[국내논문]비소세포폐암주에서 산소 농도에 따른 미세 배양 환경과 세포 증식능 Microenvironments and Cellular Proliferation Affected by Oxygen Concentration in Non-Small Cell Lung Cancer Cell Line원문보기
배경 및 목적: 암세포는 빠른 증식 속도로 인하여 상대적인 저산소증에 노출되면서 비정상적인 종양 혈관을 형성하여 치명적인 병인을 형성한다. 저산소증에서의 암세포 내의 유전자 표현을 연구하는 것은 병인의 규명과 나아가 치료에 결정적인 단초를 제공할 수 있다. 이에 본 연구에서는 체외 배양한 비소세포폐암의 증식과 저산소증 상태에 대한 연구를 시행하였다. 재료 및 방법: 비소세포폐암주인 A549를 RPMI 배지에서 계대 배양하였다. 저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다. 대조군으로 5% $CO_2$와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다. 세포의 증식 상태는 MTT 방법을 실시하였다. 결과: 1. MIC-101을 이용하였을 때, 무산소혼합가스를 투여 후 30분에 50%의 산소 분압저하를 확인하였으며, 대기 가스에 의해 산소농도를 회복하는 것을 볼 수 있었다. 2. 무산소 혼합가스로 정화(purging)를 하면 산소의 분압을 더 낮출 수 있었다. 3. 저산소 상태에서 세포 배양액 내에는 pH 감소, 젖산 증가, 포도당의 감소와 같은 미세환경이 변하였다. 4. 세포배양액에 따라 저산소에 의해 유도되는 포도당 저하에 차이가 있었다. 5. 비소세포폐암주는 저산소에 의해 증식능이 억제되었다. 결론: 저산소 상태는 세포 배양액 내 포도당 농도의 감소, 젖산의 증가, pH의 감소 등 세포 배양 미세 환경을 변화시키며, 비소세포폐암세포는 증식이 억제된다. 저산소는 미세 환경 변화와 함께 직접적으로 그리고 간접적으로 비소세포의 증식능에 영향을 미친다.
배경 및 목적: 암세포는 빠른 증식 속도로 인하여 상대적인 저산소증에 노출되면서 비정상적인 종양 혈관을 형성하여 치명적인 병인을 형성한다. 저산소증에서의 암세포 내의 유전자 표현을 연구하는 것은 병인의 규명과 나아가 치료에 결정적인 단초를 제공할 수 있다. 이에 본 연구에서는 체외 배양한 비소세포폐암의 증식과 저산소증 상태에 대한 연구를 시행하였다. 재료 및 방법: 비소세포폐암주인 A549를 RPMI 배지에서 계대 배양하였다. 저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다. 대조군으로 5% $CO_2$와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다. 세포의 증식 상태는 MTT 방법을 실시하였다. 결과: 1. MIC-101을 이용하였을 때, 무산소혼합가스를 투여 후 30분에 50%의 산소 분압저하를 확인하였으며, 대기 가스에 의해 산소농도를 회복하는 것을 볼 수 있었다. 2. 무산소 혼합가스로 정화(purging)를 하면 산소의 분압을 더 낮출 수 있었다. 3. 저산소 상태에서 세포 배양액 내에는 pH 감소, 젖산 증가, 포도당의 감소와 같은 미세환경이 변하였다. 4. 세포배양액에 따라 저산소에 의해 유도되는 포도당 저하에 차이가 있었다. 5. 비소세포폐암주는 저산소에 의해 증식능이 억제되었다. 결론: 저산소 상태는 세포 배양액 내 포도당 농도의 감소, 젖산의 증가, pH의 감소 등 세포 배양 미세 환경을 변화시키며, 비소세포폐암세포는 증식이 억제된다. 저산소는 미세 환경 변화와 함께 직접적으로 그리고 간접적으로 비소세포의 증식능에 영향을 미친다.
Background: Abnormal angiogenesis can induce hypoxia within a highly proliferating tumor mass, and these hypoxic conditions can in turn create clinical problems, such as resistance to chemotherapy. However, the mechanism by which hypoxia induces these changes has not yet been determined. Therefore, ...
