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문제 정의
- 본 연구는 사과의 수출입 통관 검역지소에서 발생될수 있는 복숭아순나방과 복숭아심식나방의 정확한 종 동정을 위한 분자지표를 개발하는데 목적을 두었다. 이를 위해 비교적 종간 변이가 뚜렷한 미토콘드리아의 영역을 대상으로 PCR-RFLP 기술과 종특이적 프라이머를 이용한 PCR 증폭기술을 개발하였다.
제안 방법
- 또한 이 세 가지 PCR-RFLP에서는 복숭아순나방은 절편을 만들도록 하였고, 복숭아심식나방은 제한위치가 없거나 또는 말단에 위치하여 전기영동 상에서는 거의 단일밴드가 나타나도록 제작하였다. COI 영역은 염기서열보다 연장된 증폭물을 얻었고 부분적 염기서열을 분석하였다(미보고자료). 이 증폭물은 D yaki/ba의 mtDNA 염기서열(Clary and Wolstenholme, 1985)을 바탕으로 일부 tRNA 영역이 포함하였다.
- COI영역 안에서 복숭아순나방과 복숭아심식나방에서 특별히 차이가 나는 부분을 찾아 primer를 제작하였다 (Table 2). 각 PCR 시료의 구성과 반응은 상기에 기술된 조건을 따랐다.
- 단, 프라이머 결합 반응은 56℃에서 30초 동안 이뤄졌다. PCR 생성물은 IX TAE어서 1% agarose 젤로 확인하였다.
- 이후 최종사슬 연장 단계가 추가로 72℃에서 10분간 이뤄졌다. PCR 생성물은 lx TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 1% 아가로즈젤로 확인하였다.
- PCR-RFLP를 위한 진단용 분자지표가 이상에서 밝혀진 염기서열을 바탕으로 개발되었다(Fig. 4). RFLP의 판단을 용이하게 하기 위해 제한위치의 유무에 따라 종 구분을 할 수 있게 각 영역별 제한효소를 선발하였다.
- 4). RFLP의 판단을 용이하게 하기 위해 제한위치의 유무에 따라 종 구분을 할 수 있게 각 영역별 제한효소를 선발하였다. 또한 이 세 가지 PCR-RFLP에서는 복숭아순나방은 절편을 만들도록 하였고, 복숭아심식나방은 제한위치가 없거나 또는 말단에 위치하여 전기영동 상에서는 거의 단일밴드가 나타나도록 제작하였다.
- mtDNA 영역별 PCR 증폭물은 PCRquick-spin ((주) 인트론바이오테크놀로지, 대전)을 이용하여 프라이머를 제거시켰고, PCR2.1 TOPO kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) 를 사용하여 클로닝벡터에 재조합시켰다. 재조합된 벡터를 (주) 마크로젠(서울)에 염기서열 분석을 의뢰하여 받은 자료를 가지고 DNAstar 프로그램(Version 5.
- 날개를 제거한 각 성충을 400 讥의 추출완충용액(10 mM Tris, 0.1 M EDTA, 20 |ig/ml RNase, 0.5% SDS, pH 8)에서 분쇄한 후 5 |jl의 proteinase K (최종농도 100 k回ml)를 첨가하여 50℃ 항온수조에서 10분간 반응시켰다. 이후 페놀추출을 실시하였다.
- RFLP의 판단을 용이하게 하기 위해 제한위치의 유무에 따라 종 구분을 할 수 있게 각 영역별 제한효소를 선발하였다. 또한 이 세 가지 PCR-RFLP에서는 복숭아순나방은 절편을 만들도록 하였고, 복숭아심식나방은 제한위치가 없거나 또는 말단에 위치하여 전기영동 상에서는 거의 단일밴드가 나타나도록 제작하였다. COI 영역은 염기서열보다 연장된 증폭물을 얻었고 부분적 염기서열을 분석하였다(미보고자료).
