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문제 정의
- 그러나 마황의 항산화능을 규명하는 연구는 드물어서 본연구를 토대로 마황 혹은 마황이 포함된 처방의 임상적인 활용을 넓힐 수 있는 가능성을 제시하고자 한다.
- 대한 연구는 찾아보기 어렵다. 본 연구는 체중감량 및 운동수행능력 향상효과에 대한 다양한 임상보고가 있으며, 임상에서 비만치료에 다용되고 있는 마황23,24,25,26)이 항산화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 계획되었다.
- 본 연구에서는 마황 추출물의 항산화작용을 규명하기 위해 간접적인 방법 중에서 가장 많이 사용되고 있는 총 항산화능(TAC), 총 항산화 반응<TAR), DPPH 유리 자유기 소거작용에 대한 실험 및 직접적인 방법으로 TOARS 분석을 통해마황의 지질과산화억제효과를 살펴보았으며, 그 외 천연물항산화물질인 페놀성 화합물의 함량을 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 측정하였다. DPPH 용액(45㎍/㎖ 메탄올)을 추출물과 혼합한 다음 515nm에서 흡광도의 감소를 30초 간격으로 5 분간 측정하였다. 유리 자유기 소거활성은 pyrogallol 용액 (125tzgM DMSO)의 흡광도 감소를 100%로 기준하여 표기하였다.
- 2로 나타났다. DPPH 용액과 신속히 혼합한시료의 흡광도 감소는 유리 자유기 소거활성을 나타내며, 시료의 유리 자유기 소거활성은 pyrogaUol 용액의 흡광도 감소를 100%로 기준하여 표시하였다.
- Rat liver mitochondria were incubated with FeSO4/ascorbic acid in the absence or presence of various concentrations of Ephedrae Herba extract. Lipid peroxidation was determined by measuring the release of TBARS. Each bar represents the meani SEM of duplicate determinations.
- TBARS 농도 측정을 위해 0, 16.2, 8.1, 4.05, 2.025, 1.013 및 0.506uM의 1, 1, 3, 3, -tetraethoxypropane을 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- 산성 pH에서 무색의 환원형 2, 2'-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS)는 HQ에 의해 청록색의 ABTS*로 산화되게 된다. 만일 추출물 내 항산화물질이 존재하게 되면 이들 농도에 비례하여 ABTS* 탈색되며, 이러한 색 변화반응의 결과는 660nm에서의 흡광도로 조사하였다. 시료 추출물의 TAG 측정을 위해 0, 0.
- 만일 추출물 내 항산화물질이 존재하게 되면 이들 농도에 비례하여 ABTS* 탈색되며, 이러한 색 변화반응의 결과는 660nm에서의 흡광도로 조사하였다. 시료 추출물의 TAG 측정을 위해 0, 0.15, 0.3, 0.6, 1.5, 2.25 및 3mM의 Trolox를 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- 이러한 반응은 444nm에서의 흡광도로조사하였다. 시료 추출물의 TAR 측정을 위해 0, 0.15, 0.3, 0.6, 1.5, 2.25 및 3mM의 Trolox를 표준시약으로 사용하여표준곡선을 작성하였다. TAR 활성은 mM Trolox equiva- lent로 표기하였다
- 시료 추출물의 총 페놀 함량 측정을 위해 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 1.67 및 2.5mM의 gallic acid를 표준시약으로 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- 지질과산화는 OH. 유리 자유기를 생성하는 FeSQ/ascorbic acid로유발시 켰으며, TOARS 농도를 측정함으로써 결정하였다.
- 추출물의 지질과산화 억제 효과는 흰쥐의 간 미토콘드리아 배양액의 thiobarbituric acid 반응 물질(TBARS) 농도를측정함으로써 결정하였다. 간 미토콘드리아(0.
- 흰쥐의 간 미토콘드리아(0.5mg 단백질/㎖)를 이용하여 추출물의 지질과산화에 미치는 영향을 조사하였다. 지질과산화는 OH.
