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문제 정의
- 또한 익모초는 한약 자원 중 빈용 약재라고 해도 과언이 아니며 이에 따라 익모초의 성분 연구는 많이 이루어져 있는 실정이다. 그러나 익모초의 주성분에 대한 표준화가 현재 정확히 마련되지 않았다는 현 실정을 감안하여 익모초의 주성분인 rutin 을 통한 산지별, 생육별 표준화 작업을 목적으로 하여 본 실험을시행하게 되었다.
제안 방법
- FAB-MS spectrometer 측정에 사용된 것은 VG 70-VSEQ(England)이고 1H-NMR spectrometer, Varian Gemini 2000, 300 MHz(USA), Bruker Avance-500, 500 MHz(Germany), 13C-NMR spectrometer Varian Gemini 2000, 75 MHZfUSA), Bruker Avance-500, 125 MHz(Germany)를 사용하였다. TLC 확인시험에는 Kieselgel 60 F254(Merck, Germany)를 사용하여 이동상 CHC13 : MeOH : H2O(70 :30 : 4)와 Hexane : EtOAc: Benzene(70 :15 :15)와 EtOAC : formic acid: acetic acid: H2O(100:15:15:20, 80: 15:15:20)의 조성을 이용하였고 검출시익으로는 Ethanolic-FeCl3 solution 와 Dragedorff reagent 와 10%-H2SO4 in EtOH(heating) 에서 발색을 하였고 UV-lamp(254nm)에서도 확인을 하였다. HPLC는 Waters 600(made in USA)을 사용하였으며 Detector 는 UV 355nm에서 Columne AKZO NOBEL.
- Na2SO4 무수화물 1 g을 넣고 GC용 hexane에 2 血를 넣은 후 충분히 초음파 추출한 뒤 ImZ를 취하여 45 mm에 Sitration하여 그 시료를 GC-MS 분석에 사용하였다.
- )을 detector는 HP 6890, LSIMS system(FAB)을 사용하였다. Temperature, conditione 260℃을 기본으로 하여 60℃에서 5분간 유지한 후 10℃/min의 속도로 20분간 온도를 증가시킨 후 14분간 260℃로 14분간 유지하는 조건으로 GC-MS를 detec하였다. Delievering gas는 He을 사용하였다.
- 농축하여 엑스 485 g을 얻었다. 이 MeOH 추출물을 증류수에 현탁시키고 hexane를 가하여 진탕 반복추출하고 분액깔때기에서 분획하여 hexane층과 수층을 분취한 후, 이를 감압 농축하여 hexane 엑스를 얻고 위와 같은 방식으로 CHCI3와 EtOAc엑스도 얻었다. 남은 물층을 농축하여 물엑스를 얻은 후 물엑스를 20℃에서 24시간 동안 MeOH에 적신 Amberlite XAD-4 resin 을 다량의 물로 세척하여 증류수 농축된 MeOH 추출물을 첨가하고 6시간 동안 방치한 다음 흡착된 성분을 탈착하기위해 물 분획물, 30% MeOH 분획물, 60% MeOH 분획물, 100% MeOH 분획물을 각각 얻었다.
- 이 MeOH 추출물을 증류수에 현탁시키고 hexane를 가하여 진탕 반복추출하고 분액깔때기에서 분획하여 hexane층과 수층을 분취한 후, 이를 감압 농축하여 hexane 엑스를 얻고 위와 같은 방식으로 CHCI3와 EtOAc엑스도 얻었다. 남은 물층을 농축하여 물엑스를 얻은 후 물엑스를 20℃에서 24시간 동안 MeOH에 적신 Amberlite XAD-4 resin 을 다량의 물로 세척하여 증류수 농축된 MeOH 추출물을 첨가하고 6시간 동안 방치한 다음 흡착된 성분을 탈착하기위해 물 분획물, 30% MeOH 분획물, 60% MeOH 분획물, 100% MeOH 분획물을 각각 얻었다. 이 중 EtOAc 분획물, 60% MeOH 분획물, 30% MeOH 분획 물 위주로 분리를 시도하여 Silica,Sephadex LH-20, ODS 컬럼을 통해 4개의 화합물을 분리하였다 (Scheme 1).
