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문제 정의
- 지금까지 세포 내 저산소 환경과 관련하여 임상적으로 중요한 수치들에 대한 연구가 많지 않았다. 이에 따라, 저자들은 본 연구를 통하여 비소세포 폐암 세포 주를 이용하여 체외 배양하였을 때 세포 배양액 내 환경을 조사하고 비소세포폐암주의 증식에 저산소증이 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
- 저산소증에서의 암세포 내의 유전자 표현을 연구하는 것은 병인의 규명과 나아가 치료에 결정적인 단초를 제공할 수 있다. 이에 본 연구에서는 체외 배양한 비소세포폐암의 증식과 저산소증 상태에 대한 연구를 시행하였다.
제안 방법
- 세포 배양기를 이용하기 때문에 불편한 점이 있으며, 다양한 산소의 농도를 만들기에는 비용 대비 효율성이 낮았다. 본 연구에서는 일반적으로 세포 배양에 쓰이는 큰 크기의 세포배양기 대신에 실험대 위에 올려놓고 조작할 수 있는 비교적 작은 크기의 세포 배양 챔버를 이용함으로써 산소 농도를 조정하였다.
- 실험에 사용한 세포주는 비소세포폐암 세포주로서 A549 세포주(CCL-185™, American Type Cell Culture, Manassas, VA)를 이용하여 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;Sigma-Aldrich, Seoul, Korea) 또는 RPMI-1640 배지(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)에서 우태아혈청(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)과 함께 배양하였으며, 세포의 밀도가 80-90%에 도달하였을 때 실험을 수행하였다. 5% CO2와 95% 대기 가스가 공급되는 37℃ 세포배양기에서 자라는 세포주를 대조군으로 하였다. 저산소군을 만들기 위하여 산소의 농도를 줄이는 방법은 세포배양기 내에 다시 작은 세포 배양기인 MIC-101(Modular Incubator, BillupsRothenberg Inc.
- 5% CO2와 95% 대기 가스가 공급되는 37℃ 세포배양기에서 자라는 세포주를 대조군으로 하였다. 저산소군을 만들기 위하여 산소의 농도를 줄이는 방법은 세포배양기 내에 다시 작은 세포 배양기인 MIC-101(Modular Incubator, BillupsRothenberg Inc., Germany)을 넣는 방법을 적용하였다(Figure 1). MIC-101 내에 세포배양접시를 넣어 두고 5분 동안 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 투여하여 배양액 내 MIC-101 내 산소의 분압을 감소시켰다.
- MIC-101 내에 세포배양접시를 넣어 두고 5분 동안 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 투여하여 배양액 내 MIC-101 내 산소의 분압을 감소시켰다. 세 개의 세포 배양 접시를 5% CO2 세포배양기에 넣어 대조군으로 삼고 저산소군은 세 개의 세포배양접시를 MIC-101 챔버에 넣고 이를 다시 5% CO2 세포 배양기에 넣어 실험을 수행하였다. 같은 실험을 5회 실시하여 통계 분석을 실시하였다.
- 같은 실험을 5회 실시하여 통계 분석을 실시하였다. 무산소 가스를 반복적으로 투여하였을 때의 세포 배양액 내의 상태를 알아 보기 위한 실험으로서, 처음 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 5분간 투여한 후 MIC-101 챔버를 밀봉한 후 30분이 경과하였을 때 다시 5% CO2와 95% N2가 혼합되어 있는 가스를 5분간 MIC-101 챔버에 5분간 투여하였다(purging). 재산소화(reoxygenation)은 5% 산소와 95% 대기가 섞인 가스에 노출시켜 산소화시켰다.
- 재산소화(reoxygenation)은 5% 산소와 95% 대기가 섞인 가스에 노출시켜 산소화시켰다. 세포주가 자라는 배양액의 산소, 이산화탄소, pH, HCO3- , 락트산, 포도당, 전해질(Na+, K+, Cl-, Ca2+)의 농도를 혈액가스분석기(ABL725 Blood-Gas Analyzer; Radiometer; Copenhagen, Denmark)를 이용하여 실험 시작 후 16시간째에 측정하였다. 세포의 증식능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl-)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)]법을 이용하였으며 96-well 판에 well 당 5,000개의 세포를 심고 실험군 별로 여섯 well씩 만들 었으며 well 내 세포의 밀도가 90% 정도가 되도록 자랐을 때, 우태아 혈청을 1% 되게 한 DMEM에서 하루 동안 키운 후 본 실험에 들어갔고 72시간 동안 세포 증식능을 분광법을 이용하여 O.