대상 데이터
- (주)대한바이오링크로부터 구입한 6주령 수컷 Sprague- Dawley 흰쥐를 실험동물로 사용하였다. 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고, 사육실 온도는 20-25℃를 유지하였으며 명암은 12시간주기로 조절되었다.
- 마황은 정선된 제품을 경원대학교 부속한방병원에서 구입하여 본 연구의 시료로 사용하였다. 분쇄한 시료 34.
데이터처리
- 추출물 농도별 TBARS 농도는 일원분산분석 (one-way ANOVA)을 사용하여 분석하였으며, 농도별 평균값의 차이는 Duncan's multiple range test를 사용하여 p<0.05에서 유의성을 조사하였다.
이론/모형
- 종 항산회'능은7 Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) 방법29을 수정한 Erel"의 방법에 따라 TAC를 측정하였다. 산성 pH에서 무색의 환원형 2, 2'-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS)는 HQ에 의해 청록색의 ABTS*로 산화되게 된다.
- 본 실험실에서 사료와 물은 무제한 공급하였고, 사육실 온도는 20-25℃를 유지하였으며 명암은 12시간주기로 조절되었다. 1주일의 적응기간을 거친 다음 간을 절제한 후 Hovius 등28) 방법에 따라미토콘드리아를 분리하였다 .
- DPPH 유리 자유기 소거활성은 Malterud 등의 방법에 따라 측정하였다. DPPH 용액(45㎍/㎖ 메탄올)을 추출물과 혼합한 다음 515nm에서 흡광도의 감소를 30초 간격으로 5 분간 측정하였다.
- 단백질 함량은 bovine serum albumin(BSA)을 표준시약으로 사용하여 Lowiy 등의 방법에 따라 측정하였다.
- 미토콘드리아 배양액의 지질과산화는 Stacey와 Klaassen 의 방법에 따라 excitation 파장 530nm와 emission 파장 590nm에서 형광도를 측정함으로써 결정하였다.
- 유리 자유기 반응에 대한 총 항산화능은 ferric reducing/antioxidant power assay (FRAP) 방법을 수정한 Erel 의방법에 따라 TAR을측정함으로써 결정하였다. 산성 pH에서무색의 환원형 bdianisidinee Fenton 반응에 의해 생성된 OH-(hydroxyl radical)0]] 의해 황갈색의 dianisidyl 유리 자유기로 변화하게 된다.
- 추출물 내 총 페놀 함량은 gallic acid를 표준시약으로 사용하여, Singleton과 Orthofer33의 방법에 따라 760nm에서흡광도를 측정함으로써 결정하였다.
성능/효과
- 0.1 및 1㎎/㎖ 농도의 마황 추출물의 TAC는 0.41 및 Trolox equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에 따라 TAC도 비례적으로 증가하여 5mg/mS 농도에서는 3.76 mM Trolox equivalent를 나타내어 마황 추출물이 농도 의존적으로 ABTS 유리 자유기 소거활성을 나타내고 있음을알 수 있었다. 그러나 5㎎/㎖ 농도 이상에서는 더 이상의 TAC 증가는 관찰되지 않았다(Fig.
- 0.1 및 1㎎/㎖ 농도의 마황 추출물의 TARe 0.39 AC 0.66mM Trolox equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에 따라 TAR도 비례적으로 증가하여 5 및 lOmgM 농도에서는각각 1.65 및 2.43mM Trolox equivalent를 나타내었다. 따라서 마황 추출물은 농도 의존적으로 dianisidyl 유리 자유기소거활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 0.1 및 l㎎/㎖ 농도의 마황 추출물의 TARe 0.39 및 0.66mM Trolox equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에따라 TAR도 비례적으로 증가하여 5 및 lO㎎/㎖ 농도에서는각각 1.65 및 2.43mM Trolox equivalent를 나타내었다. 따라서 마황 추출물은 농도 의존적으로 dianisidyl 유리 자유기소거활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 1. TAC 측정결과 마황 추출물이 5㎎/㎖ 이하의 농도에서농도 의존적으로 ABTS 유리 자유기 소거활성을 나타냈다.
