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문제 정의
- 본 연구에서는 식중독 원인 세균에 대하여 입증된 인진쑥 추출물의 시험관 내 항균효과를 근거로 실험동물에 적용하여 식중독 원인 세균에 대한 인진쑥 추출물의 항균효과가 있는지를 조사하고자, 마우스에 S. enteritidis, E. coli O157:H7, L. monocytogenes 및 S. aureus 균주를 감염시키고 인진쑥 추출물을 투여하여 각 병원성 세균들의 증식 상태 및 억제효과를 조사하였다.
제안 방법
- L. monocytogenes의 균수를 즉정하기 위하여 단계희석된 분변을 Oxfbrd agar, PALCAM 배지에 도말배양하여 Listeria 특유의 진한 갈색 또는 검은색 환으로 둘러싸인 집락수를 측정하였다.
- S. 의 균수를 측정하기 위하여 단계희석된 분변을 Baird-Parker Medium(BPM)에 도말배양하여 Staphylococcus 특유의 직경 1-1.5 mm 크기의 black, shiny, convex한 집락 주위에 약 2〜5 mm의 opaque region0] 관찰되는 집락수를 측정하였다.
- 각 군의 마우스에 2.5 X 109CFU/mL 수준의 S. enteritidis, E. coli 0157 : H7, L. monocytogenes 또는 S. aureus 0.2 mL 을 존대를 사용하여 경구적으로 위내에 접종하였다.
- 또한 10배 단계희석 된 분변을 fluorocult E. coli 0157 : H7 agar와 SMAC에 도말배양하여 SMAC에서 무색의 음성인 집락, fluorocult E. coli 0157 : H7 agar에서 연녹색의 집락을 취하여 MUG test를 실시하여 MUG 음성임을 확인하고 E. coli O157:H7의 균수를 측정하였다.
- 병원성 세균의 증식성을 조사하기 위하여 각 실험군에 대한 인공감염 직후 및 감염 후 경시적으로 마우스의 분변 1 g 을 무균적으로 채취하여 9mL의 생리식염수에 균질화한 다음 10배 단계희석을 l0-9배까지 실시한 1mL을 XLD 배지와 Rambach agar에 도말배양하여 Salmonella 특유의 black center균과 분홍색 집락을 MUCAP test와 TS1, LIA, IMViC 등의 생화학적 성상검사를 통하여 접종균임을 확인하고 집락수를 측정하여 S. enteritidis의 균수를 측정하였다.
- 생후 5〜8주령의 ICR 마우스평균 체중; 25±5g) 120두를 부산광역시 보건환경 연구원 축산물위생검사소에서 사육하면 서 공시하였다. 실험 전에 실험동물들이 각각의 세균에 감염되지 않은 것을 확인하기 위하여 Salmonella 선택배지인 xylose lysin desoxycholate(XLD, Merck, Germany)배지, Rambach agar(Merck, Germany), E. coli 0157:117 선택배지인 fluorocult E. coli O157:H7 agar(Merck, Germany), sorbitol MacConkey agar(SMAC, Merck, Germany), Listeria 선택배지인 Oxford agar(Merck, Germany), PALCAM(Polymyxin Acriflavine LiCI Ceftazidime Esculin Mannitol, Merck, Germany), Staphylococcus 선택 배지 인 Baird-Parker Medium(BPM, Merck, Germany) 에 각 실험동물들의 분변을 배양하여 각각의 세균들이 분리되지 않아 미감염 동물임을 확인하고 실험에 사용하였다. 이 후 실험 기간 동안 멸균된 배합사료와 음수를 자 유급식 시켰다.
- 실험군 마우스에는 인진쑥 추출물 0.2 mL (100mg/mL)을 존대를 사용하여 위내에 투여하였고, 대조군 마우스에는 생리식염수 0.2 mL을 동일한 방법으로 투여하였다.
- 이 연구에서는 인진쑥의 식중독 유발 병원성 세균에 대한 생체내 항균효과를 조사하고자 마우스에 S. enteritidis, E. coli 0157 : H7, L. monocytogenes 및 S. aureus 균주를 경구적으로 접종하여 감염시킨 뒤 인진쑥 추출물을 일정기간 투여하면서 각 병원성 세균들의 증식 상태 및 억제 효과를 확인하였다.