- 본 연구에서는 MIC-101이라는 작은 크기의 세포 배양기를 이용하였는데 이 기구로는 10 cm 지름의 세포 배양 접시를 6개 정도 넣을 수 있으며 세포 배양접시의 종류에 따라 다양하게 세포를 키울 수 있다. 본 연구에서는 5분 정도의 무산소 혼합 가스를 MCI-101에 투여함으로써 150 mmHg의 산소 분압으로부터 90 또는 70 mmHg까지 산소 분압을 낮출 수 있었는데 무산소 혼합 가스를 초기 투여로부터 30분이 지난 뒤 다시 5분 정도 투여해 줌으로써 세포 배양액 내에 녹아 있던 산소가 MIC-101 내부로 확산되어 나오는 것을 다시 배출해 낸 효과로 생각이 되며, 무산소 혼합 가스로 정화(purging)하는 횟수에 따라서 세포 배양액 내 산소의 농도를 더 낮출 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
- 본 논문에서는 DMEM과 RPMI-1640을 이용하여 같은 실험을 해 보았는데, DMEM 배양액 내에는 25 mM(450 mg/dL)의 포도당이 포함되어 있는 반면, RPMI-1640 배지에는 11 mM(198 mg/dL)의 포도당이 포함되어 있다. 포도당의 세포 내 대사는 산소의 분압에 의존하게 되므로, 포도당의 농도 차이는 산소의 농도에 따라서 세포 내 대사 환경 또는 세포외 환경을 크게 변화시킬 수 있을 것이다.
- 재료 및 방법: 비소세포폐암주인 A549를 RPMI 배지에서 계대 배양하였다. 저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다. 대조군으로 5% CO2와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 세포주는 비소세포폐암 세포주로서 A549 세포주(CCL-185™, American Type Cell Culture, Manassas, VA)를 이용하여 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;Sigma-Aldrich, Seoul, Korea) 또는 RPMI-1640 배지(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)에서 우태아혈청(Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)과 함께 배양하였으며, 세포의 밀도가 80-90%에 도달하였을 때 실험을 수행하였다.
- 재료 및 방법: 비소세포폐암주인 A549를 RPMI 배지에서 계대 배양하였다. 저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다.
- 저산소 유사 상태는 Modular Incubator Chamber(MIC-101)을 이용하였고 5% 이산화탄소와 95% 질소 혼합 가스를 5분간 공급하여 저산소 상태를 만들었으며 세포 배양액을 채취하여 혈액가스분석기(Blood Gas Analyzer ABL 725)로 세포 배양 상태를 측정하였다. 대조군으로 5% CO2와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다. 세포의 증식 상태는 MTT 방법을 실시하였다.
데이터처리
- (Optical Density)값을 측정하였다. 대조군과 실험군간의 평균의 비교는 T 검정을 이용하였으며, p값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 세포주가 자라는 배양액의 산소, 이산화탄소, pH, HCO3- , 락트산, 포도당, 전해질(Na+, K+, Cl-, Ca2+)의 농도를 혈액가스분석기(ABL725 Blood-Gas Analyzer; Radiometer; Copenhagen, Denmark)를 이용하여 실험 시작 후 16시간째에 측정하였다. 세포의 증식능은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl-)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)]법을 이용하였으며 96-well 판에 well 당 5,000개의 세포를 심고 실험군 별로 여섯 well씩 만들 었으며 well 내 세포의 밀도가 90% 정도가 되도록 자랐을 때, 우태아 혈청을 1% 되게 한 DMEM에서 하루 동안 키운 후 본 실험에 들어갔고 72시간 동안 세포 증식능을 분광법을 이용하여 O.D.(Optical Density)값을 측정하였다. 대조군과 실험군간의 평균의 비교는 T 검정을 이용하였으며, p값이 0.
- 대조군으로 5% CO2와 멸균한 대기 공기 95%가 혼합된 가스를 사용하였다. 세포의 증식 상태는 MTT 방법을 실시하였다.
성능/효과
- 05). (A) Partial pressure of O2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, O2 was decreased. (B) Partial pressure of CO2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, CO2 was not decreased in comparison to normoxic control.
- (A) Partial pressure of O2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, O2 was decreased. (B) Partial pressure of CO2; In sixteen hours after treatment of 5% CO2-95% N2 gas mixture, CO2 was not decreased in comparison to normoxic control. (C) Glucose concentration was decreased significantly after 16 hour -treatment of hypoxia in contrast to normoxia (control).
- 실험 시작 직후 젖산의 농도는 0.7±0.5 mg/dL이었고, 16시간에 대조군의 젖산 농도는 4.1±1.7 mg/dL인 반면, 저산소군의 젖산 농도는 7.9±3.8 mg/dL로 유의한 차이를 보였다(p=0.014).