Background: Abnormal angiogenesis can induce hypoxia within a highly proliferating tumor mass, and these hypoxic conditions can in turn create clinical problems, such as resistance to chemotherapy. However, the mechanism by which hypoxia induces these changes has not yet been determined. Therefore, this study was conducted to determine how hypoxia induces changes in cell viability and extracellular microenvironments in an in vitro culture system using non-small cell lung cancer cells. Methods: The non-small cell lung cancer cell line, A549 was cultured in DMEM or RPMI-1640 media that contained fetal bovine serum. A decrease in the oxygen tension of the media that contained the culture was then induced in a hypoxia microchamber using a $CO_2-N_2$ gas mixture. A gas analysis and an MTT assay were then conducted. Results: (1) The decrease in oxygen tension was checked the anaerobic gas mixture for 30 min and then reoxygenation was induced by adding a 5% $CO_2-room$ air gas mixture to the chamber. (2) Purging with the anaerobic gas mixture was found to decrease the further oxygen tension of cell culture media. (3) The low oxygen tension resulted in a low pH, lactic acidosis and a decreased glucose concentration in the media. (4) The decrease in glucose concentration that was observed as a result of hypoxia was markedly different when different types of media were evaluated. (5) The decrease in oxygen tension inhibited proliferation of A549 cells. Conclusion: These data suggests that tumor hypoxia is associated with acidosis and hypoglycemia, which have been implicated in the development of resistance to chemotherapy and radiotherapy.
Background: Abnormal angiogenesis can induce hypoxia within a highly proliferating tumor mass, and these hypoxic conditions can in turn create clinical problems, such as resistance to chemotherapy. However, the mechanism by which hypoxia induces these changes has not yet been determined. Therefore, this study was conducted to determine how hypoxia induces changes in cell viability and extracellular microenvironments in an in vitro culture system using non-small cell lung cancer cells. Methods: The non-small cell lung cancer cell line, A549 was cultured in DMEM or RPMI-1640 media that contained fetal bovine serum. A decrease in the oxygen tension of the media that contained the culture was then induced in a hypoxia microchamber using a $CO_2-N_2$ gas mixture. A gas analysis and an MTT assay were then conducted. Results: (1) The decrease in oxygen tension was checked the anaerobic gas mixture for 30 min and then reoxygenation was induced by adding a 5% $CO_2-room$ air gas mixture to the chamber. (2) Purging with the anaerobic gas mixture was found to decrease the further oxygen tension of cell culture media. (3) The low oxygen tension resulted in a low pH, lactic acidosis and a decreased glucose concentration in the media. (4) The decrease in glucose concentration that was observed as a result of hypoxia was markedly different when different types of media were evaluated. (5) The decrease in oxygen tension inhibited proliferation of A549 cells. Conclusion: These data suggests that tumor hypoxia is associated with acidosis and hypoglycemia, which have been implicated in the development of resistance to chemotherapy and radiotherapy.
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문제 정의
지금까지 세포 내 저산소 환경과 관련하여 임상적으로 중요한 수치들에 대한 연구가 많지 않았다. 이에 따라, 저자들은 본 연구를 통하여 비소세포 폐암 세포 주를 이용하여 체외 배양하였을 때 세포 배양액 내 환경을 조사하고 비소세포폐암주의 증식에 저산소증이 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
저산소증에서의 암세포 내의 유전자 표현을 연구하는 것은 병인의 규명과 나아가 치료에 결정적인 단초를 제공할 수 있다. 이에 본 연구에서는 체외 배양한 비소세포폐암의 증식과 저산소증 상태에 대한 연구를 시행하였다.
제안 방법
세포 배양기를 이용하기 때문에 불편한 점이 있으며, 다양한 산소의 농도를 만들기에는 비용 대비 효율성이 낮았다. 본 연구에서는 일반적으로 세포 배양에 쓰이는 큰 크기의 세포배양기 대신에 실험대 위에 올려놓고 조작할 수 있는 비교적 작은 크기의 세포 배양 챔버를 이용함으로써 산소 농도를 조정하였다.
