 25 ± 1 °C, 습도 55 ± 5 %, 12시간 명암주기)에 1주일간 적응시킨 후 사용하였다.
- 1 M acetic acid로 2 mg/nre의 농도로 용해시킨 후 동량의 freund's incomplete adjuvant(Sigma, USA)와 혼합하여 현탁액으로만들었다18, 19). 흰쥐의 우측 족척에 100 ㎕을 피하주사한 뒤 7일 후 꼬리기시부에 동량을 추가 접종하였고, 대조군에는 동량의 생리식염수를 접종하였다. 실험동물의 분류는 Table 1에서 보는 바와 같으며, 마지막 접종일로부터 21일 째에 육안으로 관절주위 발적, 부종 등 임상적인 관절염 증후를 관찰 평가하여 개체를 선별하여 사용하였다
대상 데이터
- 실험동물은 생후 6주령의 체중 약 170 ± 5 g 내외의 Sprague-Dawley계 흰쥐 (Hawin Co, Korea) 25마리를 각 군당 5 마리씩 5군으로 분류하여 사용하였다. 흰쥐를 항온항습 장치가 부착된 사육장에서 고형사료(Samyang Co, Korea)와 물을 충분히 자유급식하면서 실험실 환경(실내온도 25 ± 1 °C, 습도 55 ± 5 %, 12시간 명암주기)에 1주일간 적응시킨 후 사용하였다.
- 흰쥐의 우측 족척에 100 ㎕을 피하주사한 뒤 7일 후 꼬리기시부에 동량을 추가 접종하였고, 대조군에는 동량의 생리식염수를 접종하였다. 실험동물의 분류는 Table 1에서 보는 바와 같으며, 마지막 접종일로부터 21일 째에 육안으로 관절주위 발적, 부종 등 임상적인 관절염 증후를 관찰 평가하여 개체를 선별하여 사용하였다
데이터처리
- Effect of Achyranthes Radix and electroacupuncture on the arthritic index in arthritic rats. Value with different superscripts in the same column are significant(p(.O5) by Duncan's multiple range test.
- Effect of Achyranthes Radix and electroacupuncture on the change of C-readive protein in arthritic rats. Value with different superscripts in the same column are sigr)ificant(p<.05) by Duncan's multiple range test.
- 시간에 따른 실험군들 사이의 통계적 유의성 검정을위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. 사후검정으로 Duncan의 다중범위검정을 사용하였으며, 모든 통계학적 유의수준은 a=0.05로 하였다.
- 0 windows®를 사용하였다. 시간에 따른 실험군들 사이의 통계적 유의성 검정을위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였다. 사후검정으로 Duncan의 다중범위검정을 사용하였으며, 모든 통계학적 유의수준은 a=0.
이론/모형
- 관절염 지수 평가는 Burrai 등21)의 방법에 따라 흰쥐의 각치 절에서 관절 종창과 관절 주위부 발적 정도를 육안 관찰하여 0~4점으로 점수를 배점하였다(Table 2).
- 인체의 족삼리(Chok samni; ST36)에 상응하는 부위와 말단 방향으로 5 ㎜ 떨어진 부위를 골도 분촌법에 준하여 결정하였다20). 침은 1회용 stainless steel 멸균 호침(동방침구제작소, 0.
성능/효과
- 백혈구 총수와 crp 함량은 실험군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 IV 가 실험군 n, 이보다 더 유의한 수준으로 감소되었다. AST와 ALT 함량에서 실험군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 a가 실험군 h, m에 비해 유의한 감소를 보였다. Safranin O-fast green 염색결과 실험군 모두 활액막의 심한 증식과 염증세포가 대조군에 비해 증상이 완화되었으며, 특히 실험군 IV가 실험군 Ⅱ, Ⅲ이에 비해 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
- AST와 ALT 함량에서 실험군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 a가 실험군 h, m에 비해 유의한 감소를 보였다. Safranin O-fast green 염색결과 실험군 모두 활액막의 심한 증식과 염증세포가 대조군에 비해 증상이 완화되었으며, 특히 실험군 IV가 실험군 Ⅱ, Ⅲ이에 비해 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
- 각 군 간 CRP 변화를 알아보기 위해 일원배치 분산분석을 실시한 결과, 치료적 중재 28일 후 각 군 간 C-반응 단백은 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(pv.05). 사후검정에서는 대조군과 실험군 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ 사이에서 유의한 차이를 보였으나(p<.