- 복숭아순나방과 복숭아심 식 나방의 DNA 분자지 표를 개발하기 위해 mtDNA 영역을 설정하였고, 이 가운데 검역에 있어서 종 구분에 많이 이용되는 COI 영역을 중심으로 염기서열이 분석되었다(Rg. 1). 두 종의 염기서열은 국내에서 채집된 두 개체를 중심으로 분석되었으며, 염기서열은 기존에 밝혀진 복숭아순나방을 포함한 다른 종들의 COI과 높은 상동성을 보였다(미보고자료).
- 본 연구는 국내 사과 심식류인 복숭아순나방과 복숭아심식나방을 구분할 수 있는 진단용 분자지표로서 총 3종의 PCR-RFLP 유전좌위 및 2종의 진단용 PCR 프라이머를 제공하고 있다. 이 이외에 보다 신속한 종 진단 검역기술로서 실시간 정량 PCR 기술이 개발되어 사과 나방류 진단용(Barcenas et al.
- , 2003). 본 연구에서는 종간변이에 자주 이용되는 COI 영역에서 두 종사이에 변이가 많이 일어나는 부위를(Fig. 1) 중심으로 종 특이적 프라이머가 제작되었다(Table 2). 이 종특이적프라이 머를 이용하여 복숭아순나방과 복숭아심식나 방을 적용하여 본 결과 서로의 종을 진단할 수 있는 분자지표로서 이용될 수 있음을 보였다(Fig.
- 이후 12, 500 X g에서 10분간 원심분리한 뒤 침점물을 받았다. 여기에 70% 에탄올(-20C)을 첨가하고 12, 500 X g로 3분 동안 원심분리 및 침전물을 건조시킨 후 50 皿의 3차증류수로 DNA를 녹여서 추출하였다.
- 증류수로 용해시켰다. 이 시료를 영역별로 서로 다른 제한 호소를 처리하는 데, 이때 COI 영역은 Dde I, CYT-B 영역은 Taq L 16S rRNA 영역은 Sait 3A로 효소의 구입처인 바이오니어 제조회사의 반응조건에 따라 37℃에서 3 시간동안 처리하였다. 제한효소 처리물은 lx TAE에서 1.
- 이를 위해 비교적 종간 변이가 뚜렷한 미토콘드리아의 영역을 대상으로 PCR-RFLP 기술과 종특이적 프라이머를 이용한 PCR 증폭기술을 개발하였다.
- 5% SDS, pH 8)에서 분쇄한 후 5 |jl의 proteinase K (최종농도 100 k回ml)를 첨가하여 50℃ 항온수조에서 10분간 반응시켰다. 이후 페놀추출을 실시하였다. 즉 깉은 부피의 phenol: chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1, v : v : v) 용액을 첨가한 뒤 12, 500 X g로 2분 동안 원심 분리하여 상등액을 취하는 과정을 2회에 거쳐 행하였다 다시 같은 부피의 chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1, v : v)을 첨가한 뒤 12, 500 X g에서 2분 동안 원심분리 후 상등액을 취하였다.
- 1 TOPO kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) 를 사용하여 클로닝벡터에 재조합시켰다. 재조합된 벡터를 (주) 마크로젠(서울)에 염기서열 분석을 의뢰하여 받은 자료를 가지고 DNAstar 프로그램(Version 5.01, DNAstar Inc., Madison, USA)을 이용하여 단일염기서열로 정리하였고 유사종과 근연관계를 알아내기 위해 NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Blast 프로그램을 이용하였다.
- 이 시료를 영역별로 서로 다른 제한 호소를 처리하는 데, 이때 COI 영역은 Dde I, CYT-B 영역은 Taq L 16S rRNA 영역은 Sait 3A로 효소의 구입처인 바이오니어 제조회사의 반응조건에 따라 37℃에서 3 시간동안 처리하였다. 제한효소 처리물은 lx TAE에서 1.2% 아가로즈젤로 분리한 후 ethidium bromide로 염색 및 UV등에서 확인하였다.
대상 데이터
- 5 成로 구성되었다. Primer와 Tag polymerase는 (주) 바이오니어(대전, 한국)로 부터 제작 圧는 구입하였다. PCR 반응조건은 초기 94℃에서 1분간 불 활성 단계를 거친 후, 35 반복으로 증폭 단계를 거쳤다.
