Atractylodes macrocephala has been used for renal anorexia, gastroenteritis, cold, dyspepsia in Korean folk medicine. Specially aerial parts has been eaten as edible mountain herbs. In order to investigate the efficacy of antioxidant activity the activity guided fractionation and isolation of physio...
Atractylodes macrocephala has been used for renal anorexia, gastroenteritis, cold, dyspepsia in Korean folk medicine. Specially aerial parts has been eaten as edible mountain herbs. In order to investigate the efficacy of antioxidant activity the activity guided fractionation and isolation of physiologically active substance were peformed. For the investigation of the active components from Atractylodes macrocephala MeOH extracts of aerial parts of Atractylodes macrocephala Koidzumi L. were suspended with H$_2$O, partitioned by CHCl$_3$. In order to investigate the efficacy of antioxidative activity the activity guided fractionation and isolation of physiologically active substance were peformed. CHCl$_3$, H$_2$O, 30% MeOH, 60% MeOH, MeOH fractions were examined antioxidative activity by DPPH method. It was revealed that 30% MeOH and 60% MeOH fractions have significantly antioxidant activity. From 30% MeOH and 60% MeOH fraction, six flavonoids (7-methoxy-pinocembrin-7-O-${\beta}$-D-glucopyranoside, apige nin-8-C-${\beta}$-D-glucopyranoside, 4'-caffeoyl-luteolin-6-glucopyranoside, luteloin-6-C-${\beta}$-D-glucopyranoside, apigenin-6-C-${\beta}$-D-glucopyranoside, luteolin) and four phenylpropanoids (3-feruloylquinic acid, 4,5-di-O-caffeoylquinic acid, feruloyl acid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid) were isolated. To investigate the antioxidant activities of each compounds, we measured radical scavening activity with DPPH method and anti-lipid peroxidative efficacy on low density lipoprotein (LDL) with TBARS assay. Six compounds (III, IV, V, VI, IX, X) which have antioxidant factor showed significant activities.
Atractylodes macrocephala has been used for renal anorexia, gastroenteritis, cold, dyspepsia in Korean folk medicine. Specially aerial parts has been eaten as edible mountain herbs. In order to investigate the efficacy of antioxidant activity the activity guided fractionation and isolation of physiologically active substance were peformed. For the investigation of the active components from Atractylodes macrocephala MeOH extracts of aerial parts of Atractylodes macrocephala Koidzumi L. were suspended with H$_2$O, partitioned by CHCl$_3$. In order to investigate the efficacy of antioxidative activity the activity guided fractionation and isolation of physiologically active substance were peformed. CHCl$_3$, H$_2$O, 30% MeOH, 60% MeOH, MeOH fractions were examined antioxidative activity by DPPH method. It was revealed that 30% MeOH and 60% MeOH fractions have significantly antioxidant activity. From 30% MeOH and 60% MeOH fraction, six flavonoids (7-methoxy-pinocembrin-7-O-${\beta}$-D-glucopyranoside, apige nin-8-C-${\beta}$-D-glucopyranoside, 4'-caffeoyl-luteolin-6-glucopyranoside, luteloin-6-C-${\beta}$-D-glucopyranoside, apigenin-6-C-${\beta}$-D-glucopyranoside, luteolin) and four phenylpropanoids (3-feruloylquinic acid, 4,5-di-O-caffeoylquinic acid, feruloyl acid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid) were isolated. To investigate the antioxidant activities of each compounds, we measured radical scavening activity with DPPH method and anti-lipid peroxidative efficacy on low density lipoprotein (LDL) with TBARS assay. Six compounds (III, IV, V, VI, IX, X) which have antioxidant factor showed significant activities.
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문제 정의
이상과 같이 백출은 근경에 대한 연구만 되어 있을 뿐 이른 봄에 나물로 먹는 지상부의 성분 및 활성연구는 없음에 착안하여 백출 지상부의 본초학적 고찰 그리고 최근 여러 문헌의 연구를 토대로 하여 백출의 항산화 및 지질과산화 억제작용에 대한 활성의 가능성 등에 착안하여 실험을 실시하였다.
제안 방법
'각 시료의 LDL 지질과산화 억제효과를 비교검토하기 위해서 C/+에 의해 유도되는 과산화지질의 생성을 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC50}을 측정하였다.
Compound II - 백출 지상부의 물가용부 엑스를 diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 '얻은 30% 엑스를 sephadex LH-20으로 column chromatography(이동상 : 20% MeOH)를 실시하여 fraction 1~13을 얻었으며 이 중 fraction 7 을 다시 sephadex LH-2Q으로 column chromatography(이동상 : 50% MeOH)를 실시하여 결정이 생성된 tubes를 50% 메탄올로 수 회 세척한 후 감압여과하고 감압농축하여 미황색 compound 11(128 mg)를 얻었다.
