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문제 정의
- 본 연구에서는 genistein?] 햄스터의 정상 난소세포에서의 ROS 발생과 관련된 기전을 살펴보고자 하였다.
- 본 실험에서는 특별히 여성들에게 유방암에 유익한 성분으로알려진 isoflavonoid인 genistein이 암세포가 아닌 정상 난소세포에서 ROS level 및 관련된 항산화효소의 활성에 미치는 영향을알아보고자 하였다. 이를 연구하기 위해 설치류의 난소 상피세포인 Chinese hamster ovary-Kl(CHO-Kl) 세포를 사용하여 세포 생존율, 항산화 효소의 활성, ROS level, 항산화 효소의 유전자 발현 정도를 검토하여 약간의 지견을 얻었으므로 보고하고자한다.
- 본 연구에서는 genistein?] 햄스터의 정상 난소세포에서의 ROS 발생과 관련된 기전을 살펴보고자 하였다.
- 하였다. 이를 연구하기 위해 설치류의 난소 상피세포인 Chinese hamster ovary-Kl(CHO-Kl) 세포를 사용하여 세포 생존율, 항산화 효소의 활성, ROS level, 항산화 효소의 유전자 발현 정도를 검토하여 약간의 지견을 얻었으므로 보고하고자한다.
가설 설정
- ROS는 방사선, 염증, 공기 오염물질 (。3, NO2), 담배연기, repurfusion injury 허혈 등과 같은 비정상적인 조건에서 과도하게 생산된다.4, 18)血 0初o에서 ROS의 역할은 양면성을 가지고 있다. 긍정적인 측면은 생물학적으로 중요한 화합물의 합성, 세포내의 신호, 세포 성장의 조절, 식균작용, 에너지 생성에 관여한다.
제안 방법
- 5)을 만든다. 이 substrate solution 1 m/에 각 sample 50 μ/를 가한 후 43、6M」cm"의 exitinction coefficient를 사용하여 UV/visible spectrophotometer로 240nm에서 phosphate buffer를 blank로 하고 30초마다 1분 동안 흡광도를 측정하였다.
- CHO-K1에서 genistein의 농도별 세포 생존률을 알아보기 위해 MTT assay를 실행하였다. 배양 기간은 2일로 고정하였으며 genistein의 농도는 12.
- Genistein을 햄스터 난소세포인 CHO-K1에 처리하여 생존율을 측정한 결과 약 70% 이상의 생존율을 보인 100 pM을 최고농도로 하여 실험을 실행하였다(Fig. 3). Genistein이 세포 내 ROS level에 미치는 영향을 조사한 결과, ROS가 control과 비교하여유의성 있게 증가하는 것으로 나타났다.
- 7%) 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하여 200|iM에서는 세포 생존률이 47%로 저하되었다. Genistein의 농도가 100皿일 때 세포 생존률이 73% 였으므로 이 농도를 최고 농도로 하여 실험을 시행하였다 (Fig. 2).
- GPx의 반응 동안 gh曲thione(GSSG)은 GSH의 일정 농도에 대해서 제공되는 과잉의 glutathione reductase(GR)에 의해 환원되며 이때 reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphM(NADPE의 산화를 관찰하였다. 0.
- CHO-K1에서 genistein의 농도별 세포 생존률을 알아보기 위해 MTT assay를 실행하였다. 배양 기간은 2일로 고정하였으며 genistein의 농도는 12.5~200(1M 범위에서 실험을 시행하였다. Genisteine 낮은 농도(12.
- 본 연구에서는 genistein을 햄스터 난소세포인 CHO-K1에 처리하여 항산화효소 활성, ROS level, 항산화 효소의 발현을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- 본 연구의 그래프와 표의 모든 수치는 각 실험 횟수에 대한 평균과 표준오차로 표시하였으며, 모두 triplicate s여로 세 차례 이상 수행하였다. 각 sample의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student t・test를 시행하여 계산하였다.
- 이 화합물은 地。2나 superoxide에의해 산화될 때 형광을 나타낸다. 산화된 2', 7-dicholrofluorescein (DCF)의 형광성은 485 皿의 excitation wavelength와 530 nm 의 emission wavelength에서 측정하였다.⑰
- 시료를 농도별로처리한 후 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해준다. 상온에서 50 jiM 2', 7'-dicholrofluorescein diacetate(DCF-DA)를 처리 한후 cytofluor 2350 plate reader를 이용하여 5분 간격으로 측정하였다. DCF-DA는 세포 투과성 염료로 RO&의 세포 내 변화를볼 때 일반적으로 사용된다.