실험에 사용한 세포주는 비소세포폐암 세포주로서 A549 세포주(CCL-185™, American Type Cell Culture, Manassas, VA)를 이용하여 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;Sigma-Aldrich, Seoul, Korea) 또는 RPMI-1640 배지(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)에서 우태아혈청(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)과 함께 배양하였으며, 세포의 밀도가 80-90%에 도달하였을 때 실험을 수행하였다. 5% CO2와 95% 대기 가스가 공급되는 37℃ 세포배양기에서 자라는 세포주를 대조군으로 하였다. 저산소군을 만들기 위하여 산소의 농도를 줄이는 방법은 세포배양기 내에 다시 작은 세포 배양기인 MIC-101(Modular Incubator, BillupsRothenberg Inc.
5% CO2와 95% 대기 가스가 공급되는 37℃ 세포배양기에서 자라는 세포주를 대조군으로 하였다. 저산소군을 만들기 위하여 산소의 농도를 줄이는 방법은 세포배양기 내에 다시 작은 세포 배양기인 MIC-101(Modular Incubator, BillupsRothenberg Inc., Germany)을 넣는 방법을 적용하였다(Figure 1). MIC-101 내에 세포배양접시를 넣어 두고 5분 동안 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 투여하여 배양액 내 MIC-101 내 산소의 분압을 감소시켰다.
MIC-101 내에 세포배양접시를 넣어 두고 5분 동안 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 투여하여 배양액 내 MIC-101 내 산소의 분압을 감소시켰다. 세 개의 세포 배양 접시를 5% CO2 세포배양기에 넣어 대조군으로 삼고 저산소군은 세 개의 세포배양접시를 MIC-101 챔버에 넣고 이를 다시 5% CO2 세포 배양기에 넣어 실험을 수행하였다. 같은 실험을 5회 실시하여 통계 분석을 실시하였다.
같은 실험을 5회 실시하여 통계 분석을 실시하였다. 무산소 가스를 반복적으로 투여하였을 때의 세포 배양액 내의 상태를 알아 보기 위한 실험으로서, 처음 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 5분간 투여한 후 MIC-101 챔버를 밀봉한 후 30분이 경과하였을 때 다시 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 5분간 MIC-101 챔버에 5분간 투여하였다(purging). 재산소화(reoxygenation)은 5% 산소와 95% 대기가 섞인 가스에 노출시켜 산소화시켰다.
재산소화(reoxygenation)은 5% 산소와 95% 대기가 섞인 가스에 노출시켜 산소화시켰다. 세포주가 자라는 배양액의 산소, 이산화탄소, pH, HCO3- , 락트산, 포도당, 전해질(Na+, K+, Cl-, Ca2+)의 농도를 혈액가스분석기(ABL725 Blood-Gas Analyzer; Radiometer; Copenhagen, Denmark)를 이용하여 실험 시작 후 16시간째에 측정하였다. 세포의 증식능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl-)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)]법을 이용하였으며 96-well 판에 well 당 5,000개의 세포를 심고 실험군 별로 여섯 well씩 만들 었으며 well 내 세포의 밀도가 90% 정도가 되도록 자랐을 때, 우태아 혈청을 1% 되게 한 DMEM에서 하루 동안 키운 후 본 실험에 들어갔고 72시간 동안 세포 증식능을 분광법을 이용하여 O.
본 연구에서는 MIC-101이라는 작은 크기의 세포 배양기를 이용하였는데 이 기구로는 10 cm 지름의 세포 배양 접시를 6개 정도 넣을 수 있으며 세포 배양접시의 종류에 따라 다양하게 세포를 키울 수 있다. 본 연구에서는 5분 정도의 무산소 혼합 가스를 MCI-101에 투여함으로써 150 mmHg의 산소 분압으로부터 90 또는 70 mmHg까지 산소 분압을 낮출 수 있었는데 무산소 혼합 가스를 초기 투여로부터 30분이 지난 뒤 다시 5분 정도 투여해 줌으로써 세포 배양액 내에 녹아 있던 산소가 MIC-101 내부로 확산되어 나오는 것을 다시 배출해 낸 효과로 생각이 되며, 무산소 혼합 가스로 정화(purging)하는 횟수에 따라서 세포 배양액 내 산소의 농도를 더 낮출 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
본 논문에서는 DMEM과 RPMI-1640을 이용하여 같은 실험을 해 보았는데, DMEM 배양액 내에는 25 mM(450 mg/dL)의 포도당이 포함되어 있는 반면, RPMI-1640 배지에는 11 mM(198 mg/dL)의 포도당이 포함되어 있다. 포도당의 세포 내 대사는 산소의 분압에 의존하게 되므로, 포도당의 농도 차이는 산소의 농도에 따라서 세포 내 대사 환경 또는 세포외 환경을 크게 변화시킬 수 있을 것이다.