- 유전자 분석을 위한 시료로서 경북 군위에 위치한 원예연구소 사과 시험장에서 복숭아순나 방과 복숭아 심식나 방 페로몬 트랩에 각각 포획된 수컷 성충을 이용하였다 포획된 성충의 끈끈이물질을 제거하기 위해 헥산에 침지시켰으며, 이를 다시 에탄올로 치환한 후 DNA 추출에 이용호下 였다. 날개를 제거한 각 성충을 400 讥의 추출완충용액(10 mM Tris, 0.
이론/모형
- 미토콘드리아 DNA 가운데 cytochrome oxidase-I (COI), cytochrome B (CYT-B), 16S rRNA 영역을 universal primers를 바탕(Table 1)으로 Kim et al. (1998)의 방법으로 증폭하였다. 각 PCR 시료의 구성은 다음과 같다 DNA 추출액 2 吸 dNTP 5 以 10x PCR 완충용액 5 吸 primer 각각 2 jjA (25 pmol/成), Tag polymerase 0.
- , 2002). 본 연구에서는 CYT-B가 분석되었다(Fg. 2). 이 영역에서 두 종 염기서열은 기존에 밝혀진 다른 종들의 CYT-B와 높은 상동성을 보였다(미보고자료).
성능/효과
- 예상된 위치에서 복숭아순나방은 절편을 형성하였고, 복숭아심식나방은 미절 편상태를 유지하였다. 16S rRNA 영역도 염기서열 분석을 토대로 선정된 Sau 3A가 예상된 위치에서 복숭아순나방은 절편을 보이나, 복숭아심식나방은 절편형성을 하지 못하여 뚜렷한 종 차이를 보였다. 이상의 PCR-RFLP 분자지표는 PCR 이후 제한효소 처리라는 시간을 요구하게 된다.
- 1). 두 종의 염기서열은 국내에서 채집된 두 개체를 중심으로 분석되었으며, 염기서열은 기존에 밝혀진 복숭아순나방을 포함한 다른 종들의 COI과 높은 상동성을 보였다(미보고자료). 두 종 사이에는 전체 452개 염기 가운데 67곳에서 차이를 보여 14.
- 이때 Dde I의 제한효소가 염기서열 자료를 볼 때 복숭아순나방에서는 두 곳 이상에서 제한 위치를 갖으나, 복숭아심식나방의 경우 제한위치가 없어 이상적 진단 좌위로 선발했다. 시험결과 10반복 모두 복숭아순나방은 절편을 보이나, 복숭아심식나방은 절편형성을 하지 못하여 뚜렷한 종 차이를 보였다. CYT-B는 염기서열 분석에서 차이가 나타난 Taq I을 이용하여 종간 구분을 하였다.
- 3A). 이 변이 부위는 점돌연변이로 분석하면 transition 돌연변이가 20.0%이고, transversion 돌연변이가 72.5% 그리고 세 곳에서 결실이 나타났다 자연히 제한효소의 위치와 밀도에 있어서도 차이가 있어 Sau 3A 경우 뚜렷한 제한 위치 유무로 진단용 분자지표로 개발하게 할 수 있게 했다 (Fig. 3B).
- 2). 이 영역에서 두 종 염기서열은 기존에 밝혀진 다른 종들의 CYT-B와 높은 상동성을 보였다(미보고자료). 두 종 사이에는 전체 485개 염기 가운데 72곳에서 차이를 보여 14.
- 1) 중심으로 종 특이적 프라이머가 제작되었다(Table 2). 이 종특이적프라이 머를 이용하여 복숭아순나방과 복숭아심식나 방을 적용하여 본 결과 서로의 종을 진단할 수 있는 분자지표로서 이용될 수 있음을 보였다(Fig. 5).
후속연구
- 즉, 이기 술을 이용할 경우 다시 PCR 시간 단축은 물론이고, 전기영동 하는 시간까지 단축시켜주는 기술적 진보를 이룰 수 있다. 본 연구에서 개발된 종 특이적 프라이머는 이러한 실시간 정량 PCR 진단법에도 필요에 따라 응용될 수 있다
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