- 시료의 처리와 단백질 정량 -3X106 cells/mZ의 CHO-K1 cell suspensior으 100兀 tissue culture dish에 가하였다. 배양기에서 24시간 동안 안정화 시킨 후 genistein 및 다른 항산화제를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다.
- 5) 1 nV에 각각의 sample을 50 讨씩 가하고 5분 동안 예배양시켰다. 여기에 5mM hematoxylin을 30 pZ을 가한 후 phosphate buffer를 blank로 하여 UV/visible spectrophotometer 를 사용해 568nm에서 흡광도를 측정하였고 5분 후 다시 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 1m/을 각각 넣은 후 5분간 예배양시켰다. 여기에 각각의 sample을 가하여 UV/visible spectrophotometer로 340nm에서 흡광도를 측정하고 5분 후 다시 흡광도를 측정하였다.
- 대표적인 항산화 효소이다. 이들 항산화 효소들이 genistein 의 농도에 따라 효소 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해 genistein을 다양한 농도로 처리하여 SOD, GPx, CAT의 활성 변화를 측정하였다. Genistein 50, 100pM에서 SOD활성이 각각 control 대비 52%, 69%으로 유의적으로 감소하였다(Fig.
- 이에 따라 CHO-K1에서 genistein이 세포 내 ROS 발생에미치는 영향을 조사하기 위해 ROS leve卜을 측정하였다. 그 결과, genistein을 12.
- 확인할 수 있었다. 이에 따라 유전자 수준에서 SOD, GPx, CAT 발현량을 조사하기 위해 RT-PCR을 실행하였다. Genistein 의 25, 50, 100 皿에서 유전자 발현을 조사한 결과 CuZnSOD 의 발현이 control 대비, lOOeM에서 46%(P<0.
- Cycling 조건과 primer의 sequence는 Table I과 같다. 증폭된 RT-PCR 산물은 1.5% agarose gel로 전기영동을 한 후, ethidium brimide 염색으로 검출하였다.
- 이 산화적 스트레스 유발과 항산화 효소계의 연관성을 조사한 결과 genistein 처리시 SOD 효소활성의 감소되었고 CAT와 GPx의 활성은 영향은 받지않았다. 항산화 효소계의 유전자 발현정도를 알아보기 위해 RT-PCR을 시행하였다. 그 결과 CuZnSOD의 유전자 발현이 저하되는 것을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 항생제(10, 000 imits/m/ penicillin G sodium, 10, 000 pg/mZ streptomycin sulfate), 1 mM sodium pyruvate를 포함하는 RPMI 1640 배지를 배양액으로 하여 37℃, humidified 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 25 cm3 tissue culture fla아【나 75 cm3 tissue culture flask에서계대 배양하였고 confluent되었을 때 cell dissociation solution을처리하여 실험에 이용하였다.
- Chinese hamster ovary로부터 유래된 CHO-K1 celEe ATCC (American type culture collection )으로부터 분양 받았다. 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 항생제(10, 000 imits/m/ penicillin G sodium, 10, 000 pg/mZ streptomycin sulfate), 1 mM sodium pyruvate를 포함하는 RPMI 1640 배지를 배양액으로 하여 37℃, humidified 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 세포주는 Chinese hamster ovary(CHOKL)을 American typeculture collection(ATCC)에서 구입하였다.
- Sigma Co.에서, easy-blue total RNA extraction kit, 100 bp ladder; power cDNA synthesis kit, i-laq DNA polymerase, AMV reverse transcriptasee iNtRoN Biotechnology Inc에서 구입하여 사용하였다. ELISA reader는 Bio-lek instrument Inc.
데이터처리
- 수행하였다. 각 sample의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student t・test를 시행하여 계산하였다.
이론/모형
- Glutathione pen)xidase(GPx)£| 활성측정 -GPx의 활성은 円glia와 Sletine의 방법에 의해 spgtmphotometer를 사용하여 측정하였다.” GPx의 반응 동안 gh曲thione(GSSG)은 GSH의 일정 농도에 대해서 제공되는 과잉의 glutathione reductase(GR)에 의해 환원되며 이때 reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphM(NADPE의 산화를 관찰하였다.