재료 및 방법: 비소세포폐암주인 A549를 RPMI 배지에서 계대 배양하였다. 저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다. 대조군으로 5% CO2와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다.
대상 데이터
실험에 사용한 세포주는 비소세포폐암 세포주로서 A549 세포주(CCL-185™, American Type Cell Culture, Manassas, VA)를 이용하여 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;Sigma-Aldrich, Seoul, Korea) 또는 RPMI-1640 배지(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)에서 우태아혈청(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)과 함께 배양하였으며, 세포의 밀도가 80-90%에 도달하였을 때 실험을 수행하였다.
재료 및 방법: 비소세포폐암주인 A549를 RPMI 배지에서 계대 배양하였다. 저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다.
저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다. 대조군으로 5% CO2와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다. 세포의 증식 상태는 MTT 방법을 실시하였다.
데이터처리
(Optical Density)값을 측정하였다. 대조군과 실험군간의 평균의 비교는 T 검정을 이용하였으며, p값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
세포주가 자라는 배양액의 산소, 이산화탄소, pH, HCO3- , 락트산, 포도당, 전해질(Na+, K+, Cl-, Ca2+)의 농도를 혈액가스분석기(ABL725 Blood-Gas Analyzer; Radiometer; Copenhagen, Denmark)를 이용하여 실험 시작 후 16시간째에 측정하였다. 세포의 증식능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl-)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)]법을 이용하였으며 96-well 판에 well 당 5,000개의 세포를 심고 실험군 별로 여섯 well씩 만들 었으며 well 내 세포의 밀도가 90% 정도가 되도록 자랐을 때, 우태아 혈청을 1% 되게 한 DMEM에서 하루 동안 키운 후 본 실험에 들어갔고 72시간 동안 세포 증식능을 분광법을 이용하여 O.D.(Optical Density)값을 측정하였다. 대조군과 실험군간의 평균의 비교는 T 검정을 이용하였으며, p값이 0.
대조군으로 5% CO2와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다. 세포의 증식 상태는 MTT 방법을 실시하였다.
성능/효과
05). (A) Partial pressure of O2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, O2 was decreased. (B) Partial pressure of CO2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, CO2 was not decreased in comparison to normoxic control.
(A) Partial pressure of O2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, O2 was decreased. (B) Partial pressure of CO2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, CO2 was not decreased in comparison to normoxic control. (C) Glucose concentration was decreased significantly after 16 hour -treatment of hypoxia in contrast to normoxia (control).
실험 시작 직후 젖산의 농도는 0.7±0.5 mg/dL이었고, 16시간에 대조군의 젖산 농도는 4.1±1.7 mg/dL인 반면, 저산소군의 젖산 농도는 7.9±3.8 mg/dL로 유의한 차이를 보였다(p=0.014).
실험 시작 직후 포도당의 농도는 141.9±45.6 mg/dL이었으며, 16시간 째 대조군의 포도당 농도는 99.4±51.3 mg/dL이었고, 16시간째 저산소군의 배양액 내 포도당의 농도는 70.3±45.7 mg/dL으로 두 군간에는 유의한 차이를 보였다(p=0.026).
따라서, 대조군에 비해서 산소의 농도가 낮을수록 세포배양액 내에는 포도당의 농도는 더욱 감소하고 젖산은 축적되었다. 그러나 pH에는 차이가 나지 않는 것을 볼 수 있었다.
반면, RPMI-1640 배지에서 세포주를 배양하였을 때, 0시간에서 포도당 농도는 170±45.6 mg/dL이었고 16시간째에는 대조군에서는 124±20 mg/dL인 반면, 저산소군에서는 21±15 mg/dL로 저산소군에서 포도당 농도가 현저히 감소하였다.