- 이러한 인진쑥 분말 100g에 ethyl acetate 1000 mL을 가하여 항온수조 (37℃)에서 140rpm으로 24시간 진탕한 후 저온 원심분리기 (41)에서 3,000 rpm으로 20분간 원침하였다. 이 후 상층액을 여과한 추출물을 회전 진공 농축기 (Heidolph®, Laborota 4000, Germany)에서 농축하여 완전 건조시킨 후 동결건조시켜 인진쑥 ethyl acetate 추출물을 얻었다. 추출물을 -20℃ 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 인진쑥 ethyl acetate 추출물의 식중독 원인 세균에 대한 생체 내 항균효과를 조사하고자 마우스에 S. enteritidis, E. coli 0157 : H7, L. monocytogenes 및 S. aureus 균주를 경구적으로 감염시킨 뒤 인진쑥 추출물을 일정기간 투여하면서 각 병원성 세균들의 증식 상태 및 억제 효과를 조사하였던 결론은 다음과 같다. 100mg/mL 용량의 인진쑥 추출물을 세균감염 7일전부터 매일 투여한 군과 감염 후 매일 투여한 군에서 인진쑥 추출물을 비 투여한 군에서보다 감염 1〜3일까지 두드러진 균의 증식억제 경향을 나타내었으며, 추출물투여 군에서는 감염 21일 후에 균이 검출되지 않은 것에 비하여 대조군에서는 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- 인진쑥 추출물의 경구투여에 의한 병원성 미생물의 증식억제 효과를 조사하기 위하여 각 병원성 세균별로 다음과 같이 3개의 실험군을 설정하였고 각 실험군마다 10두의 마우스를 설정하였다.
대상 데이터
- 공시 균주는 국립수의 과학검역원으로부터 분양받은 S.enteritidis (ATCC 13076), E. coli O157:H7 (ATCC 43890), L. monocytogenes (ATCC 19117), S. aureus (ATCC 25923) 균주를 tryptic soy broth (TSB, Merck, Germany)에 접종하여 37에서 250rpm으로 18〜24시간동안 진탕 배양한 것을 TSB에 5시간씩 2회 계대 진탕 배양하여 활성화시킨 것을 공시하였다.
- 대구 약령시장의 한약 건재상에서 2004년 5월부터 2006년 5월 사이에 건조된 인진쑥(Artemisia capillaris)을 구입하여 이물질을 제거하고 깨끗이 한 다음 제분기로 분쇄하여 인진 쑥 분말을 얻었다. 이러한 인진쑥 분말 100g에 ethyl acetate 1000 mL을 가하여 항온수조 (37℃)에서 140rpm으로 24시간 진탕한 후 저온 원심분리기 (41)에서 3,000 rpm으로 20분간 원침하였다.
- 생후 5〜8주령의 ICR 마우스평균 체중; 25±5g) 120두를 부산광역시 보건환경 연구원 축산물위생검사소에서 사육하면 서 공시하였다. 실험 전에 실험동물들이 각각의 세균에 감염되지 않은 것을 확인하기 위하여 Salmonella 선택배지인 xylose lysin desoxycholate(XLD, Merck, Germany)배지, Rambach agar(Merck, Germany), E.
이론/모형
- 이 배양액을 원심침전하여 침전균체를 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4) 용액으로 2회 세척한 다음, 최종적으로 10% sodium bicarbonate 용액을 넣어 MacFarland No. 1의 혼탁도에 맞추어 2.5 X 109CFU/mL 수준으로 희석하여 인공감염균으로 사용하였고 세균의 균수 측정은 agar plate method를 이용하였다.