- 남은 물층을 농축하여 물엑스를 얻은 후 물엑스를 20℃에서 24시간 동안 MeOH에 적신 Amberlite XAD-4 resin 을 다량의 물로 세척하여 증류수 농축된 MeOH 추출물을 첨가하고 6시간 동안 방치한 다음 흡착된 성분을 탈착하기위해 물 분획물, 30% MeOH 분획물, 60% MeOH 분획물, 100% MeOH 분획물을 각각 얻었다. 이 중 EtOAc 분획물, 60% MeOH 분획물, 30% MeOH 분획 물 위주로 분리를 시도하여 Silica,Sephadex LH-20, ODS 컬럼을 통해 4개의 화합물을 분리하였다 (Scheme 1).
- 45 gm membrane hltei로 여액을 여과하여 각 검체의 시류루 사용하였다. 분석기기 - Waters의 HPLC 분석 장비를 이용하였으며 분석조건으로 columne AKZO NOBEL>KR100-5C18(4.6 x 250 mm)을 사용하였고 acetonitrile과 2.5% acetic acid water를 20:80 비로 만든 용매를 mobile phase로 하여 sample 10 讨씩주입 후 lm//min의 유속을 유지하며 UV 355nm에서 detect하였다. rutin 표품은 컬럼을 통해 분리한 순수한 rutin Img을 HPLC용 메탄올 lm/에 녹인 후 1/10으로 희석하여 사용하였다 (Fig.
- 익모초를 MeOH로 추출 농축하여 추출물을 hexane과 수층으로 분리 후 수층을Amberlite XAD-4 column chromatography를 실시하여 H2O 분획, 30% MeOH, 60% MeOH, 100% MeOH 분획물을 얻었으며 EtOAc, 60% MeOH 분획물, 30% MeOH 분획물 위주로 분리를 시도하여 Silica, Sephadex LH-20, ODS 컬럼을 통해 4개의 화합물을 분리하였다.
- 익모초를 MeOH로 추출 농축하여 추출물을 hexane과 수층으로 분리 후 수층을Amberlite XAD-4 column chromatography를 실시하여 H2O 분획, 30% MeOH, 60% MeOH, 100% MeOH 분획물을 얻었으며 EtOAc, 60% MeOH 분획물, 30% MeOH 분획물 위주로 분리를 시도하여 4개의 화합물을 분리하였다. 분리된 rutine 익모초의 주 활성과 비슷한 모세혈관의 저항성의 효과적 강화, 심장 수축작용의 증강, 이뇨작용, hyaluronidase 의 억제작용, 모세혈관의 합성, 항산화효과, Vitamin C와의 상승작용, 방사성 상해에 의한 궤양의 방지 등이 보고 된 물질이다.
대상 데이터
- 산지별로는 중국과 한국에서 21종을, 생육별로는 영천과 의성에서 1년생과 2년생을 각각 5월 24일과 7월24일에 수집하였다. 수집된 익모초는 중앙대학교 약품자원 식물학실에서 식물학적 감정을 거친 후 본 실험에 사용하였다.
- 수집하였다. 수집된 익모초는 중앙대학교 약품자원 식물학실에서 식물학적 감정을 거친 후 본 실험에 사용하였다.
- UV/VIS는 Human TU-1800PC(Korea)를 centrifuged Cen- trikon T-1180(Italy)를 사용하였다. FAB-MS spectrometer 측정에 사용된 것은 VG 70-VSEQ(England)이고 1H-NMR spectrometer, Varian Gemini 2000, 300 MHz(USA), Bruker Avance-500, 500 MHz(Germany), 13C-NMR spectrometer Varian Gemini 2000, 75 MHZfUSA), Bruker Avance-500, 125 MHz(Germany)를 사용하였다.
- TLC 확인시험에는 Kieselgel 60 F254(Merck, Germany)를 사용하여 이동상 CHC13 : MeOH : H2O(70 :30 : 4)와 Hexane : EtOAc: Benzene(70 :15 :15)와 EtOAC : formic acid: acetic acid: H2O(100:15:15:20, 80: 15:15:20)의 조성을 이용하였고 검출시익으로는 Ethanolic-FeCl3 solution 와 Dragedorff reagent 와 10%-H2SO4 in EtOH(heating) 에서 발색을 하였고 UV-lamp(254nm)에서도 확인을 하였다. HPLC는 Waters 600(made in USA)을 사용하였으며 Detector 는 UV 355nm에서 Columne AKZO NOBEL. KR100-5C18 (4.