72시간 동안 세포의 증식능을 분광법을 이용한 O.D.값을 측정하였을 때, 대조군에 비해 저산소군의 세포는 48시간째부터 증식능력이 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
본 연구에서는 5분 정도의 무산소 혼합 가스를 MCI-101에 투여함으로써 150 mmHg의 산소 분압으로부터 90 또는 70 mmHg까지 산소 분압을 낮출 수 있었는데 무산소 혼합 가스를 초기 투여로부터 30분이 지난 뒤 다시 5분 정도 투여해 줌으로써 세포 배양액 내에 녹아 있던 산소가 MIC-101 내부로 확산되어 나오는 것을 다시 배출해 낸 효과로 생각이 되며, 무산소 혼합 가스로 정화(purging)하는 횟수에 따라서 세포 배양액 내 산소의 농도를 더 낮출 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 본 연구에서는 MIC-101으로 저산소-재산소(hypoxia-reoxygenation)의 모델에도 적용해 볼 수 있을 것으로 생각되며 MIC-101에 무산소 혼합가스 대신 산소가 든 가스를 교환 투여하면 되는 편리성을 확인할 수 있었다. 결국 산소의 분압을 달리할 수 있고 재산소화를 시킬 수 있는데 유용한 실험법이 될 수 있을 것으로 기대해 본다.
포도당의 세포 내 대사는 산소의 분압에 의존하게 되므로, 포도당의 농도 차이는 산소의 농도에 따라서 세포 내 대사 환경 또는 세포외 환경을 크게 변화시킬 수 있을 것이다. 암조직에 따라서 암세포의 대사 속도가 매우 다양하고 종양의 표면과 중심부에 따라서도 혈관의 발달 여부와 함께 산소의 농도나 포도당의 농도가 큰 차이가 날 수 있으므로 종양의 생물학적 실험을 할 때에는 하고자 하는 목적에 맞추어 세포배양액을 선택하는 것이 좋을 것으로 보이며, 대사가 빠르거나 상대적으로 혈액의 공급이 높은 암세포에 대한 실험을 할 때에는 포도당의 농도가 높은 DMEM을, 그 반대의 실험을 위해서는 RPMI1640과 같이 포도당의 농도가 낮은 배지를 선택하거나 처음부터 포도당이 들어 있지 않는 배지를 사용하여 연구자가 포도당 농도를 조절하여 실험을 수행하는 것이 좋을 것으로 보인다. 본 연구에서도 저산소에 의한 직접적 세포 효과를 볼 수도 있었지만, 저산소증으로 인하여 세포의 혐기성 대사가 유도된 결과 젖산의 축적과 pH의 감소 및 다양한 농도의 저포도당증이 암세포에 영향을 줄 수 있다는 사실을 생각하고 실험을 수행하고 해석하여야 할 것으로 보인다.
결론적으로 본 연구를 통하여 저자들은, 저산소 상태가 세포 배양액 내 포도당 농도의 감소, 젖산의 증가, pH의 감소 등 세포 배양 미세 환경을 변화시키며, 저산소는 미세 환경 변화와 함께 직접적으로 그리고 간접적으로 비소세포폐암의 증식능에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
결과: 1. MIC-101을 이용하였을 때, 무산소혼합가스를 투여 후 30분에 50%의 산소 분압저하를 확인하였으며, 대기 가스에 의해 산소농도를 회복하는 것을 볼 수 있었다. 2.
MIC-101을 이용하였을 때, 무산소혼합가스를 투여 후 30분에 50%의 산소 분압저하를 확인하였으며, 대기 가스에 의해 산소농도를 회복하는 것을 볼 수 있었다. 2. 무산소 혼합가스로 정화(purging)를 하면 산소의 분압을 더 낮출 수 있었다. 3.
무산소 혼합가스로 정화(purging)를 하면 산소의 분압을 더 낮출 수 있었다. 3. 저산소 상태에서 세포 배양액 내에는 pH 감소, 젖산 증가, 포도당의 감소 와 같은 미세환경이 변하였다. 4.
저산소 상태에서 세포 배양액 내에는 pH 감소, 젖산 증가, 포도당의 감소 와 같은 미세환경이 변하였다. 4. 세포배양액에 따라 저산소에 의해 유도되는 포도당 저하에 차이가 있었다. 5.