Compound V- 백출 지상부의 물가용부 엑스를 diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 얻은 30% 엑스를 sephadex LH・20으로 column chromatography(이동상 : 20% MeOH)를 실시하여 fraction 1~13을 얻었으며, 이 중 fraction 7 을 디시 sephadex LH・2Q으로 column chromatography(이동상 : 50% MeOH)를 실시하여 다시 fraction 1~3을 얻었다. 이 중 fraction 1을 감압농축하여 황색 compound V(51mg)를 얻었다.
Compound VI- 백출 지상부의 물가용부 엑스를 diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 얻은 30% 엑스를 sephadex LH・20으로 column chromatography(이동상 : 20% MeOH» 실시하여 fraction 1~13을 얻었으며, 이 중 fraction 7 을 다시 sephadex LH・2Q으로 column chromatography(이동상 : 50% MeOH)를 실시하여 다시 fraction 1~3을 얻었다. 이 중 fraction 3을 감압농축하여 황색 compound VI(112 mg)를 얻었다.
Compound VIH- 백출 지상부의 물가용부 엑스를 diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 얻은 60% 엑스를 sephadex LH-20으로 column chTomatography(이동상 : 20% MeOH)를 실시하여 fraction 1~21을 얻었으며, 이 중 fraction 9 를 감압농축하여 진황색 compound VIml(167 mg)를 얻었다.
Compound VI「백출 지상부의 물가용부 엑스를 diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 얻은 60% 엑스를 sephadex LH・20으로 column chromatography(이동상 : 20% MeOH)를 실시하여 fraction 1~21을 얻었으며, 이 중 fraction 15의 결정이 생성된 tubes# 70% 메탄올로 수 회 세척한 후 감압 여과하고 감압농축하여 흰색 compound VU(228mg)를 얻었다.
Compound X- 백출 지상부의 물가용부 엑스를 diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 얻은 60% 엑스를 sephadex LH-20으로 column chromatography(이동상 : 20% MeOH厝 실시하여 fraction 1~21을 얻었으며, 이 중 fraction 19를 감압 농축하여 황색 compound X(51mg)를 얻었다.
Compound Ⅲ - 백출 지상부의 물가용부 엑스를 diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 얻은 30% 엑스를 sephadex LH-20으로 column chromatography(이동상 : 20% MeOH)를 실시하여 fraction 1~13을 얻었으며 이 중 fraction 8 를 감압농축하여 담황색 compound IU(24mg)을 얻었다.
Human plasma LDL(400 昭 단백질, Sigma), ImM CuSO4 16 [d, 농도별로 조제한 각 시료(25, 50, 100, 200, 500, 1000 ppm) 100 B에 PBS(pH 7.4)를 섞어 전체 부피가 ImZ가 되도록 하였다. Vbrtex mixer로 혼화하여 37℃ 수욕 상에서 4시간 동안 진탕 배양하여 산화시킨 후 ImM EDTA 20|J를 첨가하여 산화를 중지시켰다.
강한 항산화 활성을 나타낸 30% MeOH 분획과 60% MeOH 분획을 Sephadex LH-20을 이용한 column chromatography를 반복 실시하여 다음의 1皈}지 compounds를 분리하였다(Scheme 1).
강한 활성을 나타내는 30% MeOH 분획과 60% MeOH 분획을 각 종 gel column chmmatography를 실시하여 10개의 phenolic compound들을 분리하였으며 이들의 물리화학적 성상과 각종 기기분석 (MS, 1H-NMR, 13C-NMR) 결과를 통해 compound I을 3-feruloylquinic acid, 18'23-1 compound II를 apigenin-8-C-p-D-glu-copyranoside, 21, 24-26) compound Ⅲ를 4-caffeoyl-luteolin-6-C-p-D-glucopyranoside, 19'26) compound IV를 4, 5-di-O-caffeoylquinic acid, '心)compound V을 ferulic acid, 19-20) compound VI을 luteloin-6-C-p-D-glucopyranoside, 22, 24'26) compound VII을 7-methoxy-pinocembrin-7-O-p-D-glucopyranoside, 21, 24-26) compound VHI를 apigenin-6-C-P-D-glucopyranoside, 21, 24'26) compound IX을 3, 5-di-O-caffeoylquinic acid, 18-23) compound X를 luteolin24-26) 로 확인, 동정하였다.
