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문제 정의
- ABTS+ 도 항산화 활성을 알아보기 위해 수행하였다. 본 실험결과 복합해조류 추출물 발효 전, 후에 대한 비교 실험으로 그래프는 Figure 2에 나타냈으며, 또한 양성 대조군 L-ascorbic acid 500 µg/mL 94%이며, 복합해 조류 추출물 발효 전은 35%, 복합해조류 발효 후는 71%의 저해 효율을 보였다.
- 본 실험은 세계 생산량 4위인 우리나라 해조류를 이용하여 화장품 소재로서의 활용가치를 확인하기 위해 연구를 진행하였으며, 미역, 다시마, 불등가사리 등의 혼합비로 연구를 수행하였다. 또한 발효 기법을 통해 해조류의 시너지를 부여하기 위해 김치 유산균인 L.
- 본 연구에서는 미역, 다시마, 불등가사리 등의 복합 해조류 발효추출물로부터 생리활성을 연구함으로써, 화장품소재로서의 가능성과 발효기법을 통해 분리하는 해조류의 유효성분인 fucose를 HPLC 분석 방법을 통해 표준화하였다.
제안 방법
- 24 h 이후 분주한 배지를 제거하여 무첨가 배지로 교체하여 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물을 각각 농도별로 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL)로 처리하여 incubator에 24 h 배양하였다.
- ABTS 라디칼 소거능은 potassium persulfate와 반응하여 생성되는 청색을 띄는 청록색의 ABTS 라디칼이 항산화물질을 함유하고 있는 추출물과 반응하여 청록색이 연한녹색으로 변하게 되는 원리를 적용한 측정 방법이다[10]. ABTS+ 라디칼 소거작용 측정은 7 mM ABTS와 2.4 mM K2S2O8을 1 : 1로 혼합하여 암실에서 실온으로 24 h 동안 반응하였다. 반응 후 ABTS의 흡광도 값은 ± 0.
- (A) Standard and (B) seaweeds extract after fermentation. In this experiment, HPLC was performed on the fermented extract of standard fucose and mixed seaweeds, and experiment was performed repeatedly for three times.
- 6 mm, 5 µm)으로 분석을 수행하 였다. Thin layer chromatography (F254)은 Merck (USA) 에서 구입하여 실험을 수행하였으며, fucose 표준품은 미국약전 USP reference standard (USA)에서 구입하여 추출물과 비교 실험을 수행하였다.
- Thin layer chromatography (TLC), 분석 시 사용한 전개 용매는 n-BuOH : ethyl acetate : water = 4 : 1 : 1 조건으로 유효성분인 fucose를 확인하였다.
- 각질형성세포에서 hyaluronic acid 함량을 측정하였다. HaCaT cell (한국세포주은행)을 6-well plate 에 5 × 105 cells/well로 분주하여 24 h, 37 ℃, 5%, CO2조건으로 incubator에 배양하였다.
- 본 실험은 세계 생산량 4위인 우리나라 해조류를 이용하여 화장품 소재로서의 활용가치를 확인하기 위해 연구를 진행하였으며, 미역, 다시마, 불등가사리 등의 혼합비로 연구를 수행하였다. 또한 발효 기법을 통해 해조류의 시너지를 부여하기 위해 김치 유산균인 L. sakei로 발효 추출하였다. 본 연구는 미백, 항산화, 보습 및 세포 생존율에 관한 활성 실험을 수행하였으며, 양성대조군은 화장품소재로 이용되고 있는 L-ascorbic acid, 알부틴으로 비교 실험을 하였다.
- 보습 효능에 관한 실험의 경우 R2 계수 값이 낮았으며, 배지로 배출되는 HA 합성에 대한 정량한 결과로 추후 hyaluronic acid synthase (HAS) 유전자 증폭 실험을 통한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료 된다. 또한 이 결과를 토대로 해조류의 유효성분인 fu-cose를 확인하기 위해 TLC, HPLC 실험은 진행하였으며, 표준품과 비교하여 정성분석을 확인할 수 있었다. 이는 용매의 조성과 분석기기를 표준화할 수 있으며, 추후 정량 분석 또한 가능함을 보여주는 결과이다.