성능/효과
- aureus 균주를 경구적으로 감염시킨 뒤 인진쑥 추출물을 일정기간 투여하면서 각 병원성 세균들의 증식 상태 및 억제 효과를 조사하였던 결론은 다음과 같다. 100mg/mL 용량의 인진쑥 추출물을 세균감염 7일전부터 매일 투여한 군과 감염 후 매일 투여한 군에서 인진쑥 추출물을 비 투여한 군에서보다 감염 1〜3일까지 두드러진 균의 증식억제 경향을 나타내었으며, 추출물투여 군에서는 감염 21일 후에 균이 검출되지 않은 것에 비하여 대조군에서는 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- L. 의 증식에 대하여 인진쑥 추출물을 투여한 A, B군에서는 비 투여한 대조군보다 감염 3일까지 두드러진 균 증식 억제 경향을 확인할 수 있었고 균수의 감소는 A군과 B군에서 감염 1일 후부터 더 일찍 나타났는데 비하여 대조군에서는 감염 5일 후로 상당히 지연되는 경향을 나타내었다. 특히, A군과 B군에서 감염 21일 후에 균이 검출되지 않았던 반면 대조군에서는 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- S. aureus^ 증식에 대하여 인진쑥 추출물을 비 투여한 대조군보다 투여한 A, B군에서는 감염 1일부터 두드러진 균 증식 억제 경향을 확인할 수 있었고 균수가 감소하는 시간은 A군과 B군에서 감염 1일, 2일 후부터 나타났는데 비하여 대조군에서는 감염 3일 후로 지연되는 경향을 나타내었다. 특히, A군과 B군에서 감염 21일 후에 균이 검출되지 않은 결과를 나타낸 반면 대조군에서는 감염 21일에도 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- S. enteritidis^ 증식에 대하여, 인진쑥 추출물을 비 투여한대 조 군보다 투여한 A군에서는 감염 3일, B군에서는 감염 2 일까지 두드러진 균 증식 억제 경향을 확인할 수 있었다. 균수가 뚜렷이 감소하는 시간은 A군에서는 감염 5일 후부터이었던 것에 비하여 B군에서는 감염 3일 후부터이었다.
- enteritidis를 인공감염시킨 마우스에서 인진쑥 추출물에 의한 균의 증식억제 효과를 조사하였던 결과는 Fig 1과 같다. 감염 직후에 분변에서 검출되었던 S. enteritidis 균수는 감염 7일전부터 매일 인진쑥 추출물을 투여한 A군에서 7.5 X 10 CFU/g, 감염 후 매일 인진쑥 추출물을 투여한 B군 에서는 8.2 X 10 CFU/g, 대조군으로 감염 후 인진쑥 추출물을 비투여 한 C군에서는 7.4 X IbcFU/g으로 세군에서 거의 비슷한 경향을 나타내었다. 세균 감염 후 1일에 세 군 모두 감염 직후와 비슷한 균수를 나타내었고 A군에서는 감염 5일 후에 균수가 7.
- 대조군인 C군에서는 감염 2일까지는 균수가 비슷한 수준을 유지하였고 감염 3일에 균수가 2.5 X l()6CFU/g으로 감소하기 시작하여 감염 14일에 균수가 1.4x lO'CFU/g으로 완만한 감소 경향을 나타내었고 감염 21일에도 균수가 2.8 X 10 CFU/g으로 현저한 감소 경향을 나타내었지만 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- 대조군인 C군에서는 감염 2일에 균수가 6.5 X 106CFUM 지 일시적으로 증가하는 경향을 나타내다 감염 5일까지는 균수가 비슷한 수준을 유지하였고 감염 7일에 균수가 5.3 X lO'CFU/g으로 감소하기 시작하여 감염 14일까지는 완만한 감소를 나타내었고 감염 21일에도 균수가 1.8x10 CFU/g으로 현저히 감소 경향을 나타내었지만 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- 대조군인 C군에서는 감염 2일에 균수가 8.1 X l^CFU/g까 지 일시적으로 증가하는 경향을 나타내다 감염 5일까지는 균수가 비슷한 수준을 유지하였고 감염 7일에 균수가 3.4 X 104CFU/g으로 감소하기 시작하여 감염 14일까지는 완만한 감소를 나타내었고 감염 21일에도 균수가 3.2 X 10 CFU/g으로 현저히 감소 경향을 나타내었지만 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- 대조군인 C군에서는 감염 3일에 균수가 9.3 X 106CFU/g까 지 일시적으로 증가하는 경향을 나타내면서 균수가 비슷한 수준을 유지하였고 감염 5일에 균수가 2.3 X ITCFU/g으로 감소하기 시작하여 감염 21일에도 균수가 3.9x l()2CFU/g으로 완만한 감소 경향을 나타내었지만 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다.