또한 이들 4가지 분획물에 대하여 TBARS assay를 이용한 Cu2+-induced LDL lipid peroxidation에 대한 억제 효과를 실험하였다. 그 결과 60% MeOH, 30% MeOH분획에서 효과를 관찰할 수 있었다(60% MeOH분획>30% MeOH분획느100% MeOH・분획 그 HzO분획 그 CHCq분획).
8 g을 얻었다. 물 엑스를 다공성 비이온상 교환수지인 Diaion HP-20 column chromatography를 실시하여 물 분획물 148.4 g, 30% MeOH 분획 19.8g, 60% MeOH 분획 14.0 g, MeOH 분획 1.7 g을 각각 얻었다(Scheme 1).
백출 지상부의 MeOH 엑스의 물가용부를 Diaion HP-20에 흡착시킨 후 H2O, 30% MeOH, 60% MeOH, MeOH로 용출 시켜 각각의 분획물을 얻었고 이들 4가지 분획물에 대해서 DPPH radical에 대한 scavenging activity로 activity guided fractionation 을 하였다. 그 결과 30% MeOH 및 60% MeOH 분획에서 효과가 우수한 radical scavenging activity를 보이는 것을 관찰할 수 있었다(60%분획 >30%분획느 100%분획 >CHC】3분획 분획).
분리된 성분의 항산화 활성 - 백출 지상부 각각의 분획에 대한 항산화 활성 실험 결과 활성을 보인 30% MeOH, 60% MeOH 분획에서 분리한 10개 화합물의 항산화 활성 측정을 위해 DPPH 법에 의한 각각의 radical scavenging activity와 LDL의 지질 과산화에 대한 억제 효과를 측정하였다.
산화된 LDL용액에 25% trichloroacetic acid 1 ml를 넣어 단백질을 침전시킨 후 그 상등액에 1% thiobarbituric acid Im® 첨가하여 9RC에서 발색시킨 후 냉각시켰다. 생성된 MDA의 양을 532nm에서 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
양성 대조 약물로는 L・ascorbic acid를 25, 50, 100, 200, 500, 1000ppm(99.5% ethanol)의 6가지 농도로 용시 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능 (Electron donating ability EDA%) 고} K%。치 (DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 농도)로 나타내었다3D 이후 효과가 좋은 fraction과 단일물질 등은 농도를 낮게(25, 50, 100, 200, 500 ppm) 하여 같은 방법으로 측정하였다.
5% ethanol)의 6가지 농도로 용시 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능 (Electron donating ability EDA%) 고} K%。치 (DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 농도)로 나타내었다3D 이후 효과가 좋은 fraction과 단일물질 등은 농도를 낮게(25, 50, 100, 200, 500 ppm) 하여 같은 방법으로 측정하였다.
대상 데이터
TLC 확인시험에는 Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany)를 사용하여 이동상 CHC13: MeOH: H2O (70:30 : 4), CHC13: MeOH: H20(90 : 20:2), Benzene: EtOAC: EtOH(2 :1:1)와 Hexane: EtOAc(l :1, 2:1)의 조성을 이용하였고, 검출시绊으로는 Ethanolic-FeCq solution斗 10%-H2SO4 in EtOH(heating)에서 발색을 하였고 UV-lamp(254 nm)에서도 확인을 하였다. Column Chromatography에 사용한 G可은 Diaion HP-20(Nippon Rensui Co. Japan), Sephadex LH-2O(25~]00im, Pharmacia, Sweden)를 사용하였다. 시약으로는 L-Ascorbic acid, Human plasma LDL, 1, 1, 3, 3-Tetraethoxypropane, Trichloroacetic acid(Sigma Chemical Co.
Union 55R(Korea) 를 사용하였다. FAB-MS spectrometer 측정에 사용된 것은 VG 70-VSEQ(England)이고 Source는 이온화 된 35 keV Cs+ ion beam을, Matrix는 glycerol을 사용하였다.
FAB-MS spectrometer 측정에 사용된 것은 VG 70-VSEQ(England)이고 Source는 이온화 된 35 keV Cs+ ion beam을, Matrix는 glycerol을 사용하였다. iH-NMR spectrometer는 Bruker, Avance-500, 500 MHz (USA)를, 13C-NMR spectrometer는 Bruker, Avance 500, 125 MHz(USA)를 사용하였다. TLC 확인시험에는 Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany)를 사용하여 이동상 CHC13: MeOH: H2O (70:30 : 4), CHC13: MeOH: H20(90 : 20:2), Benzene: EtOAC: EtOH(2 :1:1)와 Hexane: EtOAc(l :1, 2:1)의 조성을 이용하였고, 검출시绊으로는 Ethanolic-FeCq solution斗 10%-H2SO4 in EtOH(heating)에서 발색을 하였고 UV-lamp(254 nm)에서도 확인을 하였다.