- 유산균 배양에 따른 조건은 MRS Broth (MB cell, Korea) 액체배지에 전지분유 1%, 해조류추출물 2%, 그리고 유산균 1%, sucrose 1% 농도로 첨가하여 28 ℃ 배양기에 72 h 동안 발효하였다. 발효 후 동결건조(Ilshin BioBae, Korea)하 여 해조류 발효추출물 건조 분말을 0.9 g의 수득률을 확인하였다.
- 24 h 이후 분주한 배지를 제거하여 무첨가 배지로 교체하여 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물을 각각 농도별로 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL)로 처리하여 incubator에 24 h 배양하였다. 배양 후 상등액은 hyaluronic acid Kit를 이용하여 ELISA reader를 통해 흡광도를 측정하였으며, hyaluronic acid 함량에 따른 검량선을 그려 함량을 계산하였다.
- 보습 활성을 측정하기 위해서 hyaluronic acid ELISA Kit (OKEH02527)를 구입하였으며, 흡광도 측정을 위해 ELISA reader (Bio tek, USA)을 이용하였고, 유효성분 분석을 위해서 HPLC는 agilent technologies (1200)와 ELSD detector alltech (3300)으로, Agilent technologies C18 column (250 × 4.6 mm, 5 µm)으로 분석을 수행하 였다.
- 복합해조류 발효추출물로부터 항산화, 미백, 보습에 관한 실험을 토대로 세포 생존율을 확인하기 위해, 마우스의 세포주인 대식세포 RAW 264.7 cell, 멜라노마 세포 B16F1 cell, 각질형성세포 HaCaT cell을 이용하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay에 대한 결과 그래프는 Figure 5에 나타내었다.
- 본 실험은 복합해조류 발효추출물의 보습 효능을 알아보기 위해 실험을 수행하였으며, 보습력은 hyaluronic acid 함량에 따른 검량선을 그려 Figure 4에 나타내었다. 복합해조류 발효추출물 500 µg/mL의 농도에서 발효 전 185%, 발효 후 200%로 발효 후의 보습함량이 증가하였고, 또한 복합해조류 발효추출물이 농도 의존적으로 증가함에 따라 보습효과를 보인다고 해석 할 수 있지만, 결정계수 값이 낮아서 이는 추후 보완할 필요성이 있을 것으로 사료된다.
- sakei로 발효 추출하였다. 본 연구는 미백, 항산화, 보습 및 세포 생존율에 관한 활성 실험을 수행하였으며, 양성대조군은 화장품소재로 이용되고 있는 L-ascorbic acid, 알부틴으로 비교 실험을 하였다. 생리활성 결과 복합해조류 발효추출물은 500 µg/mL 농도에서 항산화, 미백효과가 농도 의존적으로 증가하고 있는 것을 확인하였다.
- 세포는 100µL씩 분주하고, 각 세포마다 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물을 각각 농도별로 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL) 처리하여, 37 ℃로 유지되는 5%, CO2조건으로 24 h 배양하였다.
- 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물을 각각 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL) 제조하여 tyrosinase와 반응시킨 후, 기질 tyrosine와 37 ℃에서 20 min 동안 반응시켰다. 양성대조군 알부틴과 비교 실험을 진행하였다. 반응 후 ELISA reader에서 490 nm 흡광도를 측정하였다.
- 건조된 해조류 미역, 다시마, 불등가사리 10 : 80 : 10 비율로 혼합하여 80 ℃에서 2 h 동안 3회 걸쳐 증류수 (1L)를 이용하여 고온 중탕하여 해조류 복합 추출물을 얻었고, 추출물은 김치연구소에서 분양받은 Lactobacillus sakei (ATCC 15521) 유산균으로 발효하였다. 유산균 배양에 따른 조건은 MRS Broth (MB cell, Korea) 액체배지에 전지분유 1%, 해조류추출물 2%, 그리고 유산균 1%, sucrose 1% 농도로 첨가하여 28 ℃ 배양기에 72 h 동안 발효하였다. 발효 후 동결건조(Ilshin BioBae, Korea)하 여 해조류 발효추출물 건조 분말을 0.