- 마우스에서 인진쑥 추출물의 투여가 E. coli O157:H7의 증식에 미치는 효과를 조사하였을 때, 인진쑥 추출물을 비 투여한 대조군보다 투여한 A, B군에서는 감염 1, 3일까지 두드러진 균 증식 억제 경향을 확인할 수 있었고 균수가 감소하는 시간은 A군에서의 감염 5일 후부터보다 B군에서 감염 3일 후부터 나타났다. 특히, A군과 B군에서 감염 21일 후에 균이 검출되지 않은 결과를 나타낸 반면 대조군에서는 감염 21일에도 여전히 상당한 균 수준을 유지하는 것으로 볼 때 인진쑥 추출물의 E.
- 7 X IO,CFU/g으로 세군에서 거의 비슷한 경향을 나타내었다. 세균 감염 후 1일에 세 군 모두 감염 직후와 비슷한 균수를 나타내었고 A군에서는 감염 2일 에 균수가 3.4 X 106CFU/g으로 일시적인 증가 경향을 나타내다 감염 5일 후에 균수가 2.1 X 10CFU/g으로 감소하기 시작하여 감염 10일까지는 완만한 감소를 나타내었으며 감염 14일에 균수가 3.2 X 10 CFU/g으로 현저히 감소 경향을 나타내다 감염 21일 후에는 균이 거의 검출되지 않았다.
- 4 X IbcFU/g으로 세군에서 거의 비슷한 경향을 나타내었다. 세균 감염 후 1일에 세 군 모두 감염 직후와 비슷한 균수를 나타내었고 A군에서는 감염 5일 후에 균수가 7.3 X 104 CFU/g으로 감소하기 시작하여 감염 10일까지는 완만한 감소를 나타내다 감염 14일에 균수가 2.4 x 10 CFU/g으로 현저히 감소 경향을 나타내었으며 감염 21일 후에는 균이 거의 검출되지 않았다.
- 것으로 사료된다. 아울러, 세균 감염 초반(1〜3일) 사이에 인진쑥 추출물이 뚜렷한 균 증식 억제 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- coli O157:H7의 증식에 미치는 효과를 조사하였을 때, 인진쑥 추출물을 비 투여한 대조군보다 투여한 A, B군에서는 감염 1, 3일까지 두드러진 균 증식 억제 경향을 확인할 수 있었고 균수가 감소하는 시간은 A군에서의 감염 5일 후부터보다 B군에서 감염 3일 후부터 나타났다. 특히, A군과 B군에서 감염 21일 후에 균이 검출되지 않은 결과를 나타낸 반면 대조군에서는 감염 21일에도 여전히 상당한 균 수준을 유지하는 것으로 볼 때 인진쑥 추출물의 E. coli O157:H7 에 대한 증식 억제 효과가 있는 것으로 사료된다.
- aureus^ 증식에 대하여 인진쑥 추출물을 비 투여한 대조군보다 투여한 A, B군에서는 감염 1일부터 두드러진 균 증식 억제 경향을 확인할 수 있었고 균수가 감소하는 시간은 A군과 B군에서 감염 1일, 2일 후부터 나타났는데 비하여 대조군에서는 감염 3일 후로 지연되는 경향을 나타내었다. 특히, A군과 B군에서 감염 21일 후에 균이 검출되지 않은 결과를 나타낸 반면 대조군에서는 감염 21일에도 여전히 상당한 균 수준을 유지하였다. 따라서 인진쑥 추출물에 의한 S.
- 한편 인진쑥 추출물을 100mg/mL 용량으로 세균 감염 7 일전부터 매일 투여한 A군과 감염 후 매일 투여한 B군에서균 증식억제 효과는 크게 차이를 나타내지 않은 점으로 보아 인진쑥 추출물 내의 항균 성분은 병원성 세균이 생체 내에 침입 한 시기부터 직접적으로 균에 대한 항균 작용을 하는 것으로 사료된다. 아울러, 세균 감염 초반(1〜3일) 사이에 인진쑥 추출물이 뚜렷한 균 증식 억제 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
후속연구
- 결론적으로 수의임상에서 대두되고 있는 각종 항생제 내성을 줄일 수 있는 대체 생약으로서 인진쑥 추출물을 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
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