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문제 정의
- 본 연구는 유사종인 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이의 분자동정법을 개발하고, 이 방법을 복숭아와 자두 과원에 발생하는 두 종의 구별에 활용하여, 신초와 과실에 따라 실제 피해를 주는 우점종이 두 기주식물에 따라 다르다는 것을 보여준다.
제안 방법
- 1.5 ml 마이크로 튜브에 들어있는 개체를 작은 모터가 달린 균질기를 이용하여 마쇄한 후, AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
- 5U)로 제작하였으며, thermal cycler (PCR Thermal Cycler Dice, TaKaRa, Japan)를 이용하여 다음과 같은 PCR 반응을 수행하였다. 94℃에서 2분간 초기 불활성화 후, 94℃에서 1분, 61℃ (복숭아순나방) 또는 65℃ (복숭아순나방붙이)에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 증폭 과정을 35회 반복하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 사슬연장 반응을 실시하였다. PCR 산물은 loading dye로 염색한 후, 2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- NCBI에 등록된 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이의 미토콘드리아 COI 유전자 서열을 각각 확보하여(GenBank accession numbers: HQ538466.1 and AB603522.1), ClustalW 방법으로 서열을 정렬하여 비교하였고, Primer3 소프트웨어(Untergrasser et al., 2012)를 이용하여 두 서열간에 차이가 나는 부위를 중심으로 두 종 각각에 대한 종 특이적 forward 및 reverse 프라이머를 설계하였다(Fig. 1). 복숭아순나방 특이적 프라이머로 GrapM428-F와 GrapM-R을, 복숭아순나방붙이 특이적 프라이머로 GrapD428-F와 GrapD-R을 ㈜바이오니아에 의뢰하여 합성하였다.
- PCR 반응액은 추출한 DNA template 1 µl, 프라이머 각각 1 µl씩, 증류수 38 µl, 10 mM dNTP 1.5 µl, 25 mM MgCl2 2 µl, 10 × PCR buffer 5 µl, Taq polymerase 0.5 µl (2.5U)로 제작하였으며, thermal cycler (PCR Thermal Cycler Dice, TaKaRa, Japan)를 이용하여 다음과 같은 PCR 반응을 수행하였다.
- 94℃에서 2분간 초기 불활성화 후, 94℃에서 1분, 61℃ (복숭아순나방) 또는 65℃ (복숭아순나방붙이)에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 증폭 과정을 35회 반복하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가 사슬연장 반응을 실시하였다. PCR 산물은 loading dye로 염색한 후, 2% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.
- 5 ml 마이크로 튜브에 들어있는 개체를 작은 모터가 달린 균질기를 이용하여 마쇄한 후, AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 두 유사종의 구별을 위해 개발한 종 특이적 프라이머 세트를 각각 따로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다(Table 1). PCR 반응액은 추출한 DNA template 1 µl, 프라이머 각각 1 µl씩, 증류수 38 µl, 10 mM dNTP 1.
- 1). 복숭아순나방 특이적 프라이머로 GrapM428-F와 GrapM-R을, 복숭아순나방붙이 특이적 프라이머로 GrapD428-F와 GrapD-R을 ㈜바이오니아에 의뢰하여 합성하였다.
- 2013년에 복숭아(화성, 수원, 음성)와 자두(화성, 수원, 김천) 과원에서 복숭아순나방류의 피해를 받은 것으로 보이는 신초와 과실을 채집하였다(Table 2). 수거해온 피해순에서 유충을 찾아내어 개체별로 마이크로 튜브에 담았고, 피해과는 25℃ 및 16L:8D 조건에 두고 성충이 우화할 때까지 기다렸다가 복숭아순나방류로 보이는 성충을 개체별로 마이크로 튜브에 담았다. 튜브에 담긴 유충 또는 성충 개체 시료는 분자동정을 위해 바로 DNA를 추출하거나, 추출할 때까지 –20℃에 보관하였다.
