KN배지에서 상추 자엽과 제1엽 절편체로부터 식물체 재분화율을 품종별 비교 했을 때, 자엽에서 정통포기 품종이 91.3%로 가장 높게 나타났고, 고향뚝적축면 품종이 52.3%, 청치마 품종이 35.4%로 가장 낮게 나타났다. 제1엽에서도 정통포기 품종이 85.9%로 가장 높게 나타났고, 고향뚝적축면품종이 50.8%, 청치마 품종에서 30.3% 효운을 나타내었다. 재분화 효율이 가장 낮은 청치마 품종의 재분화 효율을 높이기 위해 다양한 재분화 배지를 사용하여 청치마 품종의 자엽과 제1엽의 식물체 재분화 효율을 비교했다. 자엽에서 재분화 효율은 Kl 배지와 SH 배지, NB 배지에서 거의 평균 77.2%의 높은 재분화 효율을 나타내었고, MSD3 배지에서는 그 보다 낮은 61.1%의 효율을 나타내어 모든 배지에서 KN배지 보다 높게 나타났다. 제1엽에서도 SH 배지에서 85.0%로 가장 높게 나타났고, Kl 배지에서 80.7%, NB 배지에서 67.4%, MSD$_3$배지에서 61.0%의 효율을 나타내어 KN배지보다 모두 높게 나타났다. 따라서 본 실험의 결과 상추의 자엽과 제 1엽 절편체들로부터 효율적인 재분화는 정통포기 품종의 자엽을 K띠 배지에 배양했을 때 가장 효율적으로 나타났으며, 청치마 품종에서는 제 1엽을 SH 배지와 Kl 배지에 배양했을 때 재분화가 효율적인 것으로 나타났다.
KN배지에서 상추 자엽과 제1엽 절편체로부터 식물체 재분화율을 품종별 비교 했을 때, 자엽에서 정통포기 품종이 91.3%로 가장 높게 나타났고, 고향뚝적축면 품종이 52.3%, 청치마 품종이 35.4%로 가장 낮게 나타났다. 제1엽에서도 정통포기 품종이 85.9%로 가장 높게 나타났고, 고향뚝적축면품종이 50.8%, 청치마 품종에서 30.3% 효운을 나타내었다. 재분화 효율이 가장 낮은 청치마 품종의 재분화 효율을 높이기 위해 다양한 재분화 배지를 사용하여 청치마 품종의 자엽과 제1엽의 식물체 재분화 효율을 비교했다. 자엽에서 재분화 효율은 Kl 배지와 SH 배지, NB 배지에서 거의 평균 77.2%의 높은 재분화 효율을 나타내었고, MSD3 배지에서는 그 보다 낮은 61.1%의 효율을 나타내어 모든 배지에서 KN배지 보다 높게 나타났다. 제1엽에서도 SH 배지에서 85.0%로 가장 높게 나타났고, Kl 배지에서 80.7%, NB 배지에서 67.4%, MSD$_3$배지에서 61.0%의 효율을 나타내어 KN배지보다 모두 높게 나타났다. 따라서 본 실험의 결과 상추의 자엽과 제 1엽 절편체들로부터 효율적인 재분화는 정통포기 품종의 자엽을 K띠 배지에 배양했을 때 가장 효율적으로 나타났으며, 청치마 품종에서는 제 1엽을 SH 배지와 Kl 배지에 배양했을 때 재분화가 효율적인 것으로 나타났다.
The efficient system for plant regeneration from cotyledon and primary feat explants of lettuce was established. Plant regeneration efficiency was shown 91.3% from cotyledon and 85.9% from primary leaf explants of variety 'Jungtongpogi' in KN medium. Plant regeneration efficiency was also estimated ...
The efficient system for plant regeneration from cotyledon and primary feat explants of lettuce was established. Plant regeneration efficiency was shown 91.3% from cotyledon and 85.9% from primary leaf explants of variety 'Jungtongpogi' in KN medium. Plant regeneration efficiency was also estimated with various plant regeneration media in variety' Chungchima', which was lowest plant regeneration efficient showing 35.4% from cotyledon and 30.3% from prima leaf explants in KN medium. Kl medium increased 77.9% and 80.7% of plant regeneration efficiencies from cotyledon and primary leaf explants of variety 'Jungtongpogi' were cultured on KN medium. In case of varie쇼 ‘Chungchima', efficient plant regeneration was shown when primary leaf explants were cultured on SH and KI media.