- HPLC는 Waters 600(made in USA)을 사용하였으며 Detector 는 UV 355nm에서 Columne AKZO NOBEL. KR100-5C18 (4.6 x 250 mm)로 Mobile phasee acetonitrile : 2.5% acetic acid water = 20:80(v/v)을 조성으로 이용하였다. Gas Chro- matograph는 HP 6890, LSIMS system(FAB)을 사용하였다.
- 5% acetic acid water = 20:80(v/v)을 조성으로 이용하였다. Gas Chro- matograph는 HP 6890, LSIMS system(FAB)을 사용하였다. 컬럼은 Amberlite XAD-4 resin, Sephadex LH-20(25~100 gm, Pharmacia, Sweden), ODS gel(400~ 500 mesh, Waters, USA)를 사용하였다.
- Gas Chro- matograph는 HP 6890, LSIMS system(FAB)을 사용하였다. 컬럼은 Amberlite XAD-4 resin, Sephadex LH-20(25~100 gm, Pharmacia, Sweden), ODS gel(400~ 500 mesh, Waters, USA)를 사용하였다.
- Temperature, conditione 260℃을 기본으로 하여 60℃에서 5분간 유지한 후 10℃/min의 속도로 20분간 온도를 증가시킨 후 14분간 260℃로 14분간 유지하는 조건으로 GC-MS를 detec하였다. Delievering gas는 He을 사용하였다. 이와 같은 조건으로 4종 모두 동일하게 사용하였으며 GC peak에 대한 Mass분석은 2종류의 GC-MS library Wiley6, Nist를 사용하였으며 Mass library의 fragment peak 및 모든 형태가 완전히 일치할 시에 추정물질로 선정하였다.
- Delievering gas는 He을 사용하였다. 이와 같은 조건으로 4종 모두 동일하게 사용하였으며 GC peak에 대한 Mass분석은 2종류의 GC-MS library Wiley6, Nist를 사용하였으며 Mass library의 fragment peak 및 모든 형태가 완전히 일치할 시에 추정물질로 선정하였다.
- 5% acetic acid water를 20:80 비로 만든 용매를 mobile phase로 하여 sample 10 讨씩주입 후 lm//min의 유속을 유지하며 UV 355nm에서 detect하였다. rutin 표품은 컬럼을 통해 분리한 순수한 rutin Img을 HPLC용 메탄올 lm/에 녹인 후 1/10으로 희석하여 사용하였다 (Fig. 1).
성능/효과
- Rutine scheme에서와 같이 익모초의 주성분으로 모세혈관의 저항성 효과적 강화, 심장 수축작용 증강, 이뇨작용, hyaluronidase 의 억제작용, 모세혈관의 합성, 항산화효과, Vitamin C와의 상승작용, 방사성 상해에 의한 궤양방지 등의 보고 된 물질로서 익모초의 활혈거어(活血祛瘀), 청열해독(淸熱解毒), 이뇨(利尿) 등의 효능을 가장 설명할 수 있는 물질로 함량도 매우 높아 지표 성분으로 rutin을 설정하는 것이 타당하다고 사료된다.
- 하지만 공통되는 Rt peak도 상당수 존재하였다. 먼저 한라산과 영천지역의 GC pattern에서는 거의 비슷한 양상을 보였지만 한라산에서의 pattern 에서 Rt 24:56 min과 Rt 29:29 min, Rt 30:29 min, Rt 30 : 49min peak가 영천 지역뿐 아니라 중국에서도 없는 특이적인 peak가 존재하였다. 영천 익모초는 Rt 25:55 min에서 나타나지 않은 특이적인 peak가 존재하였다.
- 영천 익모초는 Rt 25:55 min에서 나타나지 않은 특이적인 peak가 존재하였다. 그리고 한 가지 특이적인 점은 영천산 익모초에서 관찰되는 Rt 38:55min에서 나타나는 peak가 중국산의 청해산 익모초에서 공통적으로 나타났다. 청해 성산에서는 Rt 25:53min에 독자적인 peak가 존재하였다.