- 이를 위해, 본 연구에서는 (1) 두 유사종을 대상으로 유충 상태에서도 구별할 수 있는 분자동정법을 개발하였고, (2) 복숭아와 자두나무에서 복숭아순나방류의 피해를 받은 것으로 보이는 신초와 과실을 채집하여 분자동정법으로 두 유사종을 구별하였다. 이를 통하여 복숭아와 자두에서 두 종의 직접적인 가해 여부를 확인하였고, 기주에 따른 두 종의 발생 비율을 조사하여 가해 특성의 차이를 알아보았다.
- 이를 위해, 본 연구에서는 (1) 두 유사종을 대상으로 유충 상태에서도 구별할 수 있는 분자동정법을 개발하였고, (2) 복숭아와 자두나무에서 복숭아순나방류의 피해를 받은 것으로 보이는 신초와 과실을 채집하여 분자동정법으로 두 유사종을 구별하였다. 이를 통하여 복숭아와 자두에서 두 종의 직접적인 가해 여부를 확인하였고, 기주에 따른 두 종의 발생 비율을 조사하여 가해 특성의 차이를 알아보았다.
대상 데이터
- 2013년에 복숭아(화성, 수원, 음성)와 자두(화성, 수원, 김천) 과원에서 복숭아순나방류의 피해를 받은 것으로 보이는 신초와 과실을 채집하였다(Table 2). 수거해온 피해순에서 유충을 찾아내어 개체별로 마이크로 튜브에 담았고, 피해과는 25℃ 및 16L:8D 조건에 두고 성충이 우화할 때까지 기다렸다가 복숭아순나방류로 보이는 성충을 개체별로 마이크로 튜브에 담았다.
데이터처리
- 복숭아와 자두의 신초와 과실 각각에 대해 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이의 발생 차이를 확인하기 위해, 두 곤충의 발생 빈도수를 이용하여 Χ2검정을 실시하였다(SAS Institute, USA).
성능/효과
- 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이 미토콘드리아 COI 부위에 대해 종 특이적인 프라이머와 반응조건을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 두 프라이머 조합과 각각의 annealing 온도조건에서 종 특이적인 반응산물을 만들었다. 두 가지 PCR 반응산물은 모두 427 bp로 단편의 길이가 같지만, 반응조건(annealing 온도)에 따라 PCR 반응의 성공 여부가 결정되는 종 특이적인 결과를 보였다(Fig. 2).
- 복숭아와 자두에서 신초와 과실을 가해하는 복숭아순나방류를 채집하여 앞에서 개발한 분자동정법을 이용하여 두 종의 발생 비율을 각각 조사한 결과, 복숭아의 경우 신초와 과실 모두 복숭아순나방이 주로 가해하는 것으로 나타났다. 복숭아 신초에서 발견된 유충은 모두 복숭아순나방이었으며, 과실을 가해하는 것도 대부분(92.5%) 복숭아순나방이었다. 반면에, 자두의 경우 신초는 모두 복숭아순나방이 가해하는 것으로 나타났으나, 과실은 주로(97.
- 복숭아순나방과 복숭아순나방붙이 미토콘드리아 COI 부위에 대해 종 특이적인 프라이머와 반응조건을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 두 프라이머 조합과 각각의 annealing 온도조건에서 종 특이적인 반응산물을 만들었다. 두 가지 PCR 반응산물은 모두 427 bp로 단편의 길이가 같지만, 반응조건(annealing 온도)에 따라 PCR 반응의 성공 여부가 결정되는 종 특이적인 결과를 보였다(Fig.
- 복숭아와 자두에서 신초와 과실을 가해하는 복숭아순나방류를 채집하여 앞에서 개발한 분자동정법을 이용하여 두 종의 발생 비율을 각각 조사한 결과, 복숭아의 경우 신초와 과실 모두 복숭아순나방이 주로 가해하는 것으로 나타났다. 복숭아 신초에서 발견된 유충은 모두 복숭아순나방이었으며, 과실을 가해하는 것도 대부분(92.