The efficient system for plant regeneration from cotyledon and primary feat explants of lettuce was established. Plant regeneration efficiency was shown 91.3% from cotyledon and 85.9% from primary leaf explants of variety 'Jungtongpogi' in KN medium. Plant regeneration efficiency was also estimated with various plant regeneration media in variety' Chungchima', which was lowest plant regeneration efficient showing 35.4% from cotyledon and 30.3% from prima leaf explants in KN medium. Kl medium increased 77.9% and 80.7% of plant regeneration efficiencies from cotyledon and primary leaf explants of variety 'Jungtongpogi' were cultured on KN medium. In case of varie쇼 ‘Chungchima', efficient plant regeneration was shown when primary leaf explants were cultured on SH and KI media.
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문제 정의
그러나 상추의 자엽과 제 1엽 절편체들로부터 재분화 효율에 관해서는 언급되지 않았다. 따라서 본 실험에서는 식물생명공학 기법을 이용한 새로운 기능성 형질전환체 상추 개발을 위한 전 단계로서 상추의 식물체 재분화 효율을 극대화 시킬 수 있는 방법을 개발하고자한다.
하지만 본 실험에서는 생장조절제가 첨가되지 않은 MS 기본배지에 재분화된 shoot를 배 양 했을 때 모든 식물체에서 건강한 뿌리가 형성되었으며, 비슷한 결과들을 여러 연구자들에 의해 상추로부터 보고 되었다[4, 11, 14, 20]. 따라서 본 연구는 상추 종자 파종 후 6일째와 10일째의 유묘가 자엽과 제1엽 절편체의 실험재료로 사용하기에 적당했으며, 또한 자엽이나 제1엽의 절편체들로부터 재분화 효율을 높힐 수 있는 배지를 규명하였으며 개화된 완전한 식물체들을 성장시킴으로써 이 기술을 이용하여 AgrobacferM을 매개로 하는 높은 효율의 형질전환체 상추를 개발할 수 있는 기초실험을 확립하였다.
재분화율이 가장 낮게 나타난 청치마 품종은 국내 연구자들에게 Agrobacterium- 이용한 형질전환 실험에 가장 많이 사용되는 품종이며[4, 7, 11, 14, 2이, 이 품종에 대한 재분화 효율이나 형질전환 효율에 관해서는 보고되지 않았다. 따라서 재분화 효율이 낮은 청치마 품종을 대상으로 다양한 배지를 사용하여 재분화 효율을 높이는 최적의 조건을 규명하였다.
제안 방법
본연구에서 KN 배지에서 재분화율이 낮은 청치마 품종을 대상으로 재분화 효율을 높이기 위해 다양한 배지를 사용하여 재분화율을 조사 했는데 KI 배지, SH 배지, NB 배지에서 KN 배지 보다 거의 2배 이상 재분화율이 향상되었다. KI 배지와 SH 배지는 kinetin과 auxin 종류로는 NAA 대신에 IAA를 첨가한 배지이며 두 가지 배지 시스템을 사용했다. KI 배지 경우에는 절편체들을 7일 동안 kinetin과 IAA가 첨가된 배지에 배양 후 낮은 농도의 kinetin (0.
2)에서 유도 될 수 있으나 같은 농도에서 잎 조직으로부터 shoot 형성은 극히 드물다고 보고했다. 본 실험에서는 처음에 사용한 식물체 재분화 배지인 KN 배지는 2 mg/1 kinetin (9.3)1M)과 0.1 mg/1 NAA (0.54 nM)가 첨가 되었으며, 실험한 모든 품종의 자엽과 제 1엽 절편체부터 shoot가 재분화되었다. 그 중 정통포기 품종의 자엽 절편체로부터는 91.
상추 품종 청치마, 고향뚝적축면, 정통포기의 종자들을 생장조절제가 첨가되지 않은 MS 기본배지에서 발아 시킨 우, 자엽과 제 1엽 절편체들을 MS 기본배지에 2 mg/1 kinetin과 0.1 mg/1 NAA가 첨가된 KN 배지에 치상 하였다 (Fig. la, Fig. 2a). 배양 3주까지는 절편체의 크기가 증가하면서 절단면 주위에 많은 캘러스가 형성 되면서, shoot가 분화되기 시작했다 (Fig.
재분화 효율이 가장 낮은 청치마 품종의 재분화 효율을 높이기 위해 파종 후 6일된 청치마 품종의 자엽 절편체들과 발아 후 10일된 제 1엽 절편체들을 다양한 식물체 재분화 배지에 치상하여 4주 후 각 배지 당 그들의 재분화 효율을 조사했다. 각 배지 당 식물체 재분화 효율은 2회 반복 실험을 합산하여 Table 2에 나타내었다.