본 실험에 사용한 백출0圳zc网泌s macrocephala) 지상부는 2002년 8월에 화순에서 채취하여 중앙대학교 약학대학 약품자원식물학실에서 식물학적 감정을 거친 후 음건한 2.16kg을 재료로 사용하였다.
Japan), Sephadex LH-2O(25~]00im, Pharmacia, Sweden)를 사용하였다. 시약으로는 L-Ascorbic acid, Human plasma LDL, 1, 1, 3, 3-Tetraethoxypropane, Trichloroacetic acid(Sigma Chemical Co., U.S.A.), Thiobarbituric acid(Fluka Chemika, Germany), Ethylenediaminetetraacetic acid-2Na, 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl를 사용하였다.
성능/효과
30% MeOH분획, 60% MeOH분획이 각각 19.05 μg/m/, IC50 18.85 μg/m/로 우수한 radical scavenging activity를 나타내었다(Table Ⅲ, Fig. 3, 4).
DPPH를 이용한 항산화능 측정 - 각 화합물을 농도별 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ppm으로 조제하여 각각의 compound의 DPPH radical에 대한 scavenging activity를 실험한 결과 compound in, IV X번은 positive control인 L-ascorbic acid와 비교하여 우수한 radical scavenging activity를 나타내었다 (Fig. 2).
DPPH를 이용한 항산화능 측정 - 백출 지상부의 MeOH 추출물 중 수용성 분획을 Diaion HR20에 흡착시 킨 후 H2O, 30% MeOH, 60% MeOH, MeOH을 사용 분획한 분획물을 농도별로 (100, 200, 500, 1000, 2000, 3000 ppm) 조제하여 DPPH radical 소거횔성을 측정한 결과 30% MeOH 분획과 60% MeOH 분획의 radical scavenging activity는 우수하였으며 60% MeOH 분획 >30% MeOH분획 > 100% MeOH분획 >CHC1;;분획 >足0 분획 순으로 농도 의존적으로 radical scavenging activity가 증가하였다. 30% MeOH분획, 60% MeOH분획이 각각 19.
LDL 산화에 대한 억제효과 측정 - 각각의 분획물을 6가지 농도에 대하여 LDL 지질과산화에 대한 억제활성을 실험한 결과 대조약물인 ascorbic acid와 비교하였을 때 백출 지상부의 지질 과산화에 대한 억제활성은 우수하였으며, 특히 60% MeOH 분획이 IC50 1.3 瞄向로 강한 활성을 나타내었다(Fig. 5).
LDL 산화에 대한 억제효과 측정 -30% MeOH 분획 및 60% MeOH 분획에서 분리한 각 화합물을 농도별로(25~1000 ppm) LDL 지질과산화에 대한 억제활성을 실험한 결과 compound IU, IV에서 양성대조약물로 사용한 L-ascorbic acid(IC50 1.361 gg/mZ) 보다 우수하거나 유사한 억제효과를 보였다(Fig. 6).
각각의 성분에 대한 항산화 활성 실험 결과 compound VII이 다른 화합물보다 활성이 낮음을 알 수 있었고 이는 flavonoid Bring의 ・OH기가 항산화 활성에 positive factor 임을 나타내는 증거라 할 수 있다. 또한 플라보노이드 구조인 화합물은 DPPH를이용한 radical scavenging activity가 phenylpropanoids 구조인 다른 화합물에 비해 우수한 반면 LDL을 이용한 과산화지질 억제 효과는 ca任eoyl기나 quinic acid의 ・OH에 좀더 기인하는 것으로 사료된다.
하였다. 그 결과 30% MeOH 및 60% MeOH 분획에서 효과가 우수한 radical scavenging activity를 보이는 것을 관찰할 수 있었다(60%분획 >30%분획느 100%분획 >CHC】3분획 분획).
그 결과 60% MeOH, 30% MeOH분획에서 효과를 관찰할 수 있었다(60% MeOH분획>30% MeOH분획느100% MeOH・분획 그 HzO분획 그 CHCq분획).
후속연구
이 실험결과를 통해 산채로 사용되거나 버려지는 백출 지상부가 기능성 식품 및 산채로서 천연항산화제의 개발가능성이 높다고 시료되며 특히 지상부의 성분과 엑스를 이용한 천연항산화제의 개발가능성이 높다고 사료된다.
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