- 이에 산지나 환경에 따라 같은 종이라 하여도 지역 환경에 따라 함유하고 있는 성분이나 함량이 달리 측정될 수 있다는 것과 지역 환경에 따른 변종으로서의 가능성을 확인할 수 있었다(Eble I, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5).
- 21종의 검체를 익모초의 주성분인 rutin을 통한 HPLC 패턴 분석을 실시한 결과 모든 검체에서 Rt 7:10min에서 rutin의peak가 나타남을 확인할 수 있었으며 특히 제주 한라산 익모초에서 rutin의 peak가 높게 확인되었다. Rutin함량 평균은 0.
- rutin의 peak가 높게 확인되었다. Rutin함량 평균은 0.32± 0.18(%)로 국산 익모초는 0.35±0.17(%), 중국산 0.23±0.12(%) 을 나타내었고 전체적으로 국산의 익모초가 중국산보다 rutin 함량^ 높은 것으로 확인되었다. 그 중 특히 제주도의 한라산 익모초가 매우 탁월한 함량을 기록하였고 호남, 협서, 청해산 익모초에서는 그 함량이 미미하였다.
- 먼저 익모초에 정유 성분이 대부분인 것을 감안하여 GC-MS 상에서의 패턴 분석을 통해 산지별 비교를 하였는데 다양한 Rt 에서 중국산과 한국산의 특징적인 차이를 보이는 peak들을 확인할 수 있었으며 특히 제주도 한라산 sample에서 특이적인 peak 를 나타내는 Rt를 갖는 것으로 나타났다. 이로써 익모초의 산지별 차이가 분명히 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- 분리된 rutine 익모초의 주 활성과 비슷한 모세혈관의 저항성의 효과적 강화, 심장 수축작용의 증강, 이뇨작용, hyaluronidase 의 억제작용, 모세혈관의 합성, 항산화효과, Vitamin C와의 상승작용, 방사성 상해에 의한 궤양의 방지 등이 보고 된 물질이다. 따라서 익모초의 약효와 가장 근접한 compound라 할 수 있으며 rutin의 함량에 따라 익모초의 한약으로서 갖는 의미가 달라질 수 있을 것이며 그 함량도 매우 높아 익모초의 지표물질로서의가치가 충분하다고 할 수 있겠다.
- Rutin을 표준품으로 하여 수집된 21종의 익모초에 대한 산지별, 생육별 rutin 함량 분석을 HPLC를 통해 실시하였으며 그 결과 전체적인 rutin 함량은 평균 0.32±0.18(%)을 나타내었으며 산지별 비교로는 국내산 0.35±0.17(%), 중국산 0.23+0.12(%)^- 나타내어 전체적으로 국산의 익모초가 rutin 함량이 높은 것으로 나타났다. 그 중 특히 제주도의 한라산 익모초가 매우 탁월한 함량을 기록하였다.
- 그 중 특히 제주도의 한라산 익모초가 매우 탁월한 함량을 기록하였다. 채집시기별 익모초의 rutin 함량의 상대적인 비교 실험에서는 1년생보다는 2년생이 전체적으로 그 함량이 높았으며 5월보다는 개화시기에 가까운 7월에 채집한 것이 함량이 더 높았다.
- 그 중 특히 제주도의 한라산 익모초가 매우 탁월한 함량을 기록하였고 호남, 협서, 청해산 익모초에서는 그 함량이 미미하였다. 채집시기별 익모초의 rutin 함량의 비교실험에서는 영천과 의성에서 수집한 1년생과 2년생의 함량을 분석하였는데 영천산 2년생 익모초의 rutin 함량을 1로 하여 생육별 rutin 함량을 상대적으로 비교하였을 때 전체적으로 2 년산의 rutin 함랑이 1년산보다는 많았다(”ble U, Table HI, Fig. 6, Fig. 7).
후속연구
- 이로써 익모초의 품질표준화의 일환으로 실시한 HPLC analysis 와 GC-MS 데이터가 익모초의 다양한 차이를 보여줌을 알 수 있었고 이 결과가 익모초의 품질 표준화의 지표로 사용되어 질 수 있을 것으로 판단되며 익모초의 지표 성분인 rutin 함량의 비교를 통해 산지별, 생육별 익모초의 우수 한약 품질 기준이 마련될 수 있다고 판단된다.
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