1 mg/1)가 첨가된 배지(KN 배지)가 들어있는 Petri dish 당 10개의 절 편 체 들을 치상하여 16시간 빛 상태와 8시간 암 상태로 조절된 26℃±1 온도로 유지되는 배양실에서 배양하였다. 치상된 절편 체 수는 3 반복 독립적인 실험에 사용된 절편체 수를 모두 합하여 전체 개수로 나타내었으며, 품종 별 식물체 재분화효율은 배양 6주 경과 후 비교 조사하였다.
05 mg/1 zeatin이 첨가된 배지에 절편체들을 옮겨 배양했다. 치상된 절편체 수는 2 반복 독립적인 실험에 사용된 절편체수를 모두 합하여 전체 개수로 나타내었으며, 4 주 후 그들의 재분화 효율을 조사했으며 기존에 사용한 KN 배지와 비교 분석했다. 재분화된 각 식물체들을 식물호르몬이 첨가되지 않은 MS 기본 배지에서 뿌리를 유도한 다음 원예 상토에서 순화시켜 화분에 옮겨 완전한 식물체로 성장 시켰다.
배지를 사용하였다. 파종 후 6일된 자엽 절편체와 10일 된 제 1엽 절편체들을 MS 기본배지에 1.0 mg/1 BAP와 2.0 mg/1 IAA가 첨가된 배 지 (MSD3)[2]와 0.04 mg/1 NAA와 0.5 mg/1 BAP가 첨가된 배지(NB 배지)에 치상하였다. MSD3 배지는 상추 원형질체로부터 유도된 캘러스에서 식물체 재분화를 유도한 배지이다[2].
대상 데이터
상추 시판종으로 '청치마' '고향뚝적축면' '정통포기' 품종들을 대상으로 파종 후 6일과 10일 된 상추 유묘의 자엽과제 1엽 절편체들을 실험 재료로 사용하였다.
실험에 사용된 품종 중에서 재분화 효율이 가장 낮은 청치마 품종은 국내의 상추 형질전환 실험에 가장 많이 사용되는 품종으로서 재분화 효율이 낮으면 형질전환 효율도 낮기 때문에 이 품종의 재분화 효율을 높이기 위해 여러가지 재분화 배지를 사용하였다. 파종 후 6일된 자엽 절편체와 10일 된 제 1엽 절편체들을 MS 기본배지에 1.
sec의빛 상태와 8시간 암 상태로 조절된 26℃+1 온도로 유지되는 배양실에서 발아시켰다. 실험에 사용한 절편체들은 끝부분과 양옆, 그리고 엽병 부위는 잘라내어 사각형 모양이 되게 했으며, 자엽과 제 1엽 당 각각 1개의 절편체를 절취하여 MS기본배지[18]에 kinetin (2 mg/1)과 NAA (0.1 mg/1)가 첨가된 배지(KN 배지)가 들어있는 Petri dish 당 10개의 절 편 체 들을 치상하여 16시간 빛 상태와 8시간 암 상태로 조절된 26℃±1 온도로 유지되는 배양실에서 배양하였다. 치상된 절편 체 수는 3 반복 독립적인 실험에 사용된 절편체 수를 모두 합하여 전체 개수로 나타내었으며, 품종 별 식물체 재분화효율은 배양 6주 경과 후 비교 조사하였다.
성능/효과
4). 그러나 식물체 재분화 배지로 사용된 KN 배지에서는 청치마 품종 자엽으로 식물체재 분화 효율이 35.4%인데 반하여 사용한 모든 배지에서 KN 배지보다 높게 나타났다. 청치마 품종 제1엽 절편 체로부터 재분화 효율은 KI 배지와 SH 배지에서는 각각 80.
3a). 두 번째로 고향뚝적축면 품종으로 자엽에서 52.3%, 제 1엽에서 50.8%의 shoot 재분화 효율 (Table 1, Fig. 3b)을 나타내었고, 청치마품종에서 가장 낮은 효율인 자엽과 제 1엽에서 각각 35.4%, 30.3%의 shoot 재분화 효율을 보였다 (Table 1). 전반적으로 사용된 세 품종 모두에서 제 1엽 보다 자엽에서 shoot 재분화율이 높게 나타났다.