- 실험 시작 직후 포도당의 농도는 141.9±45.6 mg/dL이었으며, 16시간 째 대조군의 포도당 농도는 99.4±51.3 mg/dL이었고, 16시간째 저산소군의 배양액 내 포도당의 농도는 70.3±45.7 mg/dL으로 두 군간에는 유의한 차이를 보였다(p=0.026).
- 따라서, 대조군에 비해서 산소의 농도가 낮을수록 세포배양액 내에는 포도당의 농도는 더욱 감소하고 젖산은 축적되었다. 그러나 pH에는 차이가 나지 않는 것을 볼 수 있었다.
- 반면, RPMI-1640 배지에서 세포주를 배양하였을 때, 0시간에서 포도당 농도는 170±45.6 mg/dL이었고 16시간째에는 대조군에서는 124±20 mg/dL인 반면, 저산소군에서는 21±15 mg/dL로 저산소군에서 포도당 농도가 현저히 감소하였다.
- 72시간 동안 세포의 증식능을 분광법을 이용한 O.D.값을 측정하였을 때, 대조군에 비해 저산소군의 세포는 48시간째부터 증식능력이 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.
- 본 연구에서는 5분 정도의 무산소 혼합 가스를 MCI-101에 투여함으로써 150 mmHg의 산소 분압으로부터 90 또는 70 mmHg까지 산소 분압을 낮출 수 있었는데 무산소 혼합 가스를 초기 투여로부터 30분이 지난 뒤 다시 5분 정도 투여해 줌으로써 세포 배양액 내에 녹아 있던 산소가 MIC-101 내부로 확산되어 나오는 것을 다시 배출해 낸 효과로 생각이 되며, 무산소 혼합 가스로 정화(purging)하는 횟수에 따라서 세포 배양액 내 산소의 농도를 더 낮출 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 본 연구에서는 MIC-101으로 저산소-재산소(hypoxia-reoxygenation)의 모델에도 적용해 볼 수 있을 것으로 생각되며 MIC-101에 무산소 혼합가스 대신 산소가 든 가스를 교환 투여하면 되는 편리성을 확인할 수 있었다. 결국 산소의 분압을 달리할 수 있고 재산소화를 시킬 수 있는데 유용한 실험법이 될 수 있을 것으로 기대해 본다.
- 포도당의 세포 내 대사는 산소의 분압에 의존하게 되므로, 포도당의 농도 차이는 산소의 농도에 따라서 세포 내 대사 환경 또는 세포외 환경을 크게 변화시킬 수 있을 것이다. 암조직에 따라서 암세포의 대사 속도가 매우 다양하고 종양의 표면과 중심부에 따라서도 혈관의 발달 여부와 함께 산소의 농도나 포도당의 농도가 큰 차이가 날 수 있으므로 종양의 생물학적 실험을 할 때에는 하고자 하는 목적에 맞추어 세포배양액을 선택하는 것이 좋을 것으로 보이며, 대사가 빠르거나 상대적으로 혈액의 공급이 높은 암세포에 대한 실험을 할 때에는 포도당의 농도가 높은 DMEM을, 그 반대의 실험을 위해서는 RPMI1640과 같이 포도당의 농도가 낮은 배지를 선택하거나 처음부터 포도당이 들어 있지 않는 배지를 사용하여 연구자가 포도당 농도를 조절하여 실험을 수행하는 것이 좋을 것으로 보인다. 본 연구에서도 저산소에 의한 직접적 세포 효과를 볼 수도 있었지만, 저산소증으로 인하여 세포의 혐기성 대사가 유도된 결과 젖산의 축적과 pH의 감소 및 다양한 농도의 저포도당증이 암세포에 영향을 줄 수 있다는 사실을 생각하고 실험을 수행하고 해석하여야 할 것으로 보인다.
- 결론적으로 본 연구를 통하여 저자들은, 저산소 상태가 세포 배양액 내 포도당 농도의 감소, 젖산의 증가, pH의 감소 등 세포 배양 미세 환경을 변화시키며, 저산소는 미세 환경 변화와 함께 직접적으로 그리고 간접적으로 비소세포폐암의 증식능에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
- 결과: 1. MIC-101을 이용하였을 때, 무산소혼합가스를 투여 후 30분에 50%의 산소 분압저하를 확인하였으며, 대기 가스에 의해 산소농도를 회복하는 것을 볼 수 있었다. 2.
