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문제 정의
- 본 실험은 국내에서 육성되는 벼 가공품의 인체 효능 구명을 위한 예비 연구로, 동물에 추출물을 단회 투여 시 발현될 수 있는 급성독성을 평가하고자, 식품의약품안전청의 의약품 등의 독성시험 기준(1999)에 준하여 시험을 수행하였다. 본 연구에 사용된 시험물질은 국내육성 벼 품종 중 오봉 벼, 일품벼 및 아랑향찰벼 과피를 80% ethyl alcohol로 추출한 후, 추출물을 암.
제안 방법
- 국내육성 벼 주요품종 중 오봉벼, 일품벼 및 아랑향찰벼과피의 단회 경구투여에 의한 독성을 관찰하기 위하여, 동물 체중 당 2.5 g, 5.0 g 및 10.0 g의 용량으로 암수 각각 10 마리씩 ICR계 마우스에 1회 경구투여한 후 14일간 실험동물의 사망률, 일반증상, 체중변화, 부검소견 및 혈액 생화학적 분석을 수행하였다.
- 절식人:! 동물을 에테르 마취하에 단두로 희생시킨 후 채혈하였다. 새 취한 혈액을 원심분리 후 혈장을 분리하였고, 혈장 중 포드 당 함량은 glucose kit(영동제약)를 이용하여 분석하였으디, 콜레스테롤 함량은 cholesterol kit를 이용하여 측정하였으디, aminotransferase 활성도(ALT 및 AST)는 Reitman-Franke: 법 (1957)에 의해 제조된 kit(영동제약)를 이용하여 측정하였다.
- 모든 시험동물에 대한 임상증상 관찰 및 사망동물 수는 투여 당일에는 투여직후부터 6시간 동안은 매시간 관찰하였으며 투여 다음 날부터 14일까지는 1일 1회로 동물의 일반상태의 변화, 중독증상 및 사망 유무를 관찰하였다(Zbinden & Flury-Roversi, 1981).
- 모든 실험동물에 대하여 시료 투여 개시 직전에 1회, 투여 개시 후에는 매일 1회씩 동일한 시간대에 체중을 측정하였고, 부검 당일 측정하였다.
- 본 연구에 사용된 시험물질은 국내육성 벼 품종 중 오봉 벼, 일품벼 및 아랑향찰벼 과피를 80% ethyl alcohol로 추출한 후, 추출물을 암.수 마우스에 1회 경구투여 하였을 때 나타나는 임상증상 및 체중변화 등을 관찰하였으며, 실험동물의 사망률 산출과 부검을 시행하여 육안적 해부소견 등에 의한 급성 경구독성 시험을 수행하였다.
- 순화기간 중 건강하다고 판정된 마우스에 대하여 체중을 측정하고 평균 체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위 법을 이용, 실험동물 군을 분리하였다. 동물의 개체 식별은 사육 상자별 tag 표시법을 이용하였다.
- 시험군은 동물 체중 kg당 2.5 g(l군), 5.0 g(2군) 및 10.0 g(3 군)의 투여군 및 대조군 등 총 4개 군으로서 각 군당 암수 20마리씩 구성하였다.
- 시험물질은 1% Tween 80에 균일하게 현탁되도록 시험 당일 용시 조제하였고, 시험물질 현탁액은 경구용 존데를 이용하여 1회 경구투여 하였다. 투여량은 투여직전 체중의 변화에 따라 산출하였다(Lorke, 1983; Bruce, 1985).
- 투여 후 14일째에 모든 생존동물을 에테르로 마취시:2 후 단두로 희생시켜 동물의 흉부를 절개한 후, 주요 장기 이 간장, 심장, 신장, 폐, 비장 및 뇌를 적출해 무게를 측정 하였으며, 모든 장기의 형태를 육안 관찰하였다.
대상 데이터
- 본 실험에는 (주)샘타코 바이오코리아(경기도 오산)로 부터 공급받은 SPF(specific pathogen free) 암수 5주령 ICR계마우스를 사용하였으며, 1주일간의 검역 및 순화를 거친 뒤 건강하다고 판정된 마우스를 선별하여 실험에 공시하였다.
- 본 연구에 사용된 시험물질은 국내육성 벼 품종 중 오봉 벼, 일품벼 및 아랑향찰벼 과피를 80% ethyl alcohol로 추출한 후, 추출물을 암.수 마우스에 1회 경구투여 하였을 때 나타나는 임상증상 및 체중변화 등을 관찰하였으며, 실험동물의 사망률 산출과 부검을 시행하여 육안적 해부소견 등에 의한 급성 경구독성 시험을 수행하였다.
- 실험동물은 동물실온도 22±1℃로 설정된 사육환경에서 플라스틱 사육상자(220 Wx410 Lx200 H mm)에서 사육 상자 당 암수 각각 10마리로 수용하였으며, 실험동물용 고형사료((주)샘 타코 바이오코리아, 경기도 오산)와 증류수를 자유로이 섭취하도록 하였다.