#500-4 품종에서 세포 현탁 배양체들을 고형 배지에 배양 했을 때 가장 높은 shoot 분화율을 보고 했다. 본 실험에서는 L. sativa 3 품종에 대하여 자엽과 제 1엽을 대상으로 실험한 결과 정통포기 품종에서두 종류의 절편체 모두에서 재분화율이 가장 높게 나타났다. 재분화율이 가장 낮게 나타난 청치마 품종은 국내 연구자들에게 Agrobacterium- 이용한 형질전환 실험에 가장 많이 사용되는 품종이며[4, 7, 11, 14, 2이, 이 품종에 대한 재분화 효율이나 형질전환 효율에 관해서는 보고되지 않았다.
Choi등[5]도 kinetin과 NAA의 농도조절이 상추 절편체로부터 shoot 재분화에 가장 효과적이라고 보고 했지만 이것은 아마 사용한 품종에 따라 다르게 나타날 것이라 추정된다고 보고했다. 본연구에서 KN 배지에서 재분화율이 낮은 청치마 품종을 대상으로 재분화 효율을 높이기 위해 다양한 배지를 사용하여 재분화율을 조사 했는데 KI 배지, SH 배지, NB 배지에서 KN 배지 보다 거의 2배 이상 재분화율이 향상되었다. KI 배지와 SH 배지는 kinetin과 auxin 종류로는 NAA 대신에 IAA를 첨가한 배지이며 두 가지 배지 시스템을 사용했다.
각 배지 당 식물체 재분화 효율은 2회 반복 실험을 합산하여 Table 2에 나타내었다. 자엽에서 재분화 효율은 KI 배지와 SH 배지, NB 배지에서 거의 평균 77.2%의 높은 재분화 효율을 나타내었고, MSD3 배지에서는 그 보다 조금 낮은 61.1% 효율을 나타내었다(Fig. 4). 그러나 식물체 재분화 배지로 사용된 KN 배지에서는 청치마 품종 자엽으로 식물체재 분화 효율이 35.
많은 품종들로부터 다양한 절편 체 종류들이 실험 재료로 사용되었으나 비교적 자엽이 많은 연구에서 가장 많이 절편체로 사용되어졌는데 이는 자엽이 쉽고 빠르게 동일한 실험 재료를 얻을 수 있고 재분화도 잘되기 때문이다 [9, 10, 25]. 자엽의 나이에 관해서는 발아후 4일된 자엽 이 가장 재분화 잠재력 이 있고 재분화된 shoot 로부터 뿌리 유도도 잘되는 적합한 나이라고 보고 됐지만 [25], 본 실험에서는 발아 후 6일된 자엽을 사용했을 때도 shoot의 높은 재분화율을 나타내었다. Doershug과 Miller[9] 는 Iceberg head 상추 잎 절편체 40개로부터 60%의 재분화율을 획득했고 Grand Rapids 상추 품종 자엽 절편체 20개로부터 100%의 재분화율을 보고했다.
3%의 shoot 재분화 효율을 보였다 (Table 1). 전반적으로 사용된 세 품종 모두에서 제 1엽 보다 자엽에서 shoot 재분화율이 높게 나타났다. 많은 품종들로부터 다양한 절편 체 종류들이 실험 재료로 사용되었으나 비교적 자엽이 많은 연구에서 가장 많이 절편체로 사용되어졌는데 이는 자엽이 쉽고 빠르게 동일한 실험 재료를 얻을 수 있고 재분화도 잘되기 때문이다 [9, 10, 25].
2c), 이때 품종 별 식물체 재분화효율을 비교했다. 정통포기 품종에서 150개의 치상한 자엽 절편 체수로부터 137개의 절편체에서 shoot가 재분화되어 91.3%의 높은 재분화 효율을 나타내었고, 제 1엽에서는 170 개의 치상한 절편체수로부터 146개의 shoot가 재분화되어 85.9%의 역시 높은 효율을 나타내 었다 fTable 1, Fig. 3a). 두 번째로 고향뚝적축면 품종으로 자엽에서 52.
4%인데 반하여 사용한 모든 배지에서 KN 배지보다 높게 나타났다. 청치마 품종 제1엽 절편 체로부터 재분화 효율은 KI 배지와 SH 배지에서는 각각 80.7%와 85.0%의 높은 재분화 효율로 자엽보다도 높게 나타내었고, MSD3 배지와 NB 배지에서는 그 보다 낮은 61.0%와 67.4%의 효율을 나타내었다(Fig. 5). 제 1엽에서도 식물체 재분화 배지로 사용된 KN 배지에서 재분화 효율이 30.
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