세포배양액에 따라 저산소에 의해 유도되는 포도당 저하에 차이가 있었다. 5. 비소세포폐암주는 저산소에 의해 증식능이 억제되었다.
결론: 저산소 상태는 세포 배양액 내 포도당 농도의 감소, 젖산의 증가, pH의 감소 등 세포 배양 미세 환경을 변화시키며, 비소세포폐암세포는 증식이 억제된다. 저산소는 미세 환경 변화와 함께 직접적으로 그리고 간접적으로 비소세포의 증식능에 영향을 미친다.
처음 배양액 내 산소의 분압이 148-150 mmHg이었던 것을 무산소 혼합 가스를 5분 동안 세정 및 정화하여 30분 후에 측정한 결과 74.5 mmHg 정도로 50%가량 산소 분압이 감소시킨 뒤에, 5% 이산화탄소와 95%의 대기 가스를 다시 주입하고 한 시간에 측정한 산소의 분압은 거의 처음의 상태로 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 산소를 다시 투여하면 이산화탄소의 농도는 줄어들었다.
후속연구
본 연구에서는 MIC-101이라는 작은 크기의 세포 배양기를 이용하였는데 이 기구로는 10 cm 지름의 세포 배양 접시를 6개 정도 넣을 수 있으며 세포 배양접시의 종류에 따라 다양하게 세포를 키울 수 있다. 본 연구에서는 5분 정도의 무산소 혼합 가스를 MCI-101에 투여함으로써 150 mmHg의 산소 분압으로부터 90 또는 70 mmHg까지 산소 분압을 낮출 수 있었는데 무산소 혼합 가스를 초기 투여로부터 30분이 지난 뒤 다시 5분 정도 투여해 줌으로써 세포 배양액 내에 녹아 있던 산소가 MIC-101 내부로 확산되어 나오는 것을 다시 배출해 낸 효과로 생각이 되며, 무산소 혼합 가스로 정화(purging)하는 횟수에 따라서 세포 배양액 내 산소의 농도를 더 낮출 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 본 연구에서는 MIC-101으로 저산소-재산소(hypoxia-reoxygenation)의 모델에도 적용해 볼 수 있을 것으로 생각되며 MIC-101에 무산소 혼합가스 대신 산소가 든 가스를 교환 투여하면 되는 편리성을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 MIC-101으로 저산소-재산소(hypoxia-reoxygenation)의 모델에도 적용해 볼 수 있을 것으로 생각되며 MIC-101에 무산소 혼합가스 대신 산소가 든 가스를 교환 투여하면 되는 편리성을 확인할 수 있었다. 결국 산소의 분압을 달리할 수 있고 재산소화를 시킬 수 있는데 유용한 실험법이 될 수 있을 것으로 기대해 본다.
암조직에 따라서 암세포의 대사 속도가 매우 다양하고 종양의 표면과 중심부에 따라서도 혈관의 발달 여부와 함께 산소의 농도나 포도당의 농도가 큰 차이가 날 수 있으므로 종양의 생물학적 실험을 할 때에는 하고자 하는 목적에 맞추어 세포배양액을 선택하는 것이 좋을 것으로 보이며, 대사가 빠르거나 상대적으로 혈액의 공급이 높은 암세포에 대한 실험을 할 때에는 포도당의 농도가 높은 DMEM을, 그 반대의 실험을 위해서는 RPMI1640과 같이 포도당의 농도가 낮은 배지를 선택하거나 처음부터 포도당이 들어 있지 않는 배지를 사용하여 연구자가 포도당 농도를 조절하여 실험을 수행하는 것이 좋을 것으로 보인다. 본 연구에서도 저산소에 의한 직접적 세포 효과를 볼 수도 있었지만, 저산소증으로 인하여 세포의 혐기성 대사가 유도된 결과 젖산의 축적과 pH의 감소 및 다양한 농도의 저포도당증이 암세포에 영향을 줄 수 있다는 사실을 생각하고 실험을 수행하고 해석하여야 할 것으로 보인다. 물론 비소세포폐암의 종괴 내부의 암세포와 외부의 암세포가 받는 미세 환경이 다르며 본 실험에서와 유사하게 내부 세포에서는 저산소, 산성, 저혈당증 등이 있을 것으로 기대되기 때문에 본 실험에서 저산소와 함께 세포 배양액 내 미세 환경을 임상적으로 중요한 기준을 중심으로 측정한 것은 체외 실험이 체내 실험을 대치할 수 없는 한계에도 불구하고 임상 의사에게 호소할 수 있는 실험 모델이 될 수 있을 것으로 보인다.