- 1㎎/㎖ 농도의 마황 추출물 첨가는 유도된 지질과산화의 TBARS 농도를 감소시키지 못하였으나 2㎎/㎖ 농도의 추출물을 첨가하였을 때 TBARS 농도는 0.36uM로, 무첨가에 비해 지질과산화를 97% 정도 현저히(p<0.05) 억제하였으며, 3, 5 및 lOmg/mfi의 첨가에서 TEARS 농도는 0.14, 0.13 및 0.09 uM로 감소되었으나 통계적으로 2㎎/㎖에 비해 유의한 감소는 아니었다. 따라서 마황 추출물의 지질과산화 억제효과는 1㎎/㎖과 2㎎/㎖ 사이의 좁은 영역에서 일어나고 았음을 알수 있었다(Fig.
- 2. TAR 측정에서 마황 추출물은 농도 의존적으로 dianisidyl 유리 자유기 소거활성을 나타냈다.
- 3.0.1㎎/㎖ 농도의 마황 추출물의 총 페놀 함량은 0.20mM gallic acid equivalent 이었으며, 추출물 농도가 증가함에 따라 총 페놀 함량도 비례적으로 증가하였다.
- 4. 50%의 DPPH 유리 자유기 소거활성에 필요한 마황추줄물의 농도는 O.46㎎/㎖이었으며, 1㎎/㎖ 농도에서의 유리 자유기 소거활성은 92.8%이었다.
- 5. 1㎎/㎖의 마황 추출물은 유도된 지질과산화의 TEARS 농도를 감소시키지 못하였으나 2㎎/㎖의 농도에서는무첨가에 비해 지질과산화를 97% 정도 현저히 억제하여 마황 추출물의 지질과산화 억제효과는 1㎎/㎖과 2㎎/㎖ 사이의 좁은 영역에서 일어나는 것으로 보인다.
- O.lmgM 농도의 마황 추출물의 총 페놀 함량은 0.20mM gallic acid equivalent0]1^, 추출물 농도가 증가함에 따라총 페놀 함량도 비례적으로 증가하여 0.5, 1, 2.5 및 5㎎/㎖ 농도에서는 각각 0.62, 0.99, 2.07 및 3.52 mM gallic acid equivalent를 나타내었다(Fig. 3).
- 174X (Y는 444nm에서의 흡광도이며, X는 Trolox 농도)이었다. Trolox의 농도가 증가함에 따라 유의적으로(r =0.987) 444nm에서의 흡광도가 감소하였다.
- 26uM로 증가시켰다. lmg/mg 농도의 마황 추출물 첨가는 유도된 지질과산화의 TBARS 농도를 감소시키지 못하였으나 2mgM 농도의 추출물을 첨가하였을 때 TEARS 농도는 0.36uM로 감소되어, 무첨가에 비해지질과산화를 97% 정도 현저히(p<0.05) 억제하였다. 또한 3 및 10, 50mg/mfi 의 농도 증가에 따라 TBARS 농도가 0.
- 43mM Trolox equivalent를 나타내었다. 따라서 마황 추출물은 농도 의존적으로 dianisidyl 유리 자유기소거활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 09 등으로 감소되었으나 2mg/M에 비해 통계적으로 유의한 변화는 아니었다. 따라서 마황 추출물의 지질과산화 억제효과는 1㎎/㎖과 2㎎/㎖ 사이의 좁은 window에서 일어나고 있음을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 09 uM로 감소되었으나 통계적으로 2㎎/㎖에 비해 유의한 감소는 아니었다. 따라서 마황 추출물의 지질과산화 억제효과는 1㎎/㎖과 2㎎/㎖ 사이의 좁은 영역에서 일어나고 았음을 알수 있었다(Fig. 5).
- 본 실험결과를 다시 살펴보면, 0.1 및 1㎎/㎖ 농도의 마황추출물의 TAC는 0.41 및 Trolox equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에 따라 TA* 비례적으로 증가하여 5 mg/mfi 농도에서는 3.76mM Trolox equivalent를 나타내어마황 추출물이 농도 의존적으로 HQ?에 의해 산화된 ABTS 유리 자유기 소거활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 그러나 5㎎/㎖ 농도 이상에서는 더 이상의 TAC 증가는 관찰되지않았다(Fig.