- MIC-101을 이용하였을 때, 무산소혼합가스를 투여 후 30분에 50%의 산소 분압저하를 확인하였으며, 대기 가스에 의해 산소농도를 회복하는 것을 볼 수 있었다. 2. 무산소 혼합가스로 정화(purging)를 하면 산소의 분압을 더 낮출 수 있었다. 3.
- 무산소 혼합가스로 정화(purging)를 하면 산소의 분압을 더 낮출 수 있었다. 3. 저산소 상태에서 세포 배양액 내에는 pH 감소, 젖산 증가, 포도당의 감소 와 같은 미세환경이 변하였다. 4.
- 저산소 상태에서 세포 배양액 내에는 pH 감소, 젖산 증가, 포도당의 감소 와 같은 미세환경이 변하였다. 4. 세포배양액에 따라 저산소에 의해 유도되는 포도당 저하에 차이가 있었다. 5.
- 세포배양액에 따라 저산소에 의해 유도되는 포도당 저하에 차이가 있었다. 5. 비소세포폐암주는 저산소에 의해 증식능이 억제되었다.
- 결론: 저산소 상태는 세포 배양액 내 포도당 농도의 감소, 젖산의 증가, pH의 감소 등 세포 배양 미세 환경을 변화시키며, 비소세포폐암세포는 증식이 억제된다. 저산소는 미세 환경 변화와 함께 직접적으로 그리고 간접적으로 비소세포의 증식능에 영향을 미친다.
- 처음 배양액 내 산소의 분압이 148-150 mmHg이었던 것을 무산소 혼합 가스를 5분 동안 세정 및 정화하여 30분 후에 측정한 결과 74.5 mmHg 정도로 50%가량 산소 분압이 감소시킨 뒤에, 5% 이산화탄소와 95%의 대기 가스를 다시 주입하고 한 시간에 측정한 산소의 분압은 거의 처음의 상태로 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 산소를 다시 투여하면 이산화탄소의 농도는 줄어들었다.
후속연구
- 본 연구에서는 MIC-101이라는 작은 크기의 세포 배양기를 이용하였는데 이 기구로는 10 cm 지름의 세포 배양 접시를 6개 정도 넣을 수 있으며 세포 배양접시의 종류에 따라 다양하게 세포를 키울 수 있다. 본 연구에서는 5분 정도의 무산소 혼합 가스를 MCI-101에 투여함으로써 150 mmHg의 산소 분압으로부터 90 또는 70 mmHg까지 산소 분압을 낮출 수 있었는데 무산소 혼합 가스를 초기 투여로부터 30분이 지난 뒤 다시 5분 정도 투여해 줌으로써 세포 배양액 내에 녹아 있던 산소가 MIC-101 내부로 확산되어 나오는 것을 다시 배출해 낸 효과로 생각이 되며, 무산소 혼합 가스로 정화(purging)하는 횟수에 따라서 세포 배양액 내 산소의 농도를 더 낮출 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 본 연구에서는 MIC-101으로 저산소-재산소(hypoxia-reoxygenation)의 모델에도 적용해 볼 수 있을 것으로 생각되며 MIC-101에 무산소 혼합가스 대신 산소가 든 가스를 교환 투여하면 되는 편리성을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 MIC-101으로 저산소-재산소(hypoxia-reoxygenation)의 모델에도 적용해 볼 수 있을 것으로 생각되며 MIC-101에 무산소 혼합가스 대신 산소가 든 가스를 교환 투여하면 되는 편리성을 확인할 수 있었다. 결국 산소의 분압을 달리할 수 있고 재산소화를 시킬 수 있는데 유용한 실험법이 될 수 있을 것으로 기대해 본다.
- 암조직에 따라서 암세포의 대사 속도가 매우 다양하고 종양의 표면과 중심부에 따라서도 혈관의 발달 여부와 함께 산소의 농도나 포도당의 농도가 큰 차이가 날 수 있으므로 종양의 생물학적 실험을 할 때에는 하고자 하는 목적에 맞추어 세포배양액을 선택하는 것이 좋을 것으로 보이며, 대사가 빠르거나 상대적으로 혈액의 공급이 높은 암세포에 대한 실험을 할 때에는 포도당의 농도가 높은 DMEM을, 그 반대의 실험을 위해서는 RPMI1640과 같이 포도당의 농도가 낮은 배지를 선택하거나 처음부터 포도당이 들어 있지 않는 배지를 사용하여 연구자가 포도당 농도를 조절하여 실험을 수행하는 것이 좋을 것으로 보인다. 본 연구에서도 저산소에 의한 직접적 세포 효과를 볼 수도 있었지만, 저산소증으로 인하여 세포의 혐기성 대사가 유도된 결과 젖산의 축적과 pH의 감소 및 다양한 농도의 저포도당증이 암세포에 영향을 줄 수 있다는 사실을 생각하고 실험을 수행하고 해석하여야 할 것으로 보인다. 물론 비소세포폐암의 종괴 내부의 암세포와 외부의 암세포가 받는 미세 환경이 다르며 본 실험에서와 유사하게 내부 세포에서는 저산소, 산성, 저혈당증 등이 있을 것으로 기대되기 때문에 본 실험에서 저산소와 함께 세포 배양액 내 미세 환경을 임상적으로 중요한 기준을 중심으로 측정한 것은 체외 실험이 체내 실험을 대치할 수 없는 한계에도 불구하고 임상 의사에게 호소할 수 있는 실험 모델이 될 수 있을 것으로 보인다.