- 자체 개발한 분자동정법을 이용하여 자두과원에서 직접 채집한 해충을 동정한 결과, 복숭아순나방붙이가 자두 과실에 직접적인 피해를 준다는 것을 확인하였다. 복숭아순나방붙이가 자두 과실을 가해한다는 것은 이미 일본에서도 알려져 있으나(Komai, 1979; Oku et al.
후속연구
- 또한, 자두나무 내에서 두 유사종이 신초와 과실을 각기 따로 가해한다는 점 또한 주지할 만한데, 같은 기주식물 내의 서로 다른 먹이자원에 따라 두 종의 공간분포가 달라지는 것이 먹이 종류의 차이에 의한 것인지, 혹은 두 종 간의 경쟁에 의한 것인지는 아직 알려진 바가 없다. 다만, 본 연구결과를 통해, 자두의 신초를 가해한 복숭아순나방 유충이 과실로 이동하지 않고 다른 신초로 옮겨가면서 발육단계를 이어가고, 반면에 과실을 가해한 복숭아순나방붙이 유충은 과실에만 머문다는 것을 간접적으로 알 수 있지만, 신초만 존재하는 봄철 생육초기에는 두 곤충이 어떻게 피해를 주는지에 대해서는 추가 조사가 필요하다.
- 또한 복숭아와 자두의 신초를 가해하는 것은 모두 복숭아순나방이라는 결과도 주지할 만한데, 사과와 배나무를 비롯한 다른 과수에서도 동일하게 적용되는 현상인지 확인해 볼 만하다. 더 나아가 두 유사종의 기주범위와 피해부위를 보다 면밀하게 조사한다면, 종 분화와 관련된 기주식물의 영향 등을 구명하는데 도움이 될 것으로 보인다.
- , 2009), 복숭아에 대한 복숭아순나방의 선호성이 매우 뚜렷하다는 것을 알 수 있다. 또한 복숭아와 자두의 신초를 가해하는 것은 모두 복숭아순나방이라는 결과도 주지할 만한데, 사과와 배나무를 비롯한 다른 과수에서도 동일하게 적용되는 현상인지 확인해 볼 만하다. 더 나아가 두 유사종의 기주범위와 피해부위를 보다 면밀하게 조사한다면, 종 분화와 관련된 기주식물의 영향 등을 구명하는데 도움이 될 것으로 보인다.
- 복숭아순나방붙이가 복숭아에서는 실제적인 피해를 거의 주지 않기 때문에, 지금까지 복숭아에서 보고된 복숭아순나방 연구결과에는 별다른 영향을 미치지 않을 것으로 보인다. 반면에, 자두에서의 복숭아순나방 연구는 국내에서 거의 이루어지지 않았기 때문에, 앞으로 두 종을 잘 구별하여 조사하면 될 것으로 보인다. 사과와 배 등에서도 두 유사종의 직접적인 피해 비율을 정확히 구명한다면, 앞으로 발생 예찰 및 발생 생태 등의 연구와 해충관리 전략수립에 도움이 될 것으로 기대된다.
- 여기에 더하여, 동일한 ND4 부위를 대상으로 제한효소 처리 단계가 필요 없이 종 특이적인 프라이머 만을 이용하는 방법도 함께 제시하였다(Jung and Kim, 2013). 본 연구 결과는 COI 부위를 대상으로 하는 분자동정법을 추가로 제시하고 있으며, 기존의 방법과 병행한다면 종 구별의 정확도를 한층 더 높일 수 있을 것으로 보인다.
- 반면에, 자두에서의 복숭아순나방 연구는 국내에서 거의 이루어지지 않았기 때문에, 앞으로 두 종을 잘 구별하여 조사하면 될 것으로 보인다. 사과와 배 등에서도 두 유사종의 직접적인 피해 비율을 정확히 구명한다면, 앞으로 발생 예찰 및 발생 생태 등의 연구와 해충관리 전략수립에 도움이 될 것으로 기대된다.
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