- Tyrosinase의 의해 tyrosine이 dopaquinone으로 산화 되면서 멜라닌세포가 활성화 된다. 이 과정에서 미백 저해 효능을 알아보기 위해 기질인 L-DOPA를 이용한 저해 활성 실험을 진행하였다. 10 mM 의 L-DOPA기질은 potassium phosphate buffer (0.
- 실험결과 복합해조류 추출물 발효 전, 후에 대한 비교 실험을 그래프로 Figure 1에 나타내었으며, 발효 전 58% 저해 활성을 보였으며, 발효 후에는 90%의 저 해 효능을 보였으며. 이로부터 발효 후 농도 의존적으 로 저해활성이 증가하는 양상을 확인하였다. 또한 양성 대조군 L-ascorbic acid 500 µg/mL 86%, 복합해조류 발효 후는 90%의 저해 효율이 보였다.
- 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물을 각각 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL) 제조하여 tyrosinase와 반응시킨 후, 기질 tyrosine와 37 ℃에서 20 min 동안 반응시켰다.
- 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물을 각각 농도별로 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL) 제조하여 tyrosinase와 반응시킨 후, 기질 L-DOPA와 37 ℃에서 1 min 동안 반응시켰다.
- 항산화 효능을 알아보기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 본 실험은 보라색을 띄는 자유 라디칼인 DPPH 시약은 항산화 작용에 의해 라디칼이 소거되어 노란색으로 변하는 원리를 이용하여 측정하는 방법이다[9].
- 해조류의 fucoidan을 분해하여 추출되어 나오는 fucose 유효성분을 분석하기 위해 TLC, HPLC 실험을 수행하였다. TLC는 silica gel을 이용하여 표준품과 복합 해조류 발효추출물의 chromatogram을 확인하였으며, Figure 6에 나타내었다.
대상 데이터
- HaCaT cell (한국세포주은행)을 6-well plate 에 5 × 105 cells/well로 분주하여 24 h, 37 ℃, 5%, CO2조건으로 incubator에 배양하였다.
- Tyrosinase 활성 기질은 tyrosine을 사용하였다. 1.
- 건조된 해조류 미역, 다시마, 불등가사리 10 : 80 : 10 비율로 혼합하여 80 ℃에서 2 h 동안 3회 걸쳐 증류수 (1L)를 이용하여 고온 중탕하여 해조류 복합 추출물을 얻었고, 추출물은 김치연구소에서 분양받은 Lactobacillus sakei (ATCC 15521) 유산균으로 발효하였다. 유산균 배양에 따른 조건은 MRS Broth (MB cell, Korea) 액체배지에 전지분유 1%, 해조류추출물 2%, 그리고 유산균 1%, sucrose 1% 농도로 첨가하여 28 ℃ 배양기에 72 h 동안 발효하였다.
- 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 (한국세포주은행) 세포는 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomycin (P/S)을 함유한 DMEM (Gibco, USA) 배지에서 37 ℃로 유지되는 5%, CO2조건으로 배양하였다. 세포는 96-well plate에 well 당 5 × 104 cells/well의 세포주로 분주하였다.
- 마우스의 멜라노마세포주인 B16F1 (한국세포주은행) 세포는 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomycin (P/S) 을 함유한 DMEM (Gibco, USA) 배지에서 37 ℃로 유지되는 5%, CO2조건으로 배양하였다. 세포는 96-well plate에 well 당 5 × 104 cells/well의 세포주로 분주하였다.
- 본 실험을 수행하기 위한 항산화제 시약 DPPH (Sigma, USA), ABTS (Sigma, USA)에서 구입하였으며, 미백실험을 위한 시약 mushroom tyrosinase (Sigma, USA), L-tyrosine (Sigma, USA)에서 구입하였다. 보습 활성을 측정하기 위해서 hyaluronic acid ELISA Kit (OKEH02527)를 구입하였으며, 흡광도 측정을 위해 ELISA reader (Bio tek, USA)을 이용하였고, 유효성분 분석을 위해서 HPLC는 agilent technologies (1200)와 ELSD detector alltech (3300)으로, Agilent technologies C18 column (250 × 4.
- 본 연구에서 사용된 해조류 미역, 다시마, 불등가사 리는 완도산으로 구입하여 추출을 수행하였다.