- 각 시기별로 실험군의 족부종율의 변화를 알아보고자 일원 배치 분산분석을 실시한 결과, 실험군 I 에서는 완만한 감소를보였으나, 실험군 n, m, iv에서는 보다 많은 감소를 보였다 (p<.05), 사후검정에서는 7일 째에는 실험군 i, h, m과 실험군 IV 사이에서 유의한 차이를 보였으며(p<.05), 14일 째에는 실험군 I 과 실험군 n, m, iv 사이에서 유의한 차이를 보였다(p<.05). 실험군 Ⅱ와 실험군 Ⅲ, Ⅳ 사이에도 유의한 차이를 보였으며 (p<.
- 알려져 있다35). 간의 손상 여부를 알아보기 위한 혈장 AST 및 ALT 활성도를 측정한 결과 혈장 AST 및 ALT 활성도는 대조군보다는 실험군 I 에서 활성도가 높게 나타났다. 하지만 치료적 중재 후에는 AST와 ALT 활성도가 실험군 I 에 비해 각 실험군들에서 유의하게 낮아져 정상수치에 근접하였다(p<.
- 06로 유의하게 증가하였다. 관절염 유발군들에서치료적 중재 후 군간 관절염 지수를 확인한 결과, 모든 군에서시간이 지날수록 유의하게 관절염 지수가 감소하였다. Baek 등 33)의 연구에서도 전침 자극이 콜라겐으로 유도한 관절염에서염증성 과민반응이 현저히 감소하였다고 하였는데, 본 연구 결과와 일치하였으며, 특히 21일 이후부터 실험군 IV는 실험군 II와 HI에 비해 유의하게 감소하였다(Fig.
- 관절염 지수 평가에서 실험군 모두 대조군에 비해 발 적과 부종이 유의하게 완화되었다. 특히 실험군 IV가 실험군 n, m보다 더 유의한 수준으로 감소되었다.
- 3A). 또한 ALT는 대조군과 실험군 I, H, m 사이에서 유의한차이를 보였으나(p<.05), 실험군들 사이에서는 실험군 n, iv를제외한 다른 모든 군에서 유의한 차이를 보였다(p<.05). 그 중 실험군 IV에서 가장 낮은 수치를 보여주었다(Fig.
- 또한 실험군 IV은 약간의 염증세포의 침윤이 있으나 활액막의 증식 및 연골 회복에 있어서 가장 많이 호전 되었음을 관찰할 수 있었다(Fig 6).
- 05). 또한 염증성 또는 조직괴사성 질환의 존재 여부와 그 중증도의 판정, 경과관찰, 예후 판정들에 있어 유용하게 사용되어지는 C-반응 단백 측정결과찌, 본 실험에서는 우슬투여와 전침자극을 한 실험군 h, m, IV이 실험군 I 에 비해 유의하게 C-반응 단백이 감소하였다(Fig. 5)(p<.05),
- 족부종율은 실험군 모두에서 대조군보다 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 IV가 실험군 n, in보다 유의한 감소를 보였다. 백혈구 총수와 crp 함량은 실험군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 IV 가 실험군 n, 이보다 더 유의한 수준으로 감소되었다. AST와 ALT 함량에서 실험군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 a가 실험군 h, m에 비해 유의한 감소를 보였다.
- 혈장성분 및 백혈구의 삼출에 의해 발생된다32). 본 연구에서도 육안적 소견상 대조군에 비하여 류마티스 관절염을 유발시킨군에서 뒷다리의 부종과 발적이 심하게 나타났고, 콜라겐을 투여후에 관절염 지수는 대조군은 0.1 ± 0.05 점인 반면 관절염 유발군은 3.88 ± 0.06로 유의하게 증가하였다. 관절염 유발군들에서치료적 중재 후 군간 관절염 지수를 확인한 결과, 모든 군에서시간이 지날수록 유의하게 관절염 지수가 감소하였다.