- 실험에 사용된 오봉벼, 일품벼 및 아랑향찰벼는 농촌진흥청 작물과학원으로부터 쌀의 과피 부분을 공급받아 80% ethyl alcohol(EtOH)로 추출한 후 농축, 건조하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험 대조군과 시험물질 투여군 간의 체중변화 및 혈액 생화학 분석결과는 평균±표준편차(Mean±S.D.)로 나타내었으며, one-way analysis of variance(ANOVA)를 실시하여 p<0.05의 범위에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- 실험동물 군을 분리하였다. 동물의 개체 식별은 사육 상자별 tag 표시법을 이용하였다.
- 새 취한 혈액을 원심분리 후 혈장을 분리하였고, 혈장 중 포드 당 함량은 glucose kit(영동제약)를 이용하여 분석하였으디, 콜레스테롤 함량은 cholesterol kit를 이용하여 측정하였으디, aminotransferase 활성도(ALT 및 AST)는 Reitman-Franke: 법 (1957)에 의해 제조된 kit(영동제약)를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 1. 모든 시험물질의 최대 투여가능용량인 10.0 g/kg 투여 시 암수 모든 동물군의 사망 예는 관찰되지 않았고, 또한 그 이하의 시료 투여군에서도 사망동물은 없었으며, 시험물질투여 후 나타내는 외관상의 이상증상도 확인되지 않았다.
- 2. 실험동물의 체중 변화는 암수 모두에서 시일이 경과함에 따라 체중 증가가 일시적으로 억제되는 경향을 나타냈으나 시험물질 투여군과 대조군간의 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다.
- 3. 시료투여 14일 후 치사된 동물의 장기를 관찰한 결과, 암수 모든 실험군의 간장, 신장, 비장, 심장, 폐 및 뇌에서 시험물질 투여에 따른 어떤 육안적 이상 소견도 발견되지 않았다.
- 4. 혈액생화학적 검사 결과, ALT와 AST 활성도가 모든 시료 투여군에서 정상수치를 나타냈으며, 10.0 g/kg 1회 경구 투여한 모든 실험군의 경우에도 정상 수치를 나타내는 것으로 보아, 고품질 우리 쌀인 오봉벼, 일품벼 및 아랑향찰 벼 과피 추출물을 고용량으로 투여 시에도 간 기능에 어떠한 독성도 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
- 5. 오봉벼 일품벼 및 아랑향찰벼 과피 추출물에 대한 급성 경구 독성시험에서 상기의 일반상태, 체중변화 및 부검소견 등에 별다른 독성이 관찰되지 않았으며, 최대투여 가능 용량인 10.0 g/kg에서도 사망 예가 발견되지 않았다. 따라서 암수 마우스에 대한 경구 LD50치는 최대 투여가능 용량인 10.
- 국내 육성 벼 품종 중 오봉벼, 일품벼 및 아랑향찰벼 과피 80% EtOH 추출물을 마우스 체중 당 0 g, 2.5 g, 5.0 g 디 10.0 g 투여한 결과, 실험기간 동안 모든 군에서 사망 동물은 관찰되지 않았다(Table 2). 따라서 본 시험물질의 최소치사량(MLD)은 암수 모두에서 10.
- 이후의 전체 실험기간 동안 모든 군에서 관찰되지 않았다(Table 2). 따라서 무 관찰 부작용량(no observed adverse effect level, NOAEL) 역시 암수 모두 10.0 g/kg 이상으로 확인되었다.
- 따라서 본 시험 결과, 오봉벼, 일품벼 및 아랑향찰벼 과피 EtOH 추출물은 투여가능 최대용량에서도 독성이 없는 안전한 식품임을 확인하였고, 건강증진에 도움을 주는 기능성 식품소재로서의 개발 가능성을 예측할 수 있었으며, 고용량으로도 임상사용이 가능함을 확인할 수 있었다.
- 암컷과는 달리 수컷 군의 우리 쌀 추출물 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았으며, 실험동물의 체중이나 부검소견에서도 시험물질 투여와 기인된 어떠한 이상소견도 인정되지 않았다. 따라서 본 시험결과는 ICR 마우스에 오봉벼, 일품벼 및 아랑향찰벼 과피 추출물을 10.0 g/kg 용량까지 1회 경구투여 시, 어떠한 독성소견도 유발하지 않으며, 최소 치사량은 10.0 g/kg을 훨씬 상회한다는 것을 의미한다고 해석할 수 있다. 급성독성 분류에 의하면 반수치사량이 체중 kg당 5,000 mg 이상이면 실질적인 무독성 물질로 구분하고 있으며 (Hodge & Sterner, 1949), 미국 환경보호청(US Environment Protection Agency, 1998)에서도 경구 투어 반수치사량이 체중 kg당 5,000 mg 이상이면 무해한 물질로 분류하고 있다.
- 0 g 투여한 결과, 실험기간 동안 모든 군에서 사망 동물은 관찰되지 않았다(Table 2). 따라서 본 시험물질의 최소치사량(MLD)은 암수 모두에서 10.0 g/kg을 상회하는 것으로 관찰 되 었다.
- 0 g/kg에서도 사망 예가 발견되지 않았다. 따라서 암수 마우스에 대한 경구 LD50치는 최대 투여가능 용량인 10.0 g/kg이상으로 평가되었다.