- 사람의 각질형성세포주인 HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomycin (P/S)을 함유한 DMEM (Gibco, USA) 배지에서 37 ℃로 유지되는 5%, CO2조건으로 배양하였다. 세포는 96-well plate에 well 당 9 × 104 cells/well의 세포주로 분주하였다.
- 본 실험은 보라색을 띄는 자유 라디칼인 DPPH 시약은 항산화 작용에 의해 라디칼이 소거되어 노란색으로 변하는 원리를 이용하여 측정하는 방법이다[9]. 실험방법은 에탄올에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH를 제조한다. 96-well plate에 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물과 양성대조군 L-ascorbic acid (L-A)를 각각 농도별로 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL)을 100 µL와 제조한 DPPH 용액 100 µL를 암실에서 20 min 동안 반응시킨다.
이론/모형
- DPPH는 산화 방지물질로부터 전자 혹은 수소를 제공받으면 non-radical로 전환된다[11,12]. 따라서 본 실험에서는 항산화 활성 측정 방법 중 Blois의 방법을 따라 측정하였다 [13]. 실험결과 복합해조류 추출물 발효 전, 후에 대한 비교 실험을 그래프로 Figure 1에 나타내었으며, 발효 전 58% 저해 활성을 보였으며, 발효 후에는 90%의 저 해 효능을 보였으며.
- 복합해조류 발효추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay 방법을 수행하였다. 세포는 100µL씩 분주하고, 각 세포마다 측정하고자 하는 복합해조류 발효 전⋅후 추출물을 각각 농도별로 1,000, 500, 100, 50, 10 (µg/mL) 처리하여, 37 ℃로 유지되는 5%, CO2조건으로 24 h 배양하였다.
성능/효과
- 27 min으로 확인되었다. 교차 실험의 경우 RT값의 차이는 기기 차이에 따른 변화였으며, 이동상의 용매조건과 detection으로부 터 정확한 peak 분석은 가능하다는 것을 확인하였다. HPLC의 분석 결과는 Figure 7에 나타내었다
- 김치유산균 L. sakei 균주를 이용하여 발효 전과 후로 비교 실험을 진행하였으며, 추출물 농도 10, 50, 100, 500, 1,000 µg/mL로 처리 시 감소하는 경향이 보였지만, 모든 세포 주에서는 90% 이상의 세포 생존율을 확인할 수 있었다.
- 또한 복합해조류 발효추출물의 농도 500 µg/mL에서 알부틴은 72% 활성을 나타냈으며, tyrosinase activity에서는 83%, L-Dopa activity에서는 85% 저해 활성을 보였다.
- 또한 양성 대조군 L-ascorbic acid 500 µg/mL 86%, 복합해조류 발효 후는 90%의 저해 효율이 보였다.
- TLC는 silica gel을 이용하여 표준품과 복합 해조류 발효추출물의 chromatogram을 확인하였으며, Figure 6에 나타내었다. 또한, HPLC는 경기과학진흥원에 분석을 의뢰하여 교차 실험을 진행하였으며, 표준 품과 발효 후 추출물의 peak를 비교한 결과 retention time (RT)는 4.65 min으로 확인되었다. 경기과학진흥원에 의뢰한, 분석결과의 peak는 6.
- Tyrosinase 활성 억제 실험은 유용한 평가방법으로 인정되고 있다[14]. 미백효능에 관한 실험 결과 양성대조군 알부틴과 비교 실험을 진행하였으며, 복합 해조류 발효추출물이 농도 의존적으로 양성대조군 보다 월등한 저해 활성이 나타난 것을 확인하였다. 또한 복합해조류 발효추출물의 농도 500 µg/mL에서 알부틴은 72% 활성을 나타냈으며, tyrosinase activity에서는 83%, L-Dopa activity에서는 85% 저해 활성을 보였다.
- 본 실험결과 복합해조류 추출물 발효 전, 후에 대한 비교 실험으로 그래프는 Figure 2에 나타냈으며, 또한 양성 대조군 L-ascorbic acid 500 µg/mL 94%이며, 복합해 조류 추출물 발효 전은 35%, 복합해조류 발효 후는 71%의 저해 효율을 보였다.