- 05). 사후검정에서 AST는 대조군과 실험군 I, H, IV군 사이에서 유의한 차이를 보였으며 (p<.05), 실험군들 모두 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (p<.05), 그 중 실험군 IV에서 가장 낮은 수치를 보여주었다(Fig. 3A). 또한 ALT는 대조군과 실험군 I, H, m 사이에서 유의한차이를 보였으나(p<.
- 05). 사후검정에서는 대조군과 실험군 I, h, m 사이에서 유의한 차이를 보였으며, 실험군 I에서 가장 높은 수치를 보였다(pv.O5). 또한 실험군 Ⅰ과 실험군 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 사이에서 유의한 차이를 보였다(Fig.
- 05). 실험군 Ⅱ와 실험군 Ⅲ, Ⅳ 사이에도 유의한 차이를 보였으며 (p<.05), 21일 째에는 실험군 Ⅰ 과 실험군 Ⅱ, Ⅳ 사이에서 유의한 차이를 보였고(p<.05), 실험군 II와 실험군 IV 사이에서도 유의한 차이를 보였다(p<.05). 그리고 실험군 m과 실험군 IV사이에서 유의한 차이를 보였다(p<.
- 이제까지의 연구결과들을 인체의 염증성 관절염과 유사한동물모델에서 콜라겐 유도 관절염을 유발하여 우슬투여와 전침자극을 한 경우가 치료적 중재를 전혀 하지 않은 경우 보다 족부종율, CRP, WBC, ALT 및 AST7} 유의하게 감소하였을 뿐만 아니라, 조직병리학적으로도 염증성 세포와 연골이 많이 회복되었다. 향후 류마티스 관절염 환자에게 실제 적용될 수 있도록 우슬의 효능 및 전침 자극의 활용에 대해 다각적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 특히 실험군 IV가 실험군 n, m보다 더 유의한 수준으로 감소되었다. 족부종율은 실험군 모두에서 대조군보다 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 IV가 실험군 n, in보다 유의한 감소를 보였다. 백혈구 총수와 crp 함량은 실험군 모두 대조군에 비해 유의하게 감소되었으며, 특히 실험군 IV 가 실험군 n, 이보다 더 유의한 수준으로 감소되었다.
- 이는 우슬 추출물과 전침자극을 동시 적용한 결과 관절염에 대한 상승효과로보여 진다. 족부종율을 비교한 결과 14일차부터 치료적 중재한군들에서 유의한 감소를 보였으며, 특히 우슬 추출물과 전침자극을 함께 한 실험군 IV에서 다른 군들에 비해 부종율이 더 감소하였다(Fig. 2)(p<.05),
- 치료적 중재 28일 후, 각 군간 백혈구 수의 변화를 알아보기위해 일원배치 분산분석을 실시한 결과 백혈구 총수는 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(pv.05). 사후검정에서는 대조군과 실험군 I, h, m 사이에서 유의한 차이를 보였으며, 실험군 I에서 가장 높은 수치를 보였다(pv.
- 치료적 중재 28일 후, 실험군 I 은 활액막의 증식과 염증세포 소견에 대조군과 큰 차이가 있었으며, 실험군 II는 연골 회복이 많이 관찰되었으며, 실험군 in에서도 대조군에 비해 연골의 회복이 관찰되었고, 염증 세포의 침윤이 완화됨을 관찰할 수 있었다. 또한 실험군 IV은 약간의 염증세포의 침윤이 있으나 활액막의 증식 및 연골 회복에 있어서 가장 많이 호전 되었음을 관찰할 수 있었다(Fig 6).
- 치료적 중재 28일 후-AST 및 ALT의 변화를 알아보고자 일원배치 분산분석을 실시한 결과, AST 및 ALT 모두에서 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p<.05). 사후검정에서 AST는 대조군과 실험군 I, H, IV군 사이에서 유의한 차이를 보였으며 (p<.
후속연구
- 향후 류마티스 관절염 환자에게 실제 적용될 수 있도록 우슬의 효능 및 전침 자극의 활용에 대해 다각적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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