- 시험기간 중 각 시료투여군의 암수 동물의 체중을 측정한 결과, 오봉벼 투여군 암컷의 경우, 투여 4일째에 5.0 g 투여군에서 대조군에 비해 체중이 유의적으로 감소하였고(Fig. 1), 일품벼 역시 암컷에서 투여 6일째에 5.0 g 투여 군에서 유의적으로 감소하였으며(Fig. 2), 아랑향찰 암컷의 경우, 시료 투여 3일째에 5.0 g 투여군에서 유의적으로 감소하였으나 그 이후 회복되었고, 체중감소가 유의적인 수치를 나타내지는 않았으며, 투여 3일 후 암컷에서 발견된 일시적인 체중감소는 우발적인 변화로 생각된다(Fig. 3). 암컷과는 달리 수컷 군의 우리 쌀 추출물 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았으며, 실험동물의 체중이나 부검소견에서도 시험물질 투여와 기인된 어떠한 이상소견도 인정되지 않았다.
- 시험물질 투여 후 실험 마지막인 14일째 되는 날 마우스의 외관 및 내부 장기의 이상 여부를 육안으로 관찰한 결과 출혈, 반점, 부종 및 비정상적인 조직생성 등의 이상 현상이 관찰되지 않았다.
- 실험 14일째 치사시킨 동물 장기의 중량을 측정한 결과, 오봉벼 수컷의 5.0 g과 10.0 g 투여군에서 간의 무게가 유의적으로 증가하였고, 신장 무게 역시 유의적으로 감소하였고, 2.5 g 투여군의 폐의 무게가 유의적으로 감소하였 J (Table 3). 일품벼 투여군 수컷의 우측 신장 무게가 2.
- 실험 마지막 날, 16시간 절식시킨 동물을 에테르 마취하에 단두로 희생시킨 후 채취한 혈액을 원심분리 후 혈장을 분리하여 분석한 결과, 오봉벼 투여군의 수컷 중 2.5 g 투여군에서 혈장 포도당 농도가 증가하였고, 모든 투여군에시 AST 활성도가 유의적으로 증가하였으며, 암컷 5.0 g 투이군의 포도당 농도가 유의적으로 증가하였으나 AST 활성드 는 유의적으로 증가하였다(Table 6). 일품벼 수컷 중 2.
- 0 g 투여군에서 유의적으로 증가하였다(Table 4). 아량 향찰벼의 2.5 g과 5.0 g 투여군에서 암컷의 간 무게가 유의적으로 증가하였고(Table 5), 그밖에 다른 유의성 있는 이산 증후는 관찰되지 않았다.
- 3). 암컷과는 달리 수컷 군의 우리 쌀 추출물 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중변화는 관찰되지 않았으며, 실험동물의 체중이나 부검소견에서도 시험물질 투여와 기인된 어떠한 이상소견도 인정되지 않았다. 따라서 본 시험결과는 ICR 마우스에 오봉벼, 일품벼 및 아랑향찰벼 과피 추출물을 10.
- , 1979)와 일치한다. 이상의 결과를 통해, 여러 측정항목에서 통계적으로 유의적인 차이를 보여주고 있으나 생리적 정상범위를 벗어나지 않았으며, 시료투여에 따른 용량 의존적 변화도 나타나지 않는 것으로 보아, 시료 다량투여에 대한 독성학적 의의가 없는 것으로 추정할 수 있다.
- 5 g 투여군의 폐의 무게가 유의적으로 감소하였 J (Table 3). 일품벼 투여군 수컷의 우측 신장 무게가 2.5 ; 투여군의 경우 유의적으로 감소하였으나 심장의 무게는 10.0 g 투여군에서 증가하였고, 암컷은 좌측 신장 무게가 10.0 g 투여군에서 유의적으로 증가하였다(Table 4). 아량 향찰벼의 2.
- 5 g과 5.C ? 투여군의 AST 활성도가 증가하였으나 10.0 g 투여군q ALT 활성도는 감소하였고(Table 7), 아랑향찰벼 수컷 1CJ g 투여군의 포도당 농도가 유의적으로 증가하였다(Tab s 8). 시료투여에 따른 ALT 활성도의 변화는 모든 시료의 투여농도가 증가함에 따라 약간 증가하는 경향을 보였으나 4의성은 나타내지 않았고, 이러한 사실은 독성의 초기 단계에서 병리학적인 조직손상이 일어나기 이전에 막 투과성의 변화가 일어날 경우 AST 활성도는 변화하지 않고 ALT의 활성도가 증가된다는 보고(Dikshith et al.
후속연구
- 지속적인 육종개발을 통해 건강효능이 우수한 고품질 우리 쌀 생산이 증대되고 있는 가운데(Hyun & Chung, 2006), 거대배아미인 오봉벼(Han et al., 2004)와 우수한 밥맛으로 알려진 일품벼 및 고유의 찰기로 평가받는 아랑향찰벼의 인체 우수성을 규명하므로, 국민건강 증진, 농가소득 향상은 물론, 국가경쟁력이 높은 고부가가치의 작물로 개발할 수 있으리라 기대된다.
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