- 41 및 Trolox equivalent이며, 추출물 농도가 증가함에 따라 TA* 비례적으로 증가하여 5 mg/mfi 농도에서는 3.76mM Trolox equivalent를 나타내어마황 추출물이 농도 의존적으로 HQ?에 의해 산화된 ABTS 유리 자유기 소거활성을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 그러나 5㎎/㎖ 농도 이상에서는 더 이상의 TAC 증가는 관찰되지않았다(Fig.
- 이 같은 결과들을 종합해 볼 때 마황 추출물은 유리 자유기 소거작용과 지질과산화 억제 활성이 뚜렷했으며, 천연항산화제인 페놀함량도 농도 의존적으로 유의한 것으로 나타났다. 따라서 현재 한방의 임상에서 비만치료, 염증치료 등에다용되고 있는 마황의 활용범위를 항산화영역으로 확장시켜볼 가치가 있다고 판단된다.
- 이 같은 결과들을 종합해 볼 때 마황 추출물은 유리 자유기 소거작용과 지질과산화 억제 활성이 뚜렷했으며, 천연항산화제인 페놀함량도 유의성 있게 나타났다. 따라서 각종 산화 및 노화와 관련된 질환의 예방과 치료의 효능이 있을 것으로 판단된다.
- 총 페놀 함량은 O.lmg/mC 농도의 마황 추출물에서 0.20mM gallic acid equivalent이었으며, 추출물 농도가 증가함에 따라 총 페놀 함량도 비례적으로 증가하여 0.5, L 2.5 및 5㎎/㎖ 농도에서는 각각 0.62, 0.99, 2.07 및 3.52 mM gallic acid equivalent를 나타내었다(Fig. 3).
- 85g을 80% 에탄올(HPLC-grade) 700 ㎖로 2번 추출한 뒤 증류시켰다. 최종적으로 동결건조기에서 9.49g의 에탄올추출물을 얻었으며, 회수율은 27.2%로 높게 나타났다.
- 추출물 농도 O.lmg/mT의 유리 자유기 소거활성은 21.0%이고, 1㎎/㎖ 농도에서 유리 자유기 소거활성은 92.8%로 나타났으며, 5 및 lQngM 등 농도에서는 각각 94.8, 98.9%이었으나 1㎎/㎖에 비해 통계적으로 유의한 유리 자유기 소거활성의 변화는 아니었다.
- 추출물 농도 O.l㎎/㎖의 DPPH 유리 자유기 소거활성은 21.0%이고, l㎎/㎖ 농도에서 유리 자유기 소거활성은 92.8% 로 나타났으며, 더 이상의 농도 증가에 따른 유의한 유리 자유기 소거활성의 변화는 관찰되지 않았다. 추출물 농도와 유리 자유기 소거활성 간의 회귀분석 결과 50%의 유리 자유기소거활성에 필요한 마황 추출물의 농도는 0.
- 추출물 농도와 유리 자유기 소거활성 간의 회귀분석 결과 50%의 유리 자유기 소거활성에 필요한 마황 추출물의 농도는 0.46mg/me으로 나타나 마황 추출물의 유리 자유기 소거활성이 뚜렷함을 알 수 있었다(Fig. 4).
- 8% 로 나타났으며, 더 이상의 농도 증가에 따른 유의한 유리 자유기 소거활성의 변화는 관찰되지 않았다. 추출물 농도와 유리 자유기 소거활성 간의 회귀분석 결과 50%의 유리 자유기소거활성에 필요한 마황 추출물의 농도는 0.46mg/mC으로 나타나 마황 추출물의 유리 자유기 소거활성이 탁월함을 알 수있었다(Fig. 4).
후속연구
- 그러나 TAC, DPPH 유리 자유기 소거활성능, 지질과산화억제효과는 농도에 비례하는 것이 아니라 특정 농도에서 최대 효능을 나타내므로 임상활용에서도 마황의 항산화 작용은 약물투여량에 비례하는 것이 아니라 특정 농도에서 최대효능을 발휘할 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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