- 본 연구에서도 저산소에 의한 직접적 세포 효과를 볼 수도 있었지만, 저산소증으로 인하여 세포의 혐기성 대사가 유도된 결과 젖산의 축적과 pH의 감소 및 다양한 농도의 저포도당증이 암세포에 영향을 줄 수 있다는 사실을 생각하고 실험을 수행하고 해석하여야 할 것으로 보인다. 물론 비소세포폐암의 종괴 내부의 암세포와 외부의 암세포가 받는 미세 환경이 다르며 본 실험에서와 유사하게 내부 세포에서는 저산소, 산성, 저혈당증 등이 있을 것으로 기대되기 때문에 본 실험에서 저산소와 함께 세포 배양액 내 미세 환경을 임상적으로 중요한 기준을 중심으로 측정한 것은 체외 실험이 체내 실험을 대치할 수 없는 한계에도 불구하고 임상 의사에게 호소할 수 있는 실험 모델이 될 수 있을 것으로 보인다. 저산소증에 의해서 해당 과정(glycolytic pathway)이 변하게 되는 것은 저산소증에 의해 활성화되는 Hypoxiainducible Factor-1α(HIF-1α)이 해당과정을 조절하는 역할이 있기 때문이며 활성화된 HIF-1α는 저산소증에 의한 비소세포폐암주의 세포자멸사를 촉진시킨다16.
- 그러나, 이와는 반대로 또 다른 연구에 의하면 저산소증은 폐암 세포의 세포 자멸사를 억제하는 역할을 할 수도 있는 것으로 보고되었다19. 이러한 사실들을 보면, 저산소증은 여러 가지 현상에 상반되거나 다양한 영향을 미칠 수 있어 연구마다 본 연구와 같은 인자들을 반드시 함께 고려하는 것이 필요할 것으로 보인다.
- 기타 칼륨 통로, 전압 의존 칼슘 이온 통로나 ATP의존 세포막 칼슘 펌프, 칼슘-나트륨 교환 통로 등도 저산소증과 관련이 있다20,21. 본 연구에서는 전해질의 세포막 이동이나 이온 통로에 대한 구체적인 연구를 시행하지 않아서 전해질의 이동에 대한 결정적인 연구는 되지 못하는 한계가 있지만, 저산소증이나 정상 분압의 산소 환경 하 세포배양액 내 나트륨, 칼륨, 염소, 칼슘 이온의 농도의 큰 차이는 볼 수 없었다.
- 산소의 분압이 저하된 상태에서는 당연하게도 비소세포폐암 세포주의 증식은 억제 되는 것을 본 실험에서 관찰할 수 있었으며, 저산소에 의한 직접적, 간접적 효과에 의할 것으로 생각되며 본 논문에서는 제시되지 않았지만 재산소화 이후 세포의 증식능의 회복 등을 확인한다면 세포 생물학적 분자 생물학적으로 비소세포폐암세포의 성질이나 변화를 규명하는데 쉬운 길이 될 것으로 믿는다. 단 증식의 억제는 생존능이나 주변 조직 침입 능력이나 원격 전이 등과 같은 현상들과의 상관관계에 대해서는 앞으로의 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
- 산소의 분압이 저하된 상태에서는 당연하게도 비소세포폐암 세포주의 증식은 억제 되는 것을 본 실험에서 관찰할 수 있었으며, 저산소에 의한 직접적, 간접적 효과에 의할 것으로 생각되며 본 논문에서는 제시되지 않았지만 재산소화 이후 세포의 증식능의 회복 등을 확인한다면 세포 생물학적 분자 생물학적으로 비소세포폐암세포의 성질이나 변화를 규명하는데 쉬운 길이 될 것으로 믿는다. 단 증식의 억제는 생존능이나 주변 조직 침입 능력이나 원격 전이 등과 같은 현상들과의 상관관계에 대해서는 앞으로의 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
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