- 생리활성 결과 복합해조류 발효추출물은 500 µg/mL 농도에서 항산화, 미백효과가 농도 의존적으로 증가하고 있는 것을 확인하였다.
- 따라서 본 실험에서는 항산화 활성 측정 방법 중 Blois의 방법을 따라 측정하였다 [13]. 실험결과 복합해조류 추출물 발효 전, 후에 대한 비교 실험을 그래프로 Figure 1에 나타내었으며, 발효 전 58% 저해 활성을 보였으며, 발효 후에는 90%의 저 해 효능을 보였으며. 이로부터 발효 후 농도 의존적으 로 저해활성이 증가하는 양상을 확인하였다.
- 이로써 발효 후 추출물이 농도 의존적으로 항산화 효능이 증가하는 양상을 나타 냈다. 이 결과가 양성대조군 보다는 저해효율이 낮지만, 발효 전보다는 효능이 월등한 것을 확인할 수 있었으며, 이는 복합해조류 발효추출물이 항산화 효능이 있는 것으로 간주할 수 있다.
- 또한 양성 대조군 L-ascorbic acid 500 µg/mL 86%, 복합해조류 발효 후는 90%의 저해 효율이 보였다. 이 결과를 토대 로 복합해조류 발효추출물이 항산화 효능이 있는 것으로 확인하였다.
- 또한 복합해조류 발효추출물의 농도 500 µg/mL에서 알부틴은 72% 활성을 나타냈으며, tyrosinase activity에서는 83%, L-Dopa activity에서는 85% 저해 활성을 보였다. 이 결과를 토대로 복합해조류 발효추출물이 알부틴을 대체할 수 있는 미백기능성 화장품 소재로서 활용될 수 있음을 확인하였다. 본 실험의 그래프는 Figure 3에 나타냈다.
- 본 실험결과 복합해조류 추출물 발효 전, 후에 대한 비교 실험으로 그래프는 Figure 2에 나타냈으며, 또한 양성 대조군 L-ascorbic acid 500 µg/mL 94%이며, 복합해 조류 추출물 발효 전은 35%, 복합해조류 발효 후는 71%의 저해 효율을 보였다. 이로써 발효 후 추출물이 농도 의존적으로 항산화 효능이 증가하는 양상을 나타 냈다. 이 결과가 양성대조군 보다는 저해효율이 낮지만, 발효 전보다는 효능이 월등한 것을 확인할 수 있었으며, 이는 복합해조류 발효추출물이 항산화 효능이 있는 것으로 간주할 수 있다.
- sakei 균주를 이용하여 발효 전과 후로 비교 실험을 진행하였으며, 추출물 농도 10, 50, 100, 500, 1,000 µg/mL로 처리 시 감소하는 경향이 보였지만, 모든 세포 주에서는 90% 이상의 세포 생존율을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 복합해조류 발효 전과 발효 후 추출물은 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과 복합해조류는 화장품 소재로의 활용성을 제안할 수 있다.
후속연구
- 모든 결과를 통해서 미역, 다시마, 불등가사리의 복 합해조류 발효추출물은 항산화, 미백 기능성 화장품 원료로서 상용화 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 생리활성 결과 복합해조류 발효추출물은 500 µg/mL 농도에서 항산화, 미백효과가 농도 의존적으로 증가하고 있는 것을 확인하였다. 보습 효능에 관한 실험의 경우 R2 계수 값이 낮았으며, 배지로 배출되는 HA 합성에 대한 정량한 결과로 추후 hyaluronic acid synthase (HAS) 유전자 증폭 실험을 통한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료 된다. 또한 이 결과를 토대로 해조류의 유효성분인 fu-cose를 확인하기 위해 TLC, HPLC 실험은 진행하였으며, 표준품과 비교하여 정성분석을 확인할 수 있었다.
- 복합해조류 발효추출물 500 µg/mL의 농도에서 발효 전 185%, 발효 후 200%로 발효 후의 보습함량이 증가하였고, 또한 복합해조류 발효추출물이 농도 의존적으로 증가함에 따라 보습효과를 보인다고 해석 할 수 있지만, 결정계수 값이 낮아서 이는 추후 보완할 필요성이 있을 것으로 사료된다.
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