본 연구에서도 저산소에 의한 직접적 세포 효과를 볼 수도 있었지만, 저산소증으로 인하여 세포의 혐기성 대사가 유도된 결과 젖산의 축적과 pH의 감소 및 다양한 농도의 저포도당증이 암세포에 영향을 줄 수 있다는 사실을 생각하고 실험을 수행하고 해석하여야 할 것으로 보인다. 물론 비소세포폐암의 종괴 내부의 암세포와 외부의 암세포가 받는 미세 환경이 다르며 본 실험에서와 유사하게 내부 세포에서는 저산소, 산성, 저혈당증 등이 있을 것으로 기대되기 때문에 본 실험에서 저산소와 함께 세포 배양액 내 미세 환경을 임상적으로 중요한 기준을 중심으로 측정한 것은 체외 실험이 체내 실험을 대치할 수 없는 한계에도 불구하고 임상 의사에게 호소할 수 있는 실험 모델이 될 수 있을 것으로 보인다. 저산소증에 의해서 해당 과정(glycolytic pathway)이 변하게 되는 것은 저산소증에 의해 활성화되는 Hypoxiainducible Factor-1α(HIF-1α)이 해당과정을 조절하는 역할이 있기 때문이며 활성화된 HIF-1α는 저산소증에 의한 비소세포폐암주의 세포자멸사를 촉진시킨다16.
그러나, 이와는 반대로 또 다른 연구에 의하면 저산소증은 폐암 세포의 세포 자멸사를 억제하는 역할을 할 수도 있는 것으로 보고되었다19. 이러한 사실들을 보면, 저산소증은 여러 가지 현상에 상반되거나 다양한 영향을 미칠 수 있어 연구마다 본 연구와 같은 인자들을 반드시 함께 고려하는 것이 필요할 것으로 보인다.
기타 칼륨 통로, 전압 의존 칼슘 이온 통로나 ATP의존 세포막 칼슘 펌프, 칼슘-나트륨 교환 통로 등도 저산소증과 관련이 있다20,21. 본 연구에서는 전해질의 세포막 이동이나 이온 통로에 대한 구체적인 연구를 시행하지 않아서 전해질의 이동에 대한 결정적인 연구는 되지 못하는 한계가 있지만, 저산소증이나 정상 분압의 산소 환경 하 세포배양액 내 나트륨, 칼륨, 염소, 칼슘 이온의 농도의 큰 차이는 볼 수 없었다.
산소의 분압이 저하된 상태에서는 당연하게도 비소세포폐암 세포주의 증식은 억제 되는 것을 본 실험에서 관찰할 수 있었으며, 저산소에 의한 직접적, 간접적 효과에 의할 것으로 생각되며 본 논문에서는 제시되지 않았지만 재산소화 이후 세포의 증식능의 회복 등을 확인한다면 세포 생물학적 분자 생물학적으로 비소세포폐암세포의 성질이나 변화를 규명하는데 쉬운 길이 될 것으로 믿는다. 단 증식의 억제는 생존능이나 주변 조직 침입 능력이나 원격 전이 등과 같은 현상들과의 상관관계에 대해서는 앞으로의 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
산소의 분압이 저하된 상태에서는 당연하게도 비소세포폐암 세포주의 증식은 억제 되는 것을 본 실험에서 관찰할 수 있었으며, 저산소에 의한 직접적, 간접적 효과에 의할 것으로 생각되며 본 논문에서는 제시되지 않았지만 재산소화 이후 세포의 증식능의 회복 등을 확인한다면 세포 생물학적 분자 생물학적으로 비소세포폐암세포의 성질이나 변화를 규명하는데 쉬운 길이 될 것으로 믿는다. 단 증식의 억제는 생존능이나 주변 조직 침입 능력이나 원격 전이 등과 같은 현상들과의 상관관계에 대해서는 앞으로의 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
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