- Lysis buffer를 가한각각의 samp!禮을 14, 000 ipm, 4。(:에서 5분간 원심분리한 후 상층액만을 취하여 enzyme assay sample로 사용하였다. Sample protein의 정량은 bovine serum albumin(BSA)을 standard로 사용하여 BCA(bicinchonic acid) protein assay을 하였다.⑸
- Superoxide dismutase(S0D)2| 활성 측정 - SOD 활성 즉정은 hematoxylin을 이용한 Martin의 방법'免을 사용하였다. Hematoxyline 자연상태에서 붉은색인 hematin으로 자가 산화한다.
성능/효과
- 3. 항산화효소의 발현을 연구한 결고!", CuZnSOD의 발현은 저하되었으나 MnSOD, GPx, Catalase의 발현은 control과 비교하였을 때 거의 영향이 없었다.
- 2. 항산화효소인 SOD의 활성이 저하되었으나 GPx나 Catalase 의 활성에는 거의 변화가 없었다.
- 이들 항산화 효소들이 genistein 의 농도에 따라 효소 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해 genistein을 다양한 농도로 처리하여 SOD, GPx, CAT의 활성 변화를 측정하였다. Genistein 50, 100pM에서 SOD활성이 각각 control 대비 52%, 69%으로 유의적으로 감소하였다(Fig. 4). CAT(Fig.
- 5~200(1M 범위에서 실험을 시행하였다. Genisteine 낮은 농도(12.5 pM)에서는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았으나(98.7%) 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소하여 200|iM에서는 세포 생존률이 47%로 저하되었다. Genistein의 농도가 100皿일 때 세포 생존률이 73% 였으므로 이 농도를 최고 농도로 하여 실험을 시행하였다 (Fig.
- 3). Genistein이 세포 내 ROS level에 미치는 영향을 조사한 결과, ROS가 control과 비교하여유의성 있게 증가하는 것으로 나타났다. 이 산화적 스트레스 유발과 항산화 효소계의 연관성을 조사한 결과 genistein 처리시 SOD 효소활성의 감소되었고 CAT와 GPx의 활성은 영향은 받지않았다.
- 항산화 효소계의 유전자 발현정도를 알아보기 위해 RT-PCR을 시행하였다. 그 결과 CuZnSOD의 유전자 발현이 저하되는 것을 알 수 있었다. 이것은 항산화효소 활성의 감소가 유전자발현 저하에 의한 것임을 나타내는 결과라 할 수 있다.
- 이에 따라 CHO-K1에서 genistein이 세포 내 ROS 발생에미치는 영향을 조사하기 위해 ROS leve卜을 측정하였다. 그 결과, genistein을 12.5, 25, 50, 100 pM 을 처리하였을 때 ROS level 이 증가함을 알 수 있었다. 특히 , genistein 최고 농도 100 pM에서 control에 대비 43.
- Genistein이 세포 내 ROS level에 미치는 영향을 조사한 결과, ROS가 control과 비교하여유의성 있게 증가하는 것으로 나타났다. 이 산화적 스트레스 유발과 항산화 효소계의 연관성을 조사한 결과 genistein 처리시 SOD 효소활성의 감소되었고 CAT와 GPx의 활성은 영향은 받지않았다. 항산화 효소계의 유전자 발현정도를 알아보기 위해 RT-PCR을 시행하였다.
- 이상의 실험 결과, genistein0] 햄스터 난소세포에서 산화적 스트레스를 유도하여 세포의 항산화효소계에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 5, 25, 50, 100 pM 을 처리하였을 때 ROS level 이 증가함을 알 수 있었다. 특히 , genistein 최고 농도 100 pM에서 control에 대비 43.6%(P<0.01)가 증가하였다(Fig. 3).
후속연구
- 많은 질병에 유효하게 적용되어지는 genistein이지만 햄스터의 정상 난소세포에서는 오히려 산화적 스트레스를 주어 ROS의 level이 높아지는 것을 볼 때 정상적인 상태에서 genistein이 다량으로 장기간 섭취 할 경우 햄스터의 정상 난소세포에서는 오히려 산화적 스트레스를 일으키게 된다. 이를 보완 할 수 있는 항산화제의 첨가를 고려해 볼 때 앞으로 이와 관련